土槿皮乙酸抑制胃癌体内生长及通过Cox-2-PKC-α-P-gp通路逆转胃癌多药耐药

摘要

目的
　　化学治疗是胃癌治疗的重要手段，但多药耐药(multidrugresistance，MDR)导致的治疗效果降低成为胃癌治疗的主要难点。研究发现，介导多药耐药的主要机制与P-gp表达过多有关。在肿瘤的多药耐药细胞中，环氧合酶-2(Cox-2)和蛋白激酶C(PKC)的亚型PKC-α的表达也有所增加。
　　土槿皮乙酸(PseudolaricacidB，PAB)是松科植物金钱松的近根树皮或根皮中提取出来的一种二萜类酸，具有诱导多种肿瘤细胞生长抑制、细胞周期阻滞及细胞凋亡的活性，而且能逆转肝癌QGY-TR50细胞株的多药耐药。我们的前期研究发现，PAB对人胃腺癌SGC7901细胞系及SGC7901/ADR细胞系具有明显的体外抑制作用。但目前对于PAB的体内抗肿瘤疗效研究较少，而且其抑制肿瘤多药耐药的机制尚不清楚。本研究将探讨PAB对胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其逆转胃癌多药耐药的分子机制。
　　方法
　　1、细胞培养
　　常规培养人胃癌SGC7901细胞及人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞，SGC7901/ADR细胞的培养基中加入1μg/ml阿霉素(ADR)维持其耐药性。
　　2、人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立
　　将50只裸鼠随机分为两组，每组25只，分别于裸鼠腋下接种两种细胞的单细胞悬液，建立胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，每组再随机分为生理盐水对照组、吐温对照组、阿霉素组、土墐皮乙酸组及阿霉素和土墐皮乙酸联合给药组5个亚组，每亚组5只裸鼠，每天一次分别腹腔给予相应的药物注射治疗，连续给药20天。
　　3、人胃癌裸鼠皮下移植瘤体积和重量的测量与计算
　　每日测量裸鼠体重，隔日观察移植瘤并用游标卡尺测量瘤体的长径、短径。分别计算各组中每只裸鼠的肿瘤体积、相对肿瘤体积、相对体重及药物的平均抑瘤率。PAB和(或)ADR的治疗效果通过移植瘤的大小和重量评价，以裸鼠体重变化评价药物对裸鼠体重的影响。
　　4、免疫组织化学法检测Cox-2、PKC-α及P-gp的表达
　　分别取各组肿瘤组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋，4μm切片，以免疫组化SP法方法检测Cox-2、PKC-α及P-gp的表达，显微镜下观察染色的效果，显微镜下(×400)摄片。
　　5、Westernblot法检测Cox-2、PKC-α及P-gp的表达
　　分别提取生理盐水对照组、吐温对照组、阿霉素组、土墐皮乙酸组及阿霉素和土墐皮乙酸联合给药组肿瘤组织的蛋白，以Westernblot法检测Cox-2、PKC-α及P-gp的表达。
　　6、统计学处理
　　本实验所有数据用均数±标准差表示，利用SPSS17.0分析软件，采用ANOVE方差分析法中SNK和LSD法进行差异性分析，P＜0.05提示有统计学意义。
　　结果
　　1、土墐皮乙酸对胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用
　　裸鼠体内实验表明，对于SGC7901细胞移植瘤，各治疗组肿瘤体积均小于对照组(P＜0.05)，PAB组与ADR组无显著性差异(P＞0.05)，联合给药组较各组抑瘤作用增强(P＜0.05)，抑瘤率为88.1％;对于SGC7901/ADR细胞移植瘤，ADR组、PAB组、联合给药组抑瘤效果依次增强(P＜0.05)，抑瘤率分别为:21.9％、64.1％、85.8％。
　　2、免疫组织化学法检测Cox-2、PKC-α及P-gp的表达
　　SGC7901/ADR细胞移植瘤对照组瘤组织中Cox-2、PKC-α、P-gp蛋白呈高表达，PAB组蛋白阳性表达低于ADR组(P＜0.05)，联合给药组中三种蛋白的阳性表达低于其余各组(P＜0.05)。在NS对照组中，SGC7901细胞移植瘤的蛋白表达低于SGC7901/ADR细胞移植瘤(P＜0.05)。
　　3、Westernblot法分析Cox-2、PKC-α、P-gp的表达
　　对于盐水对照组，胃癌敏感细胞移植瘤中三种蛋白的表达水平均低于耐药细胞移植瘤(P＜0.05);SGC7901/ADR细胞移植瘤中，盐水对照组与吐温对照组间蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)，Cox-2、PKC-α、P-gp三种蛋白的表达水平在对照组、阿霉素组、土墐皮乙酸组及联合用药组中均依次下调(P＜0.05)。
　　结论
　　1、PAB对胃癌的生长具有显著的体内抑制作用。
　　2、PAB与传统的化疗药物ADR联合应用对胃癌生长的抑制作用较单独用药显著。
　　3、PAB可能通过抑制Cox-2—PKC-α—P-gp/mdr1信号通路逆转胃癌的多药耐药。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

一、材料

二、方法

结果

一、土瑾皮乙酸对胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

二、光镜观察及免疫组化染色结果

三、Western blot法分析PAB对裸鼠皮下移植瘤Cox-2、PKC-α、P-gp表达的影响

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 土槿皮乙酸的抗肿瘤作用及其分子机制

致谢

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