用于组织修复和生物人造组织工程的细胞片及其制备方法

摘要

公开了用于组织修复和生物人造组织工程的细胞片。所述细胞片包含处理的干细胞，所述干细胞被包埋其自分泌的细胞外基质(ECM)中并形成细胞片。所述细胞片通过以下过程形成：分离干细胞，扩增干细胞，并用生物因子或导致生物因子产生的因子处理干细胞，从而在体外诱导干细胞分化、产生细胞外基质并形成细胞片。所述细胞片被用作促进组织修复的生物活性材料或无细胞材料，或用于形成用于组织置换的生物人造器官。本发明的细胞片无需使用支架递送细胞。所述细胞片促进体内细胞移植并提供一定的张力机械强度，用于承受组织修复过程中的早期机械负荷。

说明书

发明领域

本发明涉及细胞片和制备所述细胞片的方法，以及使用所述细胞片 促进组织修复和生物人造组织工程的方法。

发明背景

肌肉骨骼病和结缔组织病对社会造成破坏性影响。它们是严重的慢 性长期疼痛和体力活动能力丧失的最常见原因，影响所有年龄段的人并 给社会带来巨大费用负担。每3位50岁以上的妇女中就有一位患有骨质 疏松引起的骨折。每年全世界有两千三百万至三千四百万人在道路交通 事故中受伤。背部疼痛是职业病假的第二大原因。高达80％的人在一生 中患有背部疼痛。骨关节炎在世界范围内影响超过一亿三千五百万人。 骨关节炎是女性健康问题的第4大常见原因，男性健康问题的第8大常 见原因。全世界每年发生约3千万肌腱和韧带损伤(Maffulli et al.，Clin  Sports Med 2003；22：675-692)。在世界范围内，慢性肌腱病占所有运动相 关损伤的30-50％，并且几乎占所有职业病的一半。

皮肤疾病、肌肉骨骼系统疾病和结缔组织疾病是住院的主要原因。 在美国，每年进行约2×10⁵次肌腱和韧带修复(Pennisi.Science 2002；295： 1011)。前交叉韧带(ACL)重建在整形外科常进行的手术中排名第6 (Garrett et al.，J Bone Joint Surg Am 2006；88：660-667)，并且在运动医学手 术中排名第1。

损伤后的组织修复非常缓慢且效率低下。例如，在损伤后，肌腱并 非通过再生过程愈合而是通过形成机械强度降低的纤维化瘢痕而愈合， 这会导致明显的功能障碍和能力丧失。肌腱和骨的手术复位经常失败， 并且由于缺少填补再生而对腱骨愈合的造成困难。据报道，肩袖修复术 的失败率为20％-94％。同样，ACL在损伤后不会自然愈合。ACL重建需 要将肌腱移植物置于骨隧道内，根据所用评价标准的不同，ACL重建的 失败率为10％-25％。在老年个体中，骨质疏松的骨的骨折后愈合能力下 降。目前，骨关节炎无法治愈。热损伤或外科手术损伤后继发形成的皮 肤增生性瘢痕导致受累组织的瘢痕挛缩和功能受限、儿童生长受限和外 观容貌问题。

因此，急性和慢性组织损伤都难以治疗，并且能导致长期的功能性 残疾和疼痛，这给健康护理系统带来长期负担。

通常对组织损伤进行保守治疗或外科手术治疗。例如，类固醇注射 以及诸如低强度脉冲超声、震荡波和理疗的物理方法是肌腱/韧带损伤的 常用保守治疗。这些治疗的效果有时仅是缓解性的，且治疗时间通常较 长。如果保守治疗失败，则需要进行外科手术来修复受损组织。如果损 伤非常严重，则可能需要自体移植物、同种异体移植物、异种移植物和 假体装置来修复或置换受损的组织，但已经证明这些方法的成功是有限 的。这些方法都具有一些不可避免的缺点，例如供体部分患病、疾病传 播和组织排斥风险以及长期功能/耐久性有限。因此，组织工程作为治疗 组织损伤的潜在策略，其受到的关注日益增加。

组织工程曾经列为生物材料下的学科，但是近些年来，其范围和重 要性已得到提升，现在组织工程自身已成为专科领域。组织工程被定义 为使用细胞、生物材料和合适的生物化学和/或物理化学因子的组合来修 复或置换生物组织。使用组织工程方法研发临床用途的功能性置换组织 具有促进组织修复、改善组织功能全部恢复的愈合质量以及减少组织再 损伤的潜力。

细胞和支架是组织工程的两个最基本的组成部分。在可用于组织工 程的不同细胞来源中，通常使用来源于骨髓的间充质干细胞(MSC) (BMSC)(Chong et al.，J Bone Joint Surg Am 2007；89：74-81；Hankemeier et  al.，Arch Orthop Trauma Surg 2007；127(9)：815-821)，这是因为这些细胞保 持了一定程度的自我更新潜能并能分化成多种间充质谱系细胞。这些细 胞的合成和增殖能力也非常强(Liu et al.，Biomaterials 2008；29：1443-1453； Ge et al.，Cell Transplant 2005；14：573-583)。尽管这些发现很鼓舞人心， 但是MSC也可能不向目标组织类型分化或可能诱导肿瘤形成。例如，据 报道，将BMSC移植到兔肌腱缺损中会在构建体中形成异位骨并表达碱 性磷酸酶活性(Awad et al.，J Orthop Res 2003；21：420-431；Harris et al.，J  Orthop Res 2004；22：998-1003)。据报道，在某些特定环境下，未分化的 BMSC会诱导肿瘤(Tasso et al.，Carcinogenesis 2009；30(1)：150-157)。在移 植前，使干细胞体外分化为组织特异性谱系可能是促进组织愈合同时最 小化错误细胞分化和肿瘤诱导几率的良好策略。然而，控制MSC分化成 目标祖细胞的方法仍然是巨大的挑战，这阻碍了MSC的应用。

尽管分离自不同组织的干细胞共有许多重要的干细胞特征，但是干 细胞的某些特性受到它们来源的影响(Sakaguchi et al.，Arthritis Rheum 2005；52：2521-2529)。选择合适的细胞来源对于成功的组织工程是重要 的。最近，已经在肌腱中分离到干细胞(Bi et al.，Nat Med 2007；13(10) 1219-1227)。本发明人首次报道了从大鼠中分离并表征肌腱来源的干细胞 (TDSC)(Rui et al.，Tissue Eng Part A 2010；16(5)：1549-1558。肌腱干细胞 为修复损伤的组织和生物人造组织工程提供了新的机遇。

如上文所述，在移植之前，使MSC体外分化为组织特异性祖细胞是 避免错误的细胞分化和肿瘤形成问题同时促进组织再生的可能方法。据 报道，不同的因素对细胞分化具有影响，所述因素包括生长因子、机械 刺激、生物材料的组成和解剖学位置因素、与组织特异性细胞类型的共 培养以及基因修饰。因此，它们可能适合于使MSC体外分化为组织特异 性祖细胞。

用作组织修复支架的生物材料的组成和特性可以显著地影响新组织 的再生。用于组织工程的支架材料有不同类型：聚酯、多糖和胶原蛋白 衍生物以及磷酸钙衍生物。

诸如聚乙酸醇(PGA)、聚乳酸(PLA)和它们的共聚物聚乳酸-共-乙醇 酸(PLGA)的合成支架已经用于骨和肌腱的组织工程。它们受到关注是因 为它们的降解产物乙醇酸和乳酸是天然代谢物，并且它们具有良好的机 械特性以及突出的可加工性。由于它们是由化合物制备而来的，因此， 它们允许更好地控制化学和物理特性以及由此能更好地控制质量。然而， 这些合成支架的生物相容性非常差，因为它们不支持高水平的细胞粘附 (Zhu et al.，J Biomed Mater Res 2002；62：532-539)，并且天然代谢物在高浓 度时是酸性的，这可以导致局部炎性反应。

另一方面，生物支架是高度生物相容的，并且也表现出优越的生物 功能性，所述生物支架例如相对纯的天然胶原蛋白衍生物以及具有多种 天然大分子的复合脱细胞化细胞外基质材料，例如小肠粘膜下层(SIS) (Dejardin et al.，Am J Sports Med 2001；29：175-184)和丝(Altman et al.， Biomaterials 2002；23(20)：4131-4141)。但是这些生物支架的局限性是机械 特性较差(Gentleman et al.，Bioamterials 2003；24：3805-3813)，并且可加工 性也有限(Gentleman et al.，Bioamterials 2003；24：3805-3813)。批次与批次 间的差异较大也使得难以可靠地生产这些支架(Koski et al.，Orthop Clin  Nort Am 2000；31：437-452)。它们可以引起炎性反应、移植排斥(Koski et  al.，Orthop Clin Nort Am 2000；31：437-452)，并且具有传播疾病的风险 (Chen et al.，Stem Cells 2009；27(6)：1276-1287)。

诸如羟基磷灰石和磷酸三钙(TCP)的磷酸钙衍生物通常用作骨再生 的支架材料。这些材料通常需要较长的降解时间。

因此，需要开发合适的细胞类型和支架材料来促进组织修复或用于 置换受损组织的生物人造组织工程。

发明概述

本发明一方面涉及用于促进组织修复和生物人造组织工程的来源于 干细胞的细胞片。

在一个实施方案中，本文所公开的细胞片包含处理的干细胞和所述 干细胞自分泌的细胞外基质，其中所述干细胞被包埋在所述细胞外基质 中。

在另一个实施方案中，本文所公开的细胞片包含约50-95％w/w的水， 因此细胞片的干重为所述细胞片总重量的约5-50％w/w。细胞片可以包 含选自以下的化合物：胶原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白或以上的任意组合。 在优选的实施方案中，胶原蛋白选自I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III 型胶原蛋白或以上的任意组合。在另一优选的实施方案中，蛋白聚糖选 自聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、二聚糖或以上的任意组合。在另一优 选的实施方案中，糖蛋白选自弹性蛋白、软骨寡聚基质蛋白(COMP)、腱 生蛋白C或以上的任意组合。

在另一个实施方案中，细胞片不含细胞，即细胞片的无细胞产物。 不含细胞的细胞片或无细胞片的组成或结构与本文所公开的细胞片相 同，但是不含细胞。无细胞片可以单独用于或与其它细胞类型或生长因 子联合用于促进组织修复或组织工程应用。

在另一个实施方案中，本发明所用的干细胞是成体干细胞。诸如成 体干细胞的干细胞可以分离自动物组织或人类组织。用于制备细胞片的 干细胞是自体的或同种异体的。在本发明的实施方案中，干细胞分离自 肌腱/韧带组织、骨髓、脂肪组织、牙髓或以上的任意组合，但不限于此。 在本发明的一个实施方案中，对细胞片进行化学、生物学、遗传学、生 物机械和/或生物物理学方面的修饰和/添加，从而使得所作的修饰能调节 细胞或细胞片的程度和活性。干细胞(例如肌腱来源的干细胞(TDSC))增 殖快速，表现出高的集落形成能力，展示出高的骨形成、软骨形成、脂 肪形成以及肌腱形成的分化潜力，并产生高水平的ECM，同时具有缩短 临床应用的体外细胞培养时间的优势。

在其它实施方案中，通过包括以下步骤的方法形成本文所公开的细 胞片：分离干细胞，扩增干细胞，并用生物因子或导致处理的干细胞产 生生物因子和/或导致细胞片成熟的因子处理干细胞，由此在体外诱导干 细胞分化、产生它们自身的细胞外基质并形成细胞片。

在一个实施方案中，生物因子是由氨基酸组成的、调节干细胞生物 活性的蛋白。诱导细胞片形成的生物因子的一个实例属于转化生长因子 家族(TGF)(例如TGF-β)和抗坏血酸。生物因子的另一实例属于生长分化 因子/骨形态发生蛋白(GDF/BMP)家族成员(例如GDF-5/BMP-14、 GDF-6/BMP-13和GDF-7/BMP-12)和抗坏血酸。生物因子的另一实例是 结缔组织生长因子(CTGF)和抗坏血酸。

在另一个实施方案中，可以另外用化学试剂诱导干细胞产生所述生 物因子和其它生物因子。在另一个实施方案中，通过基因修饰使干细胞 能过表达本文所公开的生物因子或其它生物因子。在可选的实施方案中， 利用生物物理学方法刺激诱导所述生物因子或其它生物因子。在形成软 骨的另一可选的实施方案中，除了生物和化学因子以外，还使用压缩作 为机械力来刺激软骨的形成。在骨愈合的另一可选的实施方案中，向细 胞施加拉力负荷，以辅助骨或肌腱或韧带的愈合。

本发明的另一方面是本文所公开的细胞片作为促进组织修复的生物 活性材料的用途。细胞片任选地与生物材料、化学因子、生物因子、遗 传因子、生物机械因子、生物物理因子在体外成熟和/或在动物中、优选 诸如裸鼠的免疫缺陷动物、或在与细胞片是自体同源的动物中的体内成 熟形成了用于组织修复的生物人造材料。在一个实施方案中，将具有活 性干细胞的本发明的细胞片用于增强前交叉韧带(ACL)重建中移除髌骨- 髌腱-骨移植物后的髌腱中窗样损伤的修复，其中将细胞片卷起并缝合在 窗样缺损中。在另一个实施方案中，通过使细胞片包裹破裂位点，将细 胞片用于增强肌腱(例如跟腱、手部肌腱)和韧带(如后交叉韧带PCL；ACL) 的缝合修复。与其它课题组利用骨膜自体移植物相似(Ohtera et al.，Crit  Rev Biomed Eng 2000；28(1-2)：115-118；Youn et al.，Clin Orthop Relat Res 2004；419：223-231；Chen et al.，J Orthop Surg Taiwan 2003；20：21-29)，通 过用细胞片包裹肌腱移植物，可以将细胞片用于在ACL重建中促进腱骨 连接再生。在另一个实施方案中，通过将细胞片缝合于肌腱和骨之间的 界面，而将所述细胞片用于肩袖修复。在另一个实施方案中，通过将细 胞片置于缺损处，将所述细胞片用于修复诸如骨折的骨疾病状态或疾病、 诸如骨关节炎或骨软骨缺损的软骨疾病状态或疾病、诸如肌肉撕裂的肌 肉疾病状态或疾病、诸如创伤或烧伤的皮肤疾病状态或疾病。

本发明的另一方面是单独使用细胞片的无细胞产物或联合使用所述 无细胞产物与其它细胞类型或生长因子来促进组织修复。在脱细胞化后， 将细胞片与上文所述相似地用作组织工程应用的无细胞生物材料。无细 胞产物被用于防止修复缺口形成或修复失败、增强宿主细胞粘附、渗透 和增殖。可以以脱细胞化产物的形式使用本文所公开的细胞片，并且与 其它已知的生长因子和细胞类型一起用于促进组织修复。

本发明的另一方面是本文所公开的细胞片在形成用于组织置换的生 物人造器官中的用途。细胞片与生物材料、化学因子、生物因子、遗传 因子、生物机械因子、生物物理因子在体外成熟和/或在动物中、优选诸 如裸鼠的免疫缺陷动物中、或在与细胞片是自体同源的动物中的体内成 熟形成了用于组织置换的生物人造器官。在一个实施方案中，在体外卷 起细胞片并加载于U形弹性针、随后在裸鼠模型中进一步生长后，形成 肌腱样组织/韧带样组织。体外培养步骤的其它改动可以进一步改善生物 人造器官工程的组织结构，所述改动例如施加体外机械负荷或联合应用 体外机械负荷与其它生物材料或生长因子。

结合附图阅读下文的详细描述后，本发明的其它目的和优势将会显 而易见。

附图简要说明

下文所述附图仅意图用于说明目的，并非意图限制本发明的范围。

图1(A和B)显示了第10天时从绿色荧光蛋白(GFP)大鼠中分离的配 对的大鼠TDSC(TDSC)和大鼠BMSC(BMSC)的集落形成能力的比较(10 cm²皿中100个细胞)(n＝5)。图1(C)显示了利用BrdU分析测定的配对的 大鼠TDSC和大鼠BMSC在第2天时的增殖能力(n＝12)。*p≤0.050。

与大鼠BMSC相比，大鼠TDSC形成更多的集落(p＝0.010)(图1A、 1B)，并且增殖更快(p＜0.001)(图1C)。

图2(A-H)显示了基础完全培养基中从GFP大鼠分离的配对的大鼠 TDSC和大鼠BMSC中(A)腱调蛋白(Tnmd)、(B)scleraxis(Scx)、(C)I型 胶原蛋白α1(Col1A1)(D)III型胶原蛋白α1(Col3A1)(E)Col1A1/Col3A1 的比、(F)核心蛋白聚糖(Dcn)、(G)腱生蛋白(Tnc)、(H)碱性磷酸酶(Alpl)、 (I)II型胶原蛋白α1(Col2A1)、(J)聚集蛋白聚糖(Acan)和(K)二聚糖(Bgn) 的mRNA表达。*p≤0.050。

与基础完全培养基中配对的大鼠BMSC相比，大鼠TDSC表达的肌 腱形成标志物(Tnmd、Scx、Col1A1、Dcn、Bgn)、软骨形成标志物(Col2A1) 以及骨形成标志物(ALP)的mRNA水平更高(所有的p＝0.050)。发现了这 样的趋势：与BMSC相比，TDSC中Col3A1的mRNA表达较低并且Tnc 和Acan的表达较高，但是这些差异无统计学显著性。

图3(A-D)显示了从GFP大鼠分离的大鼠BMSC(A、C)和大鼠 TDSC(B、D)在基础培养基(A、B)或骨形成诱导培养基(C、D)培养21天 后的钙结节的茜素红S染色。放大率：100倍。比例尺＝100μm。图3(E) 显示了与钙结节结合的茜素红S染色的定量分析。图3(F-J)显示了在基础 培养基或骨形成培养基培养21天的配对的大鼠TDSC和大鼠BMSC中(F) Alpl、(G)Runx2、(H)Bmp2、(I)Spp1和(J)Bglap的mRNA表达。*p≤0.050。

在骨形成诱导之后，大鼠TDSC中形成的钙结节多于大鼠BMSC中 形成的钙结节。在第21天时，基础培养基中大鼠TDSC的Alpl、Runx2、 Bmp2和Bglap的表达显著高于大鼠BMSC(所有p＝0.004)。在骨形成诱 导第21天时，大鼠TDSC中Alpl(p＝0.006)、Runx2(p＝0.006)、Bmp2 (p＝0.011)、Spp1(p＝0.006)和Bglap(p＝0.006)的表达显著高于大鼠BMSC。

图4(A-D)显示了从GFP大鼠分离的配对的大鼠TDSC(A、B)和大鼠 BMSC(C、D)在软骨形成诱导14天(A、C)和21天(B、D)后的软骨细胞 表型(箭头)的存在。染色：苏木精和伊红；放大率：200倍；插图放大率： 400倍。图4(E-H)显示了从GFP大鼠分离的配对的大鼠TDSC(E、F)和 大鼠BMSC(G、H)在软骨形成诱导14天(E、G)和21天(F、H)后的粘多 糖沉积。染色：阿尔新蓝；放大率：200倍；插图放大率：400倍。图4(I-K) 显示了基础培养基或软骨形成培养基中的从GFP大鼠分离的配对的大鼠 TDSC和大鼠BMSC在第0天、第7天、第14天和第21天时的(I)Col2A1、 (J)Acan、(K)Sox9的mRNA表达比。*p≤0.050。

在第14天和第21天时，在由大鼠TDSC形成的细胞团中观察到更 多类似软骨细胞的细胞。在第14天和第21天时，由大鼠TDSC形成的 细胞团中的粘多糖沉积多于由大鼠BMSC形成的细胞团的粘多糖沉积。 软骨形成诱导后，大鼠TDSC中Col2A1和Acan的表达比显著高于大鼠 BMSC，而对于Sox9的表达比则未观察到该现象。

图5(A-D)显示了从GFP大鼠分离的配对的大鼠BMSC(A、C)和大鼠 TDSC(B、D)在基础培养基(A、B)或脂肪形成培养基(C、D)培养21天后 的油滴的油红O染色。放大率：100倍。比例尺＝100μm。图5(E-F)显 示了从GFP大鼠分离的配对的大鼠TDSC和大鼠BMSC在基础培养基或 脂肪形成培养基培养21天后的(E)PPARγ2and(F)C/EBPα的mRNA表 达。*p≤0.050。

脂肪形成诱导21天后，大鼠TDSC中形成的油滴多于大鼠BMSC。 脂肪形成诱导后，大鼠TDSC中PPARγ2(p＝0.006)的表达显著高于大鼠 BMSC，，但是对于C/EBPα(p＝0.262)则未观察到该现象。

图6显示了从GFP大鼠分离的配对的大鼠TDSC和大鼠BMSC在肌 腱形成诱导后的肌腱相关标志物的mRNA表达。(A)腱调蛋白(Tnmd)、 (B)I型胶原蛋白α1(Col1A1)(C)scleraxis(Scx)和(D)腱生蛋白C(Tnc)。 *p≤0.050。

在基础培养基中以及诱导后，大鼠TDSC中Tnmd(p＝0.004)和Col1A1 (p＝0.004)的表达高于大鼠BMSC，而对Scx(p＝0.423)和Tnc(p＝0.150)则没 有观察到该现象。

图7显示了分别由从GFP大鼠分离的TDSC和从腘腱分离的人TDSC 经过CTGF和抗坏血酸处理后形成的大鼠TDSC片(A)和人TDSC片(B) 的总体视图。用CTGF和抗坏血酸分别处理大鼠TDSC和人TDSC 2周 和4周后，产生丰富的细胞外基质，并形成细胞片。TDSC片不易被胰蛋 白酶消化。

图8(A-B、A’-B’)显示了从GFP大鼠分离的大鼠TDSC(A、A’)和大 鼠BMSC(B、B’)经过CTGF和抗坏血酸处理后所形成的细胞片的组织学。 细胞性高。干细胞是圆形的，并且随机定向于细胞外基质中。与大鼠 BMSC(B)相比，大鼠TDSC(A)中产生更多的细胞外基质。偏光显微镜显 微检查也证实，胶原蛋白原纤维是细的且随机定向。与大鼠BMSC(B’) 相比，在大鼠TDSC(A’)中观察到更多纵向排列的原纤维。染色：苏木精 和伊红；放大率：100倍。比例尺＝100μm。

图9(A-C)显示了在卷起由从GFP大鼠分离的经过处理的大鼠TDSC 形成的细胞片并将其加载到U形弹性针上后，形成了生物人造肌腱和韧 带。图9(D)展示了用于比较的完整的大鼠屈肌腱。

图10显示了用CTGF和抗坏血酸处理细胞来诱导细胞片形成之后， 从GFP大鼠分离的大鼠TDSC中肌腱相关标志物的mRNA表达。(A) scleraxis(Scx)、(B)腱调蛋白(Tnmd)、(C)I型胶原蛋白α1(Col1A1)和(D)腱 生蛋白C(Tnc)。*p≤0.050。

处理后，大鼠TDSC中Tnmd(p＝0.004)、Scx(p＝0.010)和Col1A1 (p＝0.004)的表达增加。大鼠TDSC中Tnc的表达增加在统计学上不显著 (p＝0.078)。

图11显示了细胞片中从GFP大鼠分离的配对的大鼠TDSC和大鼠 BMSC的软骨相关标志物(Col2A1、Acan)和骨相关标志物(Bglap)的mRNA 表达。形成细胞片后，大鼠TDSC和大鼠BMSC中Col2A1(A)(分别为 p＝0.004和p＝0.037)和Bglap(C)(分别为p＝0.018和p＝0.025)的表达降低。 形成细胞片后，大鼠TDSC中Acan(B)的表达降低(p＝0.004)，而大鼠 BMSC中Acan(B)的表达不降低(p＝0.873)。然而，形成细胞片后，大鼠 TDSC中Col2A1(p＝0.004)、Acan(p＝0.004)和Bglap(p＝0.006)的表达仍高 于大鼠BMSC。*p≤0.050。

图12显示了分别利用Sirius Red F3BA染色分析和Fast Green FCF染 色分析，由从GFP大鼠分离的大鼠TDSC经过CTGF和抗坏血酸处理来 诱导细胞片形成之后而产生的胶原蛋白酶(A-E)和非胶原蛋白(F-J)。未处 理的TDSC：(A、C、F、H)：处理的TDSC：(B、G、D、I)；放大率： (C、D、H、I)：100倍；

图12(E)和(J)分别显示了处理的和未处理的TDSC中Sirius Red  F3BA和Fast Green FCF染色的吸光度。*p≤0.050。

细胞片的细胞中产生的胶原蛋白(p＝0.004)和非胶原蛋白(p＝0.006)的 表达更高。

图13显示了从腘腱分离的人TDSC在经过CTGF和抗坏血酸处理4 周来诱导细胞片形成之后的(A)水含量、(B)硫酸化粘多糖(sGAG)、以 及乙酸-胃蛋白酶可溶部分的(C)总胶原蛋白、(D)I型胶原蛋白和(E)III 型胶原蛋白。人的腘腱作为参照。

人TDSC片含有90.2±1.4％的水和18.0±1.6％的sGAG(干重)。乙酸- 胃蛋白酶可溶部分含有4.5±4.0％(干重)的总胶原蛋白，其中主要是I型胶 原蛋白(5.4±4.8％干重)。仅有少量的III型胶原蛋白(8E-05±2.5E-05％干 重)，并且II型胶原蛋白的水平低于ELISA试剂盒的2ng/ml的检测限(结 果未示出)。

图14(D)显示了在扫描电镜下观察到的，由经过CTGF和抗坏血酸 处理4周来形成细胞片之后得到的人TDSC合成胶原蛋白原纤维并将其 分泌到细胞外间隙(箭头)。胶原蛋白原纤维是有组织的(E-F)。图14(A-C) 显示了作为参照的人的腘腱中胶原蛋白原纤维的组织性。比例尺：10μm (A、D)；1μm(B、C、E、F)。(D)中的方块显示在(F)中。图14(G)显示 了通过图像分析软件测量的人的腘腱和人TDSC片中胶原蛋白原纤维的 直径。

与人的腘腱中胶原蛋白原纤维相比，人TDSC片中的胶原蛋白原纤 维较小并且组织较差。在处理的人TDSC中，胶原蛋白原纤维在细胞内 产生并被分泌到细胞外间隙(箭头)。在某些胶原蛋白化的区域，细胞边界 变得模糊(箭头)。与人的腘腱相似，人TDSC片中的胶原蛋白原纤维为单 峰分布。人TDSC片中的原纤维大小为86.1±25.1nm(范围：50nm-200nm) 而人的腘腱中的原纤维大小为141.5±35.2nm(范围：70nm-250nm) (p＜0.001)。

图15显示了裸鼠模型中由从GFP大鼠分离的绿色荧光蛋白 (GFP)-TDSC形成的细胞片的体内发育和成熟。图15(A)显示了细胞片的 皮下移植。图15(B)显示了移植后第8周时的移植组织。

图15(C-E、C’-E’)分别显示了移植前、移植后第6周和第8周时的 细胞片的组织学。移植后6周的细胞性和血管性(箭头)很好(D)。细胞仍 然是随机定向的并且是圆的(D)。产生了大量细胞外基质(D)，但是正如偏 光显微镜显微检查所示，组织条理并不好(D’)。移植后8周，细胞性下降 (E)。形成肌腱样组织和韧带样组织(E)。细胞变成纺锤形，沿加载轴纵向 排列并被包埋于平行的原纤维之间(E)。第8周时的原纤维比移植前更厚， 并表现出肌腱/韧带的典型胶原蛋白双折射(E’)。

图15(F、F’、G、G’)显示了裸鼠模型中移植后6周(F、F’)和8周(G、 G’)后的细胞片的更高放大率图像。在第8周时，细胞沿着加载轴纵向排 列并且被包埋在平行的胶原蛋白原纤维之间(星号、F)。

染色：苏木精和伊红；放大率：(C-E、C’-E’)：50倍；(F、F’、G、 G’)：200倍；比例尺＝100μm；箭头：血管；星号：排列的细胞。

图15(H、I)显示了裸鼠模型中移植6周(H)和8周(I)后，细胞片的离 体荧光成像。因为用于形成细胞片的TDSC分离自GFP大鼠，所以可以 检测到绿色荧光信号。在第6周时，在移植了未加载的细胞片的裸鼠中 未观察到荧光信号。细胞片降解并且无法发现(图15H的左侧小鼠)。在 第6周和第8周时，在缝合于裸鼠脊柱肌肉的移植组织中能检测到荧光 信号。

图16显示了将大鼠GFP-TDSC片缝合于大鼠髌腱窗样创伤的手术过 程，以及在第2周进行离体荧光成像时，窗样创伤中存在GFP-TDSC。 图12(A)显示了用两个叠放的刀片在髌腱中制造窗样创伤。图16(B和C) 显示了将细胞片卷起并缝合于窗样创伤中的髌骨和胫骨近端。图16(D、 E)显示了在第2周时无细胞片的(D)和具有细胞片(E)的受损髌腱。图16(F) 和(G)分别显示了第2周时图16(D)和图16(E)的对应荧光图像。

图17显示了由从GFP大鼠分离的TDSC形成的细胞片在促进髌腱 窗样创伤大鼠模型中的愈合中的作用，通过第2周时的组织学检查证实。

TDSC片组的细胞性似乎高于对照组，这可能是细胞片移植造成的(C 与F相比)。正如细胞外基质的苏木精和伊红稳定性所表明的，TDSC片 组中观察到的胶原蛋白表达高于对照组。在TDSC片组的窗样创伤的中 心观察到平行的胶原蛋白纤维之间排列的细长的成纤维细胞样细胞(*、 E)，但是在对照组中未观察到该现象(B)。伴随该现象的是，在极化显微 镜下，TDSC片组中窗样创伤的胶原蛋白双折射(E’)高于对照组(B’)。在 两个组中都能容易地鉴别创伤边界(C、E)。染色：苏木精和伊红；A’-F’ 是对应的极化图像。比例尺＝500μm(A、A’，、D、D’)；比例尺＝100μm(B、 B’、C、C’、E、E’、F、F’)；放大倍数：50倍(A、A’、D、D’)；200倍 (B、B’、C、C’、E、E’、F、F)；*：成纤维细胞样细胞的纵向排列；N： 窗样创伤附近的正常的完整肌腱；W：创伤区域。

图18通过组织学方法显示了由分离自GFP大鼠的大鼠TDSC所形 成的细胞片在促进髌腱窗样损伤大鼠模型的愈合中的作用。

在第8周，两个组中创伤内的细胞性都降低，但是TDSC片组(E、 F)仍然高于对照组(B、C)。尽管如此，在两个组的创伤中心(B、B’与E、 E’相比)和创伤边缘(C、C’与F、F’相比)，TDSC片组中的细胞和胶原蛋 白纤维比对照组排列地更好，并且胶原蛋白双折射更高。与对照组(C)相 比，TDSC片组的创伤边界比较模糊(图18F)。染色：苏木精和伊红；A’-F’ 是对应的极化图像。比例尺＝500μm(A、A’、D、D’)；比例尺＝100μm(B、 B’、C、C’、E、E’、F、F’)；放大倍数：50倍(A、A’、D、D’)；200倍 (B、B’、C、C’、E、E’、F、F)；*：成纤维细胞样细胞的纵向排列；箭 头：血管；N：窗样创伤附近的正常的完整肌腱；W：创伤区域。

图19显示了将由从GFP大鼠分离的TDSC形成的细胞片移植到髌 腱窗样缺损2周和8周以及未进行细胞片移植的髌腱窗样缺损的再生组 织的极限应力(A)和杨氏模量(B)。#p≤0.050；“o”和“*”分别表示本研究中 的外界和极限值。

在TDSC片组和对照组中，从第2周到第8周，再生组织的极限应 力(TDSC组为p＝0.002，对照组为p＝0.007)和杨氏模量(TDSC组为 p＝0.002，对照组为p＝0.032)都显著增加。在TDSC片组中，第2周时 (p＝0.015；4.5±1.9N/mm²相比于2.5±0.8N/mm²)和第8周时(p＝0.035； 13.1±5.0N/mm²相比于8.4±5.9N/mm²)的极限应力(A)以及第2周时的杨 氏模量(p＝0.046；20.7±6.0N/mm²相比于14.9±2.5N/mm²)(B)都显著高于 对照组。在第8周时，TDSC组的杨氏模量也高于对照组，但是不具有统 计学显著性(p＝0.110；52.8±18.7N/mm²相比于36.2±13.8N/mm²)(B)。 发明的详细描述

下面参考附图进一步描述本发明。

本文所用术语“干细胞”指表现出自我更新和多系分化潜力的细胞。 “处理的干细胞”是指用生物因子、化学因子、遗传因子、生物机械因子 或生物物理因子处理过的干细胞，所述处理使干细胞能产生生物因子或 者使本文所公开的细胞片成熟。

本文所用术语“生物因子”指由氨基酸组成的、能调节细胞的生物活 性的所有蛋白。

在本发明的一方面，利用干细胞形成用于促进组织修复和生物人造 组织工程的细胞片。

在一个实施方案中，通过包括以下步骤的方法制备本文公开的细胞 片：处理干细胞，使得处理的干细胞能被包埋于其自分泌的细胞外基质 (ECM)中，并形成细胞片。因此，本文所公开的细胞片包含处理的干细胞 和由所述处理的干细胞自分泌的并包埋了所述处理的干细胞的细胞外基 质。

用于形成本发明细胞片的化学、生物学、遗传学、生物机械学或生 物物理学因子或试剂例如但不限于：诸如生长因子的化合物、化学试剂 或生物材料；或干细胞的基因修饰、体外机械负荷或生物物理干预。上 述因子或试剂可以用于本发明的干细胞或细胞片，只要其能调节细胞或 细胞片的程度和活性。

在另一个实施方案中，本文所公开的细胞片包含约50-95％w/w的 水，因此细胞片的干重为细胞片总重量的约5-50％w/w。细胞片可以包 含选自胶原蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白或以上的任意组合的化合物；所述 胶原蛋白选自I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、II型胶原蛋白或以上的任 意组合；所述蛋白聚糖选自聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、二聚糖或以 上的任意组合；所述糖蛋白选自弹性蛋白、软骨寡聚基质蛋白(COMP)、 腱生蛋白C或以上的任意组合。

在优选的实施方案中，细胞片包含占所述细胞片干重的40-90％w/w 的胶原蛋白、0.5-30％w/w的蛋白聚糖以及1-30％w/w的糖蛋白。在另一 优选的实施方案中，胶原蛋白包含占胶原蛋白总重量的70-98％w/w的I 型胶原蛋白、1-15％w/w的III型胶原蛋白以及1-5％的II型胶原蛋白； 或者，所述胶原蛋白优选包含占胶原蛋白总重量的70-98％w/w的I型胶 原蛋白、1-5％w/w的III型胶原蛋白以及1-5％的II型胶原蛋白。

在另一个实施方案中，本文所公开的细胞片包含直径为5-500nm的 原纤维。优选地，所述细胞片具有直径为50-250nm的原纤维。细胞片的 极限应力为至少1N/mm²、更优选至少5N/mm²、更优选约5-10N/mm²。 应力值取决于培养条件，但也基于当前设置。例如，用CTGF和抗坏血 酸培养2周后并折叠后的大鼠TDSC片在装载到断裂的过程中能够达到 约5-10N/mm²。

在可选的实施方案中，本发明所用的干细胞是成体干细胞。干细胞 分离自动物组织或人类组织。用于制备细胞片的干细胞是自体的或同种 异体的。本发明的干细胞可以分离自肌腱组织和韧带组织、骨髓、脂肪 组织、牙髓或以上的任意组合，但不限于此。在一个实施方案中，快速 增殖、表现出高的集落形成能力、目标组织特异性标志物的表达水平高 并产生高水平的ECM的干细胞具有形成细胞片的优势，这是由于它们能 缩短体外细胞培养时间并提高处理后体外形成细胞片的成功率。在优选 的实施方案中，干细胞是肌腱来源的干细胞(TDSC)。TDSC是根据Rui et  al.Tissue Eng Part A 2010；16(5)：1549-1558所述从肌腱分离的干细胞。该 细胞能形成集落，在低细胞密度下表现出较好的细胞增殖，表达表面标 志物CD44和CD90，但是对于表面标志物CD31和CD34是阴性的。该 细胞还表现出多系分化潜力，并在诱导后能分化成肌腱、韧带、软骨(软 骨细胞)或成骨细胞。参考图1-6，在基础水平和诱导后，与骨髓来源的 干细胞(BMSC)相比，TDSC都表现出较高的集落形成能力、增殖潜力和 多系分化潜力。因此，TDSC是用于形成细胞片的优良干细胞来源。

同种异体或自体的TDSC易于从肌腱/韧带外科手术的废弃材料中获 得，例如ACL重建中的肌腱移植组织和全膝关节置换中的肌腱和韧带组 织。与通过骨髓穿刺分离BMSC和通过吸脂术分离脂肪组织来源的干细 胞(ADSC)相比，从常规外科手术的废弃组织中分离干细胞具有避免对患 者造成额外疼痛的优势。在分离后直接使用同种异体干细胞，或将其保 存在液氮中，直到需要用其制备细胞片。

本发明的其它方面提供了制备本文所公开的细胞片的方法。所述方 法包括以下步骤：用生物因子或导致所述细胞片成熟和/或导致产生生物 因子的因子处理干细胞，从而在体外诱导干细胞分化、产生ECM并由此 形成细胞片，其中所述导致产生的生物因子包括用于处理干细胞的生物 因子。

在本发明的实施方案中，本文发明所用的生物因子是由氨基酸组成 的、能够调节细胞的生物活性的蛋白。在一个实施方案中，生物因子包 含转化生长因子家族(TGF)(例如TGF-β)和抗坏血酸。在另一个实施方案 中，生物因子包含生长分化因子/骨形态发生蛋白(GDF/BMP)家族成员(例 如GDF-5/BMP-14、GDF-6/BMP-13和GDF-7/BMP-12)和抗坏血酸。在优 选的实施方案中，用来诱导细胞形成的生物因子是结缔组织生长因子 (CTGF)和抗坏血酸。

在本发明的实施方案中，导致本发明的生物因子产生或细胞片成熟 的因子还可以是化学、遗传学、生物机械学或生物物理学因子或试剂。

在可选的实施方案中，本发明的方法包括使用化学试剂和生物试剂 来诱导生物因子的产生和/或使用基因修饰来诱导生物因子的过表达。在 形成细胞片的可选实施方案中，还可以将体外机械负荷或生物物理学方 法用于细胞或细胞片。在形成软骨的另一可选实施方案中，将压缩施加 于细胞或细胞片，作为机械力来刺激软骨形成。在形成骨、肌肉、肌腱 或韧带的另一可选实施方案中，将张力作为机械力施加于细胞或细胞片， 从而形成骨样、肌肉样、肌腱样或韧带样组织。

在利用得到的细胞片进行软骨修复的另一可选实施方案中，将压缩 负荷施加于细胞或细胞片，作为机械力来刺激软骨基质的形成。在骨、 肌肉、肌腱或韧带愈合的另一可选实施方案中，将张力作为机械力施加 于细胞或细胞片，从而刺激骨样、肌肉样、肌腱样或韧带样细胞外基质。

在本发明的其它实施方案中，对细胞片进行进一步的化学、生物学、 遗传学、生物机械学和/或生物物理学方面的修饰和/或添加，使得所述修 饰能调节细胞或细胞片的程度和活性。

在制备细胞片的方法的一个实施方案中，干细胞分离自组织，并且 如果需要，保存于液氮中。当需要形成细胞片时，将所述干细胞从液氮 中解冻。接种细胞、在培养皿中扩增，并使之生长，直到汇合。然后， 在培养基中用生物因子处理细胞。在培养中，定期更换含有生物因子的 培养基，直到形成细胞片。

在本发明的另一方面，提供了本文所公开的细胞片与任选的活性干 细胞在增强组织修复中的用途。在一个实施方案中，提供了在修复髌腱 中窗样损伤中的用途。髌腱的窗样损伤是由于前交叉韧带(ACL)重建中移 除髌骨-髌腱-骨移植物而造成的。在本发明的实施方案中，将细胞片用于 增强髌腱中窗样损伤的修复的方法中，所述方法包括卷起细胞片并缝合 在窗样缺损中的步骤。可以通过将细胞片包裹在破裂位点周围而将本发 明的细胞片用于增强肌腱(例如跟腱、手部肌腱)和韧带(例如后交叉韧带 PCL、ACL)的缝合修复。

在另一个实施方案中，本发明的细胞片用于促进ACL重建中肌腱- 骨连接的再生。因此，在促进ACL重建中肌腱-骨连接的再生的方法中使 用所述细胞片，与其它课题组使用骨膜自体移植物相似(Ohtera et al.，Crit  Rev Biomed Eng 2000；28(1-2)：115-118；Youn et al.，Clin Orthop Relat Res 2004；419：223-231；Chen et al.，J Orthop Surg Taiwan 2003；20：21-29)，所 述方法包括用细胞片包裹肌腱移植物的步骤。在另一个实施方案中，通 过将细胞片缝合于肌腱和骨之间的界面而将细胞片用于肩袖修复中。

在另一个实施方案中，通过将细胞片置于缺损中而将细胞片用于修 复骨折、骨关节炎、骨软骨缺损、肌肉撕裂、皮肤创伤或烧伤。

在可选的实施方案中，本发明提供了单独的细胞片无细胞产物或所 述无细胞产物与其它细胞类型或生长因子的组合在促进组织修复中的用 途。脱细胞化后，将细胞片与上文所述相似地用作组织工程应用的无细 胞生物材料。当单独使用时，将其用于防止修复缺口形成或修复失败、 增强宿主细胞粘附、渗透和增殖。脱细胞化产物形式的细胞片可以与其 它已知的用于促进组织修复的生长因子和细胞类型一起使用。

本发明的另一方面涉及使用本文所公开的细胞片来形成用于组织置 换的生物人造器官。细胞片与生物材料、化学因子、生物因子、生物机 械因子、生物物理因子在体外成熟和/或在动物中、优选在诸如裸鼠的免 疫缺陷动物中、或在与细胞片是自体同源的动物中的体内成熟形成了用 于组织置换的生物人造器官。

本发明的另一方面涉及修复骨折、骨关节炎、骨软骨缺损、肌肉撕 裂、皮肤创伤或烧伤的方法，包括将细胞片置于缺损中的步骤。

实施例

实施例1.细胞片的制备

根据Rui et al.Tissue Eng Part A 2010；16(5)：1549-1558所述，从大鼠 肌腱分离大鼠TDSC干细胞。将分离的TDSC在液氮中冷冻，直到使用。 为了形成细胞片，使TDSC在塑料培养皿的生长培养基中扩增，直到汇 合。然后，在湿润的细胞培养箱中，在10-45℃、3-10％CO₂的条件下， 用配制在低葡萄糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基(LG-DMEM)(Gibco)中 的CTGF(5ng/ml-1μg/ml)和抗坏血酸(5-100μM)处理细胞1-6周，所述培 养基还含有2-30％胎牛血清(FBS)、10-500U/ml青霉素、10-500μg/ml链 霉素和1-10mM L-谷氨酰胺。每2-5天更换含有CTGF和抗坏血酸的培 养基。参考图7和图12，在湿润的培养箱中，在37℃、5％CO₂的条件 下，用配制在含2％FBS的DMEM中的抗坏血酸(25μM)和CTGF(25 ng/ml)处理干细胞后，处理的细胞发生分化、产生丰富的细胞外基质并且 由此形成的细胞片是有弹性的。每3天更换含有CTGF和抗坏血酸的培 养基。参考图8和14，组织学和扫描电镜分析表明：包埋于自分泌的ECM 中的细胞仍然是圆形的并且是随机定向的。在第2周时，在由大鼠TDSC 形成的细胞片的组织学检查中观察到细的胶原蛋白原纤维；在第4周时， 在由人TDSC形成的细胞片的扫描电镜检查中观察到细的胶原蛋白原纤 维。

参考图8，在该条件下，与分离自大鼠肌腱的BMSC相比，TDSC形 成的细胞片更好，其具有更多的ECM和纵向排列的原纤维。参考图10 和图11，用CTGF和抗坏血酸处理大鼠TDSC能促进细胞向肌腱形成谱 系的分化，这可以由Tnmd，、Scx和Col1A1的mRNA表达增加所证实， 同时软骨相关标志物(Col2A1、Acan)和骨相关标志物(Bglap)的mRNA表 达降低。这符合在细胞片的形成过程中干细胞经过处理而发生分化。然 而，由于与BMSC相比，软骨细胞相关标志物(Col2A1，Acan)和骨相关标 志物(Bglap)的mRNA表达在处理后仍然较高，因此，通过用CTGF和抗 坏血酸处理TDSC而形成的细胞片仍适用于其它组织修复，例如但不限 于骨修复、肌腱-骨连接修复、软骨修复、皮肤修复和肌肉修复。

参考图7B和14，在另一个实验中，根据Rui et al.Tissue Eng Part A 2010；16(5)：1549-1558所述，从废弃肌腱分离人TDSC，并且该人TDSC 表现出与上文所示的大鼠TDSC相似的特性。

参考图13，经CTGF和抗坏血酸处理4周而形成的人TDSC片含有 90.2±1.4％的水和18.0±1.6％(干重)的sGAG。乙酸-胃蛋白酶可溶部分含 有4.5±4.0％(干重)的总胶原蛋白，其中主要是I型胶原蛋白(5.4±4.8％干 重)。仅有少量的III型胶原蛋白(8E-05±2.5E-05％干重)，并且II型胶原蛋 白的水平低于ELISA试剂盒的2ng/ml的检测限

参考图14，经CTGF和抗坏血酸处理4周而形成的人TDSC片合成 胶原蛋白原纤维并将合成的胶原蛋白原纤维分泌到细胞外基质。与正常 的人的腘腱的胶原蛋白原纤维相比，人TDSC片合成的胶原蛋白原纤维 组织较差并且较小(平均纤维直径：86.1nm±25.1nm相比于141.5±35.5 nm).

实施例2.生物人造肌腱和韧带的形成

参考图9，将用大鼠TDSC形成的细胞片卷起，并加载到U形弹性 针上，形成生物人造肌腱和韧带。参考图15，在将由大鼠TDSC形成的 细胞片移植并缝合到脊柱肌肉后，该细胞片进一步成熟。在移植后第8 周，细胞性比第6周时低，并且形成肌腱样和韧带样组织。移植的细胞 是活的、呈纺锤形、沿着加载轴纵向排列并且被包埋于平行的原纤维之 间。在第8周，原纤维比移植前更厚，且表现出肌腱和韧带的典型胶原 蛋白双折射。

实施例3.组织修复

在前交叉韧带(ACL)重建中移除髌骨-髌腱-骨移植物后会产生髌腱中 的窗样损伤，通过将具有活性TDSC的细胞片卷起并缝合在窗样缺损中， 可以将细胞片用于增强髌腱中窗样损伤的修复。参考图16-19，将用处理 的大鼠TDSC形成的细胞片缝合于髌骨窗形缺损促进了肌腱愈合。在第2 周，移植了细胞片的缺损中的一些细胞变得扁平。无细胞片的组中未观 察到该现象。在移植了细胞片的组中，观察到更多ECM。ECM沿着肌腱 纵向排列，并且表现出韧带和肌腱的典型胶原蛋白双折射。如离体荧光 成像所示，在第2周时，移植的细胞片仍存在于窗样缺损中。在第8周， 在创伤中心和创伤边缘，TDSC片组中创伤内的细胞和胶原蛋白纤维比对 照组排列地更好，并且胶原蛋白双折射更高。与对照组相比，TDSC片组 的创伤边界比较模糊。在第2周和第8周时，TDSC片组的极限应力和杨 氏模量高于对照组。除了第8周时的杨氏模量之外，差异都具有统计学 显著性。

实施例4.肌腱的缝合修复

通过将本发明的细胞片包括在破裂位点周围，可以将细胞片用于增 强肌腱(例如跟腱、手部肌腱)和韧带(例如后交叉韧带PCL、ACL)的缝合 修复。

参考图10和15，由TDSC形成的细胞片表现出高的肌腱形成活性和 韧带形成活性，并且适合于肌腱和韧带修复。 实施例5.骨折、骨关节炎、骨软骨缺损、肌肉撕裂、皮肤创伤或烧伤的 修复

参考图10和11，在用CTGF和抗坏血酸处理2周后，由TDSC形成 的细胞片表达高水平的肌腱形成标志物、软骨形成标志物和骨形成标志 物。这表明，本发明的细胞片可以用于修复骨折、骨关节炎、骨-软骨缺 损、肌肉撕裂、皮肤创伤或烧伤。

本发明的细胞片：

(1)无需使用支架来递送干细胞，并因此减少了通常由合成支架带来 的生物相容性、生物降解性和免疫原性问题。

(2)天然ECM组合物和提供组织再生接触指导的初级原纤维结构的 存在会提供适合存活、增殖和分化的必需的体内样环境因素，并且刺激 干细胞的再生应答。这是仅含有1-2种基质组分的合成和天然支架所无法 比拟的。合成支架会带来干细胞存活的氧和养分的运输问题，而该问题 在本发明仅是有限的。

(3)本发明的细胞片便于体内细胞移植，并且为组织修复过程中承载 早期机械负荷(例如复原)提供一定抗拉机械强度。其允许较早地进行复原 活动，从而促进损伤后的较早痊愈。

(4)参考图16-19，本发明的细胞片促进组织愈合，并伴有更早的痊 愈和更好的愈合质量，并且参考图15，形成了肌腱样和韧带样组织。

对本发明实施方案的以上描述的性质仅是示例性的，因此，对实施 方案做出的各种变化不应认为是偏离本发明的实质和范围。