贝母素乙在制备逆转胃癌多药耐药性药物的新用途

说明书

技术领域

本发明属于贝母素乙在制备逆转胃癌多药耐药性药物的技术领域，是一种贝母素乙在制备逆转胃癌多药耐药性药物的新用途。

背景技术

目前抗癌药物医疗市场的需求和药物治疗效果

随着社会城市化、工业化的加速，环境污染物和新化学物质的日益增多，加之不良生活方式和行为习惯，如生活不规律、精神紧张、焦虑、饮食不节，吸烟喝酒，脾气暴躁，运动过少等影响，肿瘤已成为危害人类生命与健康的重大疾病之一。恶性肿瘤不仅严重威胁着人类的生命健康，而且给家庭、社会、国家造成沉重的负担，干扰经济建设和社会发展。因此，抗肿瘤特效药物的研发一直受到医药及生物技术工作者的极大关注，成为生物制药研究的热点之一。

在抗肿瘤药物的发展史上，最先发现的是微生物类药物。20世纪80年代中后期是抗肿瘤微生物药物研究和发展工作颇为活跃的时期，但由于其毒副性较大，虽可采用单克隆抗体偶联靶向给药以减少毒副作用，但仍不能满足人类对更完美药物的需求。

肿瘤植物药是抗肿瘤用药的主体，占41％的市场份额，这与该类药物的毒副作用相对较小有关。中国是举世公认的天然药物大国，中国有应用中草药治病的悠久历史，所以从中草药中筛选抗癌新药具有得天独厚的优势。

在治疗癌症的过程中，其治疗方法的选择极为重要。目前主要有手术、化疗、放疗等常规的治疗方案。化疗是治疗胃癌的主要手段之一，根治术后辅助化疗可以减少复发率，提高生存率；对于晚期患者，化疗则为主要措施，部分患者可获病情缓解，延长生存期，提高生活质量，以化学治疗为主的综合治疗是当今治疗晚期胃癌的趋向。尽管近年来新的抗癌药物及化疗方案不断推出，但是化疗对胃癌的治疗效果仍无显著提高，大多数抗肿瘤药物在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织、器官不可避免地产生损害或毒性作用，毒性反应常为肿瘤化疗的限制性因素，其不良反应可长期或暂时影响患者的生活质量，既限制治疗的剂量及疗程，影响疗效，甚至导致死亡。

化疗失败就是化疗后肿瘤无变化甚至进展。我们将导致化疗失败可能的几点原因总结如下：(1)肿瘤对化疗药物具有耐药性。(2)药物选择不当，剂量过小，持续时间不足。(3)病人全身情况较差。(4)化疗过程中出现血象明显降低，严重肝、肾功能损害，使化疗中途停止。(5)病人因反应过重而擅自中止化疗，使化疗药物没有达到显效剂量。而肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)被国内外学者公认为导致化疗失败的的主要原因。因此寻找有效的逆转MDR的途径，对提高胃癌的治疗效果具有重要的临床意义。

是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时对其他结构和作用机理不同的抗肿瘤药物也产生交叉抗药性。

贝母素乙的概况

（1）贝母素乙（PMI）是提取于贝母中的一种生物碱，英文名称：Peiminine；分子式：C₂₇H₄₃NO₃;分子量：429.63522，CAS号：18059-10-4。其结构式如下：

（2）贝母素乙广泛存在于贝母类植物中。川贝母、浙贝母、伊贝母、平贝母和瓦布贝母都已被《中国药典》收录。贝母来源于百合科贝母属多种植物的鳞茎，具有清热润肺，化痰止咳之功效。贝母中的生物碱种类多，是贝母止咳、化痰作用的有效成分。贝母为多年生草本植物，叶子长形，似韭，花黄绿色，下垂像钟，其鳞茎供药用，有止咳化痰、清热散结之功，产于四川、云南、甘肃、新疆等地。贝母为名贵药材，堪称药中之宝。新中国成立后曾列为国家计划管理品种，1980年以后改为市场调节产销产品。40年来，贝母的生产有较大的发展，年产量由20世纪50年代初的40多吨发展到2000年的2000吨左右，2009年产量估算接近3000吨，产值接近9000万元，具备较大的市场供应能力及开发潜力。

（3）贝母素乙的提取与纯化方法：

贝母素乙的提取方法大致有3类，一是传统的摇床浸提法，为了提高生物碱的提取率，人们还辅助添加了微波法和超声法；二是渗漉法，可用不同浓度的盐酸进行提取；三是醇提法，常用80%-95%的甲醇或乙醇进行提取，人们还在醇提工艺前使用纤维素酶预处理，降解细胞壁中的纤维素，促进有效成分溶出，提高提取率。

常用的纯化方法有：大孔树脂纯化法和萃取纯化法两种。

发明内容

本发明提供一种贝母素乙在制备逆转胃癌多药耐药性药物的新用途。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种贝母素乙在制备逆转胃癌多药耐药性药物的新用途，该贝母素乙的分子式为C₂₇H₄₃NO₃、分子量为429.63522，其结构式如下：

本发明的有益技术效果：以贝母素乙为逆转剂，经过细胞毒性实验发现，贝母素乙与常用化疗药物VCR, ADR, CDDP, 5-Fu合用时，能够显著提高耐药细胞SGC7901/VCR对化疗药物的敏感性。这一结果提示，贝母素乙与化疗药物联合应用抑制耐药细胞增殖时，耐药细胞的增殖能力下降，耐药水平降低，化疗药物的IC₅₀值降低，对细胞的毒性作用增强。由此证明，贝母素乙不仅能抑制胃癌细胞的增殖，还具有胃癌多药耐药逆转作用。

附图说明

附图1为用贝母素乙处理后SGC7901和SGC7901/VCR细胞的生长曲线图。

附图2为贝母素乙对P-gp表达的影响图。

附图3为流式细胞仪检测贝母素乙联合5-Fu诱导SGC7901/VCR细胞凋亡图。

附图4为Western-Blot分析联合用药后caspase-3表达水平的变化图。

附图5为贝母素乙联合5-Fu诱导耐药细胞凋亡的检测图，其中，a: 5-Fu，b:PMI 20ug/ml，c:5-Fu+PMI 10ug/ml，d: 5-Fu+PMI 15ug/ml，e: 5-Fu+PMI 20ug/ml。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。

下面通过实施例对本发明作进一步描述：

实施例1，该贝母素乙在制备逆转胃癌多药耐药性药物的新用途，该贝母素乙的分子式为C₂₇H₄₃NO₃、分子量为429.63522，其结构式如下：

该贝母素乙新的医药用途：20ug/ml贝母素乙能够逆转胃癌细胞的多药耐药性，显著提高耐药细胞对常用化疗药的敏感性。贝母素乙对胃癌亲本细胞和耐药细胞具有的抑制作用，其相关实验数据如下：

（1）贝母素乙对SGC7901和SGC7901/VCR细胞的毒性测定

通过MTT比色法，检测贝母素乙对亲本细胞SGC7901和耐药细胞SGC7901/VCR生长的抑制作用。随着贝母素乙浓度的增加，两种细胞的的存活率逐渐降低。实验结果证明，贝母素乙不仅能够抑制亲本细胞的增长也能够抑制耐药细胞的增长，如图所示，贝母素乙对两种细胞系的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为76.71±3.01ug/ml和65.98±2.27ug/ml；在20ug/ml贝母素乙的作用下，耐药和亲本细胞的细胞存活率均大于90%。所以，浓度在小于20ug/ml时，我们认为贝母素乙对两种细胞无细胞毒性作用，为贝母素乙对两种细胞系的非毒性剂量。这样可以避免因细胞毒性作用或剂量过大导致的机体不能耐受。详见附图1。

（2）非毒性剂量的贝母素乙能够使耐药细胞对常用化疗药物的敏感性增强

    在目前常用的化疗药物中，我们选择长春新碱（VCR）、阿霉素（ADR）、顺铂（CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-Fu）等4种进行实验，贝母素乙与化疗药物联合用药后，耐药细胞的存活率大大降低，使化疗药物对细胞的毒性作用明显增强，以药物的半数抑制浓度（IC₅₀）为判断指标。如附表1所示：A 为单用化疗药物时的IC₅₀值， B为联合用药后的IC₅₀值，B值低于A值，说明贝母素乙能降低化疗药物的IC₅₀，使化疗药物增敏，对VCR、ADR、CDDP和5-Fu的逆转倍数分别为：16.61、6.27、6.40、7.18倍，达到逆转耐药的效果。

（3）流式细胞仪检测贝母素乙对细胞内ADR蓄积的影响

增加药物外排，降低细胞内药物的蓄积是导致多药耐药性的主要原因之一。检测细胞内ADR蓄积，反映了细胞内的药物浓度。ADR是一种具有自发红色荧光特性的抗肿瘤药物，通过流式细胞仪可检测细胞内ADR相对含量，且灵敏、准确、能定量。通过流式细胞仪检测可以看出，与5ug/ml阿霉素共培养1h后，SGC790l/ VCR细胞内ADR的平均荧光强度较SGC790l细胞减少6.02倍，加入不同浓度的PMI与ADR共培养1h后，随着贝母素乙浓度的增加细胞内的ADR荧光强度逐渐增加，较单用ADR分别增加了1.94、2.38、3.23倍，且有明显的剂量依赖性。说明贝母素乙能增加 ADR在SGC7901/VCR耐药细胞内的积蓄，减少药物外排，达到逆转耐药的效果。如附表2所示。

（4）贝母素乙能够下调SGC7901/VCR细胞P-糖蛋白（P-gp）的表达

    跨膜转运蛋白P-gp引起药物的外排及细胞内药物蓄积减少导致肿瘤细胞产生MDR，是造成治疗失败和癌症复发的主要原因之一。P-gp作为经典的耐药相关蛋白是逆转肿瘤的主要靶点，属ATP结合盒式跨膜蛋白超家族的一种。能直接与化疗药物相结合，耗能将细胞内药物逆浓度梯度转运到细胞外，减少化疗药物在细胞内的有效浓度稍弱多肿瘤细胞的杀伤作用。蛋白免疫印迹（Western Blot）实验结果显示，在内参（β-actin）确定的上样量相同时，10ug/ml和20ug/ml的贝母素乙作用于SGC7901/VCR细胞48h与对照组相比，P-gp蛋白的表达有明显下降的趋势。耐药细胞系SGC7901/VCR高表达P-gp（灰度值高），亲本细胞系SGC7901低表达P-gp（灰度值低）；非毒性剂量下的贝母素乙单用或与ADR合用均能使耐药细胞系SGC7901/VCR 的P-gp蛋白表达量下调。如附图2所示。

（5）流式细胞仪检测贝母素乙联合5-Fu诱导SGC7901/VCR细胞凋亡

降低肿瘤细胞的抗凋亡能力也是逆转肿瘤多药耐药性的另一重要途径，流式细胞仪可定量的检测总细胞数中凋亡细胞数的多少，细胞凋亡分为早期凋亡（如图Q4区）和晚期凋亡（如图Q2区）。将实验分为5组，a阴性对照组：单独使用化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu），b空白对照组：单独使用非毒性剂量贝母素乙PMI 20ug/ml，c实验组一：化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 10ug/ml  d实验组二: 化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 15ug/ml  e实验组三: 化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 20ug/ml。检测结果如图所示，在单用5-Fu 和PMI时（如图4a,4b），细胞凋亡百分率小于15%，但是5-Fu联合不同浓度贝母素乙时，细胞凋亡百分率逐渐增加（如图4c,4d,4e），分别为：17.8%、29.5%、44.5%。由此证明，贝母素乙联合5-Fu可以诱导耐药细胞凋亡，达到逆转耐药的效果。如附图3所示。

（6）Western-Blot法检测caspase-3表达变化

Caspase家族属于天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶,与细胞凋亡密切相关。Caspase-3是其家族中最重要的一员，处于细胞凋亡的共同路径上，是细胞凋亡的关键执行者之一，在细胞凋亡中起着不可替代的作用，caspase-3可以被多种因素活化，活化之后就会变成Cleaved-caspase-3 ，即后者是前者的活化形式。通过Western-Blot法检测caspase-3和Cleaved-caspase-3表达变化，将实验分为5组，a阴性对照组：单独使用化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu），b空白对照组：单独使用非毒性剂量贝母素乙PMI 20ug/ml，c实验组一：化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 10ug/ml  d实验组二: 化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 15ug/ml  e实验组三: 化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 20ug/ml。实验结果说明，联合用药后随着药物剂量的增加，caspase-3的表达量逐渐增加（如附图4所示），在大剂量诱导时，全长的caspase-3（35kd）被活化为cleaved caspase-3（17kd和19kd），由此证明，联合用药确实能够诱导细胞凋亡，其可能与激活caspase-3凋亡通路有关。

（7）细胞免疫荧光法检测cleaved caspase-3的表达变化

用Cellomics公司的Caspase 3 Activation试剂盒检测贝母素乙联合用药诱导细胞凋亡的荧光染色差异，根据试剂盒说明书进行操作，染色后在激光共聚焦显微镜下成像。Hoechst染色后，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发亮。将实验分为5组，a阴性对照组：单独使用化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu），b空白对照组：单独使用非毒性剂量贝母素乙PMI 20ug/ml，c实验组一：化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 10ug/ml  d实验组二: 化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 15ug/ml  e实验组三: 化疗药物与贝母素乙联合用药5-Fu+PMI 20ug/ml。如图所示，a、b组细胞核呈正常的蓝色，证明无细胞凋亡现象。c、d、e组细胞核固缩，颜色发亮，由此证明，联合用药可以使细胞凋亡。Cleaved caspase-3是一种在凋亡时胞浆高表达的蛋白，利用免疫荧光化学法使其带红色荧光，如附图5所示，a、b组无红色荧光亮点，证明无细胞凋亡现象。c、d、e组在对应Hoechst荧光亮点位置有红色荧光亮点，说明在发生凋亡的细胞中可检测到Cleaved caspase-3的表达。所以可以证明，联合用药确实能够诱导细胞凋亡，并且其机制与激活caspase-3、产生剪切体Cleaved caspase-3等凋亡通路有关。

综上所述，我们以贝母素乙为逆转剂，经过细胞毒性实验发现，贝母素乙与常用化疗药物VCR, ADR, CDDP, 5-Fu合用时，能够显著提高耐药细胞SGC7901/VCR对化疗药物的敏感性。这一结果提示，贝母素乙与化疗药物联合应用抑制耐药细胞增值时，耐药细胞的增值能力下降，耐药水平降低，化疗药物的IC₅₀值降低，对细胞的毒性作用增强。由此证明，贝母素乙不仅能抑制胃癌细胞的增殖，还具有胃癌多药耐药逆转作用。增加药物外排，降低细胞内的药物蓄积是导致MDR的主要原因之一。用流式细胞术直接测定细胞内ADR的平均荧光强度，贝母素乙使耐药细胞株对ADR摄取和蓄积能力大大恢复。Western Blot检测P-gp蛋白的表达发现：贝母素乙处理后耐药细胞的P-gp蛋白表达明显低于不用药组和长春新碱处理组，并且贝母素乙浓度越大，差异越明显。这证明，贝母素乙可通过调节P-gp蛋白表达，抑制药物外排来达到其逆转耐药的作用。降低肿瘤细胞的抗凋亡能力也是逆转MDR的另一重要途径。实验研究证明，贝母素乙可剂量依赖性的诱导耐药细胞凋亡。随着药物剂量的增加，细胞凋亡越明显，说明化疗药物对耐药细胞的杀伤力被显著增强，其机制与激活caspase-3、产生剪切体Cleaved caspase-3等凋亡通路有关，与BAX/bcl-2无关。在体内动物实验研究中，发现1.5mg/ ml的贝母素乙对Babl/c小鼠的是安全无毒的。