TOPO原核表达载体定向克隆和表达Ⅱ型单纯疱疹病毒gG基因的免疫优势表位片段抗原

摘要

为了进一步提高检测试剂的特异性,我们构建了表达gG蛋白免疫优势表位的表达载体,通过基因工程的方法获得大量的gG片段抗原,并通过单克隆抗体和多克隆抗体初步检测了gG蛋白的免疫原性和免疫反应性,希望为制备国产的基因工程诊断试剂以及将来的大规模流行病学研究提供前期研究资料.第一章、单纯疱疹病毒Ⅱ型基因组的制备:我们首先复苏冻存的Vero细胞,传代培养获得单层贴壁细胞.在24孔微孔板的单层细胞中接种HSV-2标准株333.待细胞产生明显的细胞病变后,收获感染HSV的Vero细胞,并通过常规裂解法提取333基因组DNA.第二章、单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段引物的设计:尽管gG是两型HSV区别最大的蛋白,但两型gG仍有38%的同源性,存在产生血清交叉反应的可能性.因此,许多学者通过Phage Display和Pepscan的方法证实gG的免疫优势表位位于gG蛋白的羧基端.我们通过Primer Premier 5.0设计了扩增该片段的引物.第三章、单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段基因的体外PCR扩增:PCR方法是目前最为常用的获得基因工程外源DNA的方法之一.我们通过提取的333株DNA为模板,扩增含有几乎所有的gG免疫优势表位,长为616bp的DNA片段.长度与预测的PCR产物相符,但为了确保下游的克隆表达工作,对DNA的序列进一步测序给予证实.第四章、单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段基因的TA克隆及鉴定:TA克隆是目前较为常用的DNA克隆方法.我们经过PCR产物纯化,连接到T载体上,转化感受态DH5 α,并通过蓝白斑、PCR、内切酶酶切筛选出重组质粒,最后经测序分析证实引物的设计成功.第五章、单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段基因的TOPO定向克隆:TOPO原核表达载体利用拓扑异构酶Ⅰ的特性而有别与传统的基因工程,该方法可以简便的实现定向克隆和目的基因的高效表达.我们对纯化的PCR产物,与TOPO载体连接后,转化TOP10大肠杆菌,实现目的基因的定向克隆.第六章、单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段的诱导表达及免疫原性鉴定:Western Blot是一种常用的蛋白鉴定方法.我们通过重组子的诱导表达,经SDS裂解后获得gG片段的菌体蛋白混合物.通过SDS-PAGE电泳后,将抗gG-2蛋白的McAb和抗HSV-2抗体与目的产物发生免疫反应,结果证实基因工程表达的gG-2片段具有良好的免疫原性和免疫反应性.基因工程的方法表达重组gG-2蛋白,为实现大规模的临床研究提供了高效廉价的方法.我们利用TOPO载体成功表达了重组gG-2,与McAb和多抗显示了良好的免疫反应性,但该蛋白在临床中的应用尚需进一步纯化,并加以评价.

目录

导师组成员

实验流程示意图

缩略语

全文摘要

Executive Summary

前言

第一章单纯疱疹病毒Ⅱ型基因组的制备

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二章单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段引物的设计

引言

材料与方法

结果

参考文献

第三章单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段基因的体外PCR扩增

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四章单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段基因的TA克隆及鉴定

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第五章单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段基因的TOPO定向克隆

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第六章单纯疱疹病毒Ⅱ型gG片段的诱导表达及免疫原性鉴定

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

论文相关综述生殖器疱疹疫苗的研究进展

致谢