一株可以促进肠道中SIgA分泌的益生菌及其检测方法

摘要

一株可以促进肠道中SIgA分泌的的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分离自中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。本发明还公开了其检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一株可以促进肠道中SIgA分泌的益生菌-Lactobacillus plantarum P8。 

背景技术

健康人的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物，这些微生物称为肠道菌群，相较于过路菌群，肠道菌群大部分为长期寄居的微生物，肠道菌群数量巨大，大约为10¹⁴左右，而且是由相当固定的细菌组成，并有规律地定居于身体的一些特定部位。肠道菌群之间，肠道菌群与宿主和环境之间始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统，因而在机体防御机能正常时其对人体有益无害。正常肠道菌群有着许多重要的生理功能，如对过路菌群的拮抗作用，对宿主的免疫作用、排毒作用、抗肿瘤作用、抗衰老作用以及其他的营养作用(如糖尿病、高血压、高血脂等)，但一旦出现肠道菌群失调，势必会扰乱这些正常的生理功能。近年来应用益生菌改善肠道菌群失调已日益引起广泛关注。 

分泌性免疫球蛋白A(SIgA)是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体，又称粘膜局部抗体。它是机体粘膜防御系统的主要成分，主要由J链连接成的双聚IgA与SC(分泌片段)结合后形成的复合物，其分子量约为400kD。人的消化道尤其是肠道内，生存着大量的微生物，而且时有各种病原体会随食物进入肠腔，还存在很多未消化完的各种食物抗原，这些抗原物质一旦进入血液循环就会激活系统免疫，给机体带来潜在的危害。这就决定消化道在抵抗这些物质时必须具有一些屏障，SIgA构成的生物屏障作用在排除抗原方面发挥了重要的作用。SIgA不仅可聚集潜在和入侵的病原体使之易于通过蠕动和粘液纤毛运动将其清除，而且SIgA-免疫复合体可特异地与肠PP中的M细胞结合被转运入胰多肽(PP)内，与一定数量的PP细胞如DC、T和B淋巴细胞选择性交联，如与DC结合并被摄取，可加强没有炎性反应伴随的免疫进程；与T细胞结合的SIgA可起另一种局部免疫调节作用，导致粘膜中IL-4、IL-10和TGF-β细胞因子生成。由此可见，SIgA通过PP进入粘膜可能起很重要免疫调节作用，以保护肠道屏障的完整。目前SIgA值因检测方法的不同，悬殊甚大，而现有文献报道中对SIgA的检测技术中，Elisa技术最为快速和准确。 

益生菌(Probiotic)，源于希腊语“对生命有益”，是指定植于肠道内通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到产生确切健康功效和提高宿主健康水平的活菌制剂及其代谢产物的总称，早在上个世纪初(1907年)著名细菌学家诺贝尔奖得主梅切尼科夫即提出益生菌可以延年益寿的假说。迄今为止，科学家发现的益生菌大体上可分成三大类，其中包括乳杆菌类，双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌(如粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等)，其中乳杆菌类主要有嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌等。而作为益生菌应符合以下几个条件：应是肠道内正常菌群的正常成员；益生菌必须具有存活能力，并能进行大规模生产；在使用和贮藏期间，应保持存活状态和稳定；在肠内生态系统中能够定植并保有比较高的存活率；必须对宿主产生有益作用。近年来，关于益生菌菌株对肠道菌群影响的研究报告越来越多，新的研究手段也不断呈现，益生菌对肠道菌群的影响已经成为益生菌及相关领域的研究热点。益生菌有许多令人惊奇的功效，但这些不同的功效高度依赖于“菌株的特定性”。也就是说，通过大量和长期的临床研究证实了某个特定的益生菌株具有某种明确的功能，但并不意味着其他同种益生菌的不同菌株也必定有同样或相似的功能，基于此认识，本实验从多方面研究证实了菌株Lactobacillus plantarum P8对肠道菌群的影响，其中，通过对SIgA的测定，间接反应了Lactobacillus plantarum P8利于SIgA的分泌这一事实。 

发明内容

本发明的目的是提供一株可以促进肠道中SIgA分泌的益生菌及其检测方法。 

本发明的目的通过如下技术方案实现：一株可以促进肠道中SIgA分泌的的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillus plantarum P8）分离自中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名：植物乳杆菌，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。 

可以促进肠道中SIgA分泌的的益生菌的检测方法，其特征是包括下列步骤： 

(1)粪便样品前处理：称取1.0g粪便样品，加入9.0ml PBS(PH7.4)，用振荡器将样品充分震匀，然后离心20min左右，转速度2000-3000r/min，仔细收集上清； 

(2)、标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为24μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml)； 

(3)加样：分别设空白孔和待测样品孔，其中空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，样品最终稀释度为5倍；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀； 

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min； 

(5)配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用； 

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干； 

(7)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

(8)温育：分别设空白孔和待测样品孔，其中空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，样品最终稀释度为5倍；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀； 

(9)洗涤：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用； 

(10)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min； 

(11)终止：每孔加终止液50μl，终止反应，此时液体颜色蓝色立转黄色； 

(12)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值，测定应在加终止液后15min以内进行； 

(13)计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，并根据标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 

本发明的效果是：Lactobacillus plantarum P8分离自中国境内采集的酸马奶样本，是一株经过系统研究的益生菌。它可抑制肠道感染和减轻IBS的症状，从而起到保护作用，同时，它能分泌生物活性分子，激发免疫反应，可作为活疫苗在医学上广泛应用，由于这些特性，其已被用于发酵剂和乳制品的工业化生产。本研究以服用Lactobacillus plantarum P8后肠道中SIgA含量为研究指标，评估该益生菌对肠粘膜SIgA影响。 

本发明通过给受试者服用益生菌Lactobacillus plantarum P8片剂，应用Elisa技术对不同时期受试者肠道内SIgA的量进行了检测，Elisa结果表明：每日服用该菌株可以促进肠道上皮细胞SIgA的分泌，聚集潜在和入侵的病原体使之易于通过蠕动和粘液纤毛运动将其清除，而且SIgA-免疫复合体通过胰多肽可特异地与肠胰多肽中的M细胞结合被转运入胰多肽内，与一定数量的胰多肽细胞如DC、T和B淋巴细胞选择性交联，如与DC结合并被摄取，可加强没有炎性反应伴随的免疫进程。SIgA亦可与T细胞结合起另一种局部免疫调节作用，导致粘膜中IL-4、IL-10和TGF-β细胞因子生成进入粘膜可能起很重要免疫调节作用，从而保护了肠道屏障的完整。 

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。 

附图说明

图1为胆汁酸测定标准曲线图； 

图2益生菌Lactobacillus plantarum P8对志愿者SIgA分泌水平影响图。 

具体实施方式

一株可以促进肠道中SIgA分泌的的益生菌，所述益生菌(Lactobacillus plantarumP8)分离自中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。 

可以促进肠道中SIgA分泌的的益生菌的检测方法，其特征是包括下列步骤： 

1.试验样品的采集 

本试验共征集33名健康志愿者(具体信息见表1)，分为三组，青年组(Y group，11人，男性5人，女性6人)，年龄25-29岁，平均年龄为26.2±1.2岁；中年组(M group，12人，男性6人，女性6人)，年龄48-53岁，平均年龄为50.9±1.4；老年组(E group，10人，男性5人，女性5人)，年龄71-80 岁，平均年龄为75.1±3.3岁。男女比例为16∶17。每个志愿者每天饭后咀食Lactobacillus plantarum P8片剂3粒，每粒含Lactobacillus plantarum P8活菌2×10¹⁰CFU，连续服用28天后停止服用。分别在第0天，14天，28天，以及停止服用后7天(连续35天)、14天(连续42天)、28天(连续56天)采集志愿者粪便。样品采集后应尽快进行试验，若不能马上进行试验，可将样品放于-20℃保存，且避免反复冻融。 

表1志愿者信息 

2.粪便样品前处理：称取1.0g粪便样品，加入9.0ml PBS(PH7.4)，用振荡器将样品充分震匀，然后离心20min左右(2000-3000r/min)。仔细收集上清。 

3.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第 二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为24μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml)。 

4.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 

5.温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。 

6.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。 

7.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。 

8.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

9.温育：操作同3。 

10.洗涤：操作同5。 

11.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min. 

12.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。 

13.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。 

14.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，并根据标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 

15.结果：标准曲线图见图1。 

SIgA定量结果：通过对各个年龄段志愿者肠道内SIgA的测定结果如图2(注：“***”代表显著水平P＜0.0001)。在未服用益生菌Lactobacillus plantarum P8前，青年志愿者肠道上皮细胞分泌的SIgA＞中年志愿者＞老年志愿 者。服用Lactobacillus plantarum P8后，青年志愿者粪便中SIgA含量变化不显著。而中年志愿者和老年志愿者在服用该益生菌14天后，粪便中SIgA含量显著增加，但是随着服用该益生菌时间的增长，粪便中SIgA含量并没有继续增加，而是有所回落，最终恢复到没有服用时的水平。