检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单抗及酶联免疫方法与试剂盒

摘要

本发明公开了一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单克隆抗体和一种用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫检测方法与试剂盒。本发明的单克隆抗体是由杂交瘤细胞4B10所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201143。本发明的酶联免疫检测方法包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别无色结晶紫、孔雀石绿、无色孔雀石绿，本发明的检测方法和试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单克隆抗体 及一种用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫方法与试剂盒。

背景技术

孔雀石绿、结晶紫属于三苯甲烷类染料，可用作杀菌、驱虫剂，是药用染 料中抗菌效力较强的一类。由于孔雀石绿和结晶紫具有潜在的致癌性，已被许 多国家禁用，但是目前还存在非法使用的现象，因此很有必要加强对于该药的 检验监测。

孔雀石绿和结晶紫可分别代谢为无色孔雀石绿及无色结晶紫，目前，对于 孔雀绿、结晶紫及其代谢物残留检测的方法主要是高效液相色谱法，该方法虽 然灵敏、准确，但样品前处理繁琐、检测时间长、耗资大、技术性要求高，且 要有昂贵的仪器，不适合大量样品的高通量检测。酶联免疫检测方法(ELISA) 是利用免疫反应(即抗原-抗体结合反应)的高度特异性和酶促反应的高度敏感 性对药物进行定性和定量分析的一种综合性检测技术，它具有操作简便、高通 量、高灵敏度、低费用等优点，能克服仪器检测方法的不足之处。

申请号为200810202733.8的中国专利公开了一种检测孔雀石绿的酶联免疫 试剂及方法，该发明采用活泼酯法将孔雀石绿半抗原分别与钥孔槭血蓝蛋白和 牛丙种球蛋白偶联得到免疫原和包被原，所得到的酶联免疫试剂及方法仅能检 测孔雀石绿，无法检测其代谢产物及结晶紫的代谢产物。申请号为 200910058317.X的另一篇中国专利公开了测定水样及水产品中孔雀石绿和无色 孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是合成氨基无色孔雀石绿作为 半抗原，分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白偶联得到免疫原和包被原，通过免疫 动物获得多克隆抗体，该发明所采用的半抗原合成方法复杂，涉及到加氢等比 较危险的反应体系。

发明内容

本发明的第一个目的是对孔雀石绿半抗原进行结构改造，合成对-[3-(羧基) 丙氧基]无色孔雀石绿作为半抗原，进而提供出一种能识别孔雀石绿、无色孔雀 石绿和无色结晶紫的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是利用所述该单克隆抗体，建立一种能用于孔雀石绿、 无色孔雀石绿和无色结晶紫检测的酶联免疫方法。

本发明的第三个目的是提供一种检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶 紫的酶联免疫试剂盒。

本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测孔雀石绿、无色孔 雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供包含所述单克隆抗体的试剂盒在动物源性食品 中孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫检测中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的单克隆抗体，它是由 保藏号为CCTCC NO：C201143的杂交瘤细胞4B10所分泌的。

上述杂交瘤细胞4B10，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201143。

所用的免疫原是由半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿与人血清白蛋 白偶联制备的。

进一步，本发明提供了一种用于孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫检 测的酶联免疫方法，包括以下步骤：

(1)将半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿(LMG-HEO)与人血清白 蛋白(HSA)偶联得到免疫原(LMG-HEO-HSA)；

(2)将半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿(LMG-HEO)与卵清蛋白 (OVA)偶联得到包被原(LMG-HEO-OVA)；

(3)利用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号 为CCTCC NO：C201143的杂交瘤细胞4B10；

(4)用保藏号为CCTCC NO：C201143的杂交瘤细胞4B10制备单克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体(如酶标板)；

(6)取均质好的组织样品，用乙腈超声提取、离心，取乙腈层用氮气吹干， 残渣用含0.05体积％吐温20的10mM PH为7.4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶 液(Tris-HCl溶液)溶解，得到待测物；

(7)取待测物进行ELISA检测。

步骤(6)含0.05体积％吐温20的10mM PH为7.4的三羟甲基胺基甲烷- HCl溶液(Tris-HCl溶液)的配制方法为：准确称取三羟甲基胺基甲烷(Tris) 1.211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐酸调pH值至 7.4，再加0.5mL吐温20溶解，定容至1000mL。

本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合， 制成了能检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的酶联免疫试剂盒，结合 上述酶联免疫方法，实现了对动物可食性组织中孔雀石绿、无色孔雀石绿和无 色结晶紫的酶联免疫检测。

本发明的主要优点是：

1.本发明制备的单克隆抗体能同时检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结 晶紫，识别范围广，灵敏度高。

2.本发明设计的半抗原合成工艺简便、效率高，所用的主要有机试剂避免 了高毒性，对操作者身体健康危害小。

3.本发明所使用的人工抗原载体为人血清白蛋白，在现有专利和文献中未 见报道和使用，免疫效果优于牛血清白蛋白做载体的免疫原。

4.本发明涉及的ELISA检测方法以含0.05体积％吐温20的10mM PH为 7.4的Tris-HCl溶液为标准品稀释液和样品稀释液，对待测物的溶解性好，所得 标准曲线线性好，检测结果的准确度和精密度好。

附图说明

图1为本发明免疫原LMG-HEO-HSA的MALDI-TOF/TOF图谱。

图2为本发明载体蛋白HSA的MALDI-TOF/TOF图谱。

图3为本发明的单克隆抗体与无色结晶紫标准品的间接竞争ELISA反应曲 线，X轴为孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫三种标准溶液浓度对数值，Y 轴为孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫三种标准品溶液的光密度值除以“0” 孔光密度值(B/B₀)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 半抗原的制备

1.1 合成对-[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛

干燥处理：取一瓶N，N-二甲基甲酰胺(DMF)500ml加无水硫酸钠60g， 震荡，静置过夜，减压过滤，收集干燥后的DMF于一干燥的1000ml单口瓶， 密封，置干燥阴凉处备用。

药品称量：准确称取4-羟基-苯甲醛34g，碳酸钾28g，4-溴丁酸乙酯68g。

羟基烷基化反应：将以上称取的三种药品一起加入到200ml干燥DMF中， 110℃回流反应过夜。静置至室温，过滤，滤液用乙酸乙酯提取，抽真空干燥。 获得具有水果清香味的无色油状液体，即为对-[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛。

1.2 合成对-[3-(乙基羧基)丙氧基]无色孔雀石绿

称量：准确称(量)取步骤1所获的对-[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛8g，N， N二甲苯胺30ml，对甲苯磺酸15g。

傅克反应：将以上称量的三种物质混合，120℃搅拌反应过夜。静置至室温， 加13g固体碳酸钾中和反应体系。乙酸乙酯提取后，抽真空干燥。得到橙色油 状物，即为对-[3-(乙基羧基)丙氧基]无色孔雀石绿。

柱色谱纯化：采用湿法填柱进样，以乙酸乙酯∶正己烷＝1∶6为流动相纯化上 述得到的对-[3-(乙基羧基)丙氧基]无色孔雀石绿。

1.3 合成对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿

称量：准确称(量)取步骤2所获的对-[3-(乙基羧基)丙氧基]无色孔雀石绿 6g，甲醇∶四氢呋喃＝3∶2混合溶液300ml，4N NaOH溶液50ml。

皂化反应：将以上称量的物质混合，室温搅拌反应过夜(16小时)。真空除 掉有机溶剂部分，吸出水层底部的少量油滴，用乙酸乙酯∶正己烷＝1∶4萃洗，弃 正己烷层，静置于4℃，待溶液中出现大量亮色薄片状物质时，过滤，得到肉黄 色粘土状粗品。将其均匀铺开，静置干燥。用研钵磨细，得到蓝绿色固体，即 为对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿(LMG-HEO)。

实施例2 免疫原和包被原的制备

2.1 药物羧基端的活化

药品称量：准确称取LMG-HEO 80mg，1，3-二环己基碳二亚胺(DCC) 20mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)11.5mg。

药物羧基端的活化：将以上称取的三种药品置于10mL反应瓶中，加入DMF 3mL和磁力搅拌子，室温避光搅拌反应16小时，过滤，取滤液(此为A液)备 用。

2.2 载体蛋白溶液配制

称量：准确称(量)取0.1M pH 8.5的碳酸氢钠溶液16mL，人血清白蛋白 (HSA)100mg或者卵清蛋白(OVA)100.mg。

制备B液：将HSA 100mg溶解到0.1M pH8.5的碳酸氢钠溶液16mL中， 加入磁力搅拌子，此为B液。

制备C液：将OVA 100.mg溶解到0.1M pH8.5的碳酸氢钠溶液16mL中， 加入磁力搅拌子，此为C液。

2.3 人工抗原制备

免疫原的制备：将实施例2.1制备的A液逐滴加到实施例2.2配制的B液中， 搅拌反应过夜。然后将此混合溶液装入透析袋中，对pH7.2的磷酸盐缓冲溶液透 析，将透析充分的抗原从透析袋取出，加入到10ml离心管5000转/分钟，离心 10分钟。吸取上清，1.5ml/青霉素小瓶分装，在-70℃预冻过夜，冷冻干燥24小 时，封口处理，-70℃低温保存。此即为免疫原LMG-HEO-HSA。分别称取1mg  LMG-HEO-HSA和HSA于1.5mL EP管中，超纯水溶解到1mg/mL、0.5mg/mL、 0.25mg/mL三个浓度，过0.22μL微孔滤膜后进样，经MALDI-TOF/TOF进样扫 描，见附图1、2。根据分子离子峰吸收值计算为结合率(69252.06-66492.53) /446＝6.18。

包被原的制备：将实施例2.1制备的A液逐滴加到实施例2.2配制的C液中， 搅拌反应过夜。然后将此混合溶液装入透析袋中，对pH7.2的磷酸盐缓冲溶液 透析，将透析充分的抗原从透析袋取出，加入到10ml离心管5000转/分钟，离 心10分钟。吸取上清，1.5ml/青霉素小瓶分装，在-70℃预冻过夜，冷冻干燥24 小时，封口处理，-70℃低温保存，此即为包被原LMG-HEO-OVA。

实施例3 单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞的制备：参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001 年版中的方法：以实施例2制备的免疫原LMG-HEO-HSA免疫Balb/C小鼠，免 疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮 下多点注射，首免与二免间隔3周，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完 全佐剂乳化，最后于融合前三天腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。 融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳 性血清)，在75％酒精中浸泡5分钟消毒。

将3-5×10⁷SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾脏细胞悬液加入到50mL离心管 中，混匀，1500r/分钟离心5分钟。弃上清，并用灭菌的滤纸吸干。轻轻敲击管 底，使管底细胞松动。将离心管置于37℃水浴中，缓慢加入预温至37℃的50％ PEG0.85mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌，加完后继续搅拌，总用时维持在90秒 内。

缓慢加入37℃预温的RPMI-1640基础液10mL。具体方法为：第1分钟逐 滴加1mL，第2分钟加2mL，之后缓慢加入剩余的RPMI-1640基础液，边加边 轻摇离心管。缓慢加入40mL RPMI-1640基础液，加完后，缓慢上下颠倒混匀， 1500r/分钟离心5分钟。弃上清，10mL滴管吸取含饲养细胞HAT培养基，沿管 壁缓慢滴加，用滴管缓慢机械搅拌，缓慢吸取融合细胞，接近饲养细胞液面滴 加，机械搅拌混匀。接种于6块96孔培养板中，约150μL/孔，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

从融合当天起计为0天，3天后每个培养孔滴加1滴HAT培养基，5天后有 规律地每隔2天吸去1/2体积的培养基，换入等量HT培养基。在融合后4天，开 始对融合细胞进行跟踪观察，标记和记录有杂交瘤细胞生长的培养孔，并计算融 合率。在融合后6-7天，待孔内细胞长至孔底1/10-1/5时，取培养上清，用间 接竞争ELISA方法筛选阳性细胞孔。包被原浓度为10mg/L。每个细胞培养孔设置 0孔和200μg/L药物孔，每孔中加入50μL培养上清进行间接竞争ELISA检测。

选择4-6个上清检测呈强阳性且只有1-2个形态良好集落生长的孔，用 有限稀释法进行亚克隆。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌针对孔雀石绿、无 色孔雀石绿、无色结晶紫的特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞。申请人将该杂交 瘤细胞命名为4B10，并于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内 的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：C201143。

腹水单抗制备与鉴定：在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注 射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI-1640基础培养基悬浮由保藏号 为CCTCC NO：C201143的杂交瘤细胞4B10扩大培养的细胞，并将细胞数调至 1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死 不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京： 人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的 鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单 克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG2a亚型。

实施例4 无色结晶紫、孔雀石绿、无色孔雀石绿间接竞争ELISA检测方法 的建立

4.1 ELISA相关试剂配制

碳酸盐缓冲液(pH 9.6)：准确称取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g，少量超 纯水溶解，定容至1000mL。

洗涤液(pH 7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g， KCl 0.20g，少量超纯水溶解，加入吐温20 0.50mL，定容至1000mL。

磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)：准确称取NaCl8.00g，KH₂PO₄0.20g， Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

封闭液：准确称取卵清蛋白10.00g，加入1000mL磷酸盐缓冲液，搅拌混匀 直至蛋白完全溶解。

含0.05体积％吐温20的10mM PH为7.4的Tris-HCl溶液的配制：准确称 取Tris 1.211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐酸调 pH值至7.4，再加0.5mL吐温20溶解，定容至1000mL。

底物液购自武汉飞远科技有限公司。

终止液：2mol/L硫酸。

4.2 包被原浓度和抗体工作浓度的确定

包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定：采用方阵滴定初步确定包被原浓 度和抗体工作浓度，抗原浓度设置4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.3125mg/L。 抗体浓度为2、4、8、16、32、64、128，256×10³。酶标板每孔加入50μL PBS 和50μL抗体，选择OD值接近2.0，且相邻孔OD值出现较大变化的包被浓度 和抗体浓度做为最佳抗原、抗体组合。由表1方阵结果可以确定包被原浓度为 1mg/L，初步确定抗体工作浓度为1∶20000。

表1 抗体方阵测定结果

根据选择的不同包被原浓度下OD值接近2.0的抗体浓度，设置4个梯度， 确定不同抗原浓度下OD值接近2.0的抗体浓度。以无色结晶紫做为竞争药物， 以标准曲线IC₅₀值做为判定指标，确定最佳抗体工作浓度。

以最佳包被原浓度包被酶标板，将抗体以中心浓度1∶20000等差设置3个稀 释度对一抗浓度做微调。将无色结晶紫(LCV)稀释成0μg/L、2μg/L、4μg/L、 8μg/L、16μg/L、5个浓度，做间接竞争ELISA。结果见表2，随着抗体稀释度 的增加，IC₅₀略有下降，在1∶24000这一稀释度，“0”孔OD值恰好在2.0附近， 因此选择抗体稀释度为1∶24000。结果显示最佳包被浓度为1mg/L，抗体工作浓 度2.4×10⁴。

表2 最佳抗体工作浓度的确定

4.3 标准曲线的建立和灵敏度

在优化的条件下，将标准品无色结晶紫(无色孔雀石绿、孔雀石绿类似) 配成系列浓度，每个浓度重复3个孔，用间接竞争ELISA检测。以标准溶液浓 度对数值为横坐标，药物孔与0孔OD值之比B/B0为纵坐标绘制标准曲线，重 复测定5次，计算IC₅₀值，取平均值。如附图3所示，标准曲线回归方程为 y＝-0.603x+0.9388，r＝0.999；标准曲线在2-32μg/L浓度范围内呈线性，标准曲 线半数抑制率IC₅₀值为5.34±2.2μg/L(n＝5)。

4.4 本发明ELISA检测方法的特异性

用建立的ELISA方法对三苯甲烷类化合物测定IC₅₀并带入公式1求出的相 应的交叉反应率，测定结果见表3。结果表明，本发明建立的ELISA检测方法 对无色孔雀石绿、无色结晶紫和孔雀石绿有较高的灵敏性。抗体对结晶紫有一 定的交叉反应率，对副品红无交叉反应。

交叉反应率＝IC₅₀(无色孔雀石绿)/IC₅₀(其他药物)×100％ (公式1)

表3 4B10抗体对三苯甲烷染料类似物的交叉反应率

  药物   IC50(μg/L)   交叉反应率(％)   无色结晶紫   5.34   1423.22   无色孔雀石绿   76   100   孔雀石绿   121.31   62.65   结晶紫   261   29.12   副品红   ＞1000   ＜7.6

实施例5 本发明孔雀石绿检测ELISA试剂盒的组装

5.1 试剂盒组分

(1)包被有包被原LMG-HEO-OVA的酶标板；

(2)无色结晶紫标准品溶液6瓶，浓度分别为0、2、4、8、16、32μg/L；

(3)4B10单克隆抗体工作液；

(4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

(5)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl  2.0g，吐温205mL，加双蒸水至1000mL

(6)底物混合液：购自武汉市飞远科技有限公司。

(7)终止液：2mol/L硫酸溶液。

5.2 酶标板制备

(1)包被：用碳酸盐缓冲液将包被原LMG-HEO-OVA稀释成1μg/mL，准 确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12小时。

(2)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各 酶标孔，静置30秒后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

(3)封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培 养箱孵育2小时。

(4)洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30秒 后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

(5)烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5小 时。

(6)封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。

实施例6 本发明的酶联免疫试剂盒的测定程序

6.1 试剂的配制

(1)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用超纯水稀释10倍后使用。

(2)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体 积1∶100混匀，现配现用。

(3)含0.05体积％吐温20的10mM PH为7.4的Tris-HCl溶液的配制：准 确称取Tris 1.211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐 酸调pH值至7.4，再加0.5mL吐温20溶解，定容至1000mL。

6.2 组织样品前处理

取均质组织样品2.0g，加入6mL乙腈，涡旋5分钟后进行超声振荡提取15分钟， 然后4000r/分钟离心10分钟；取乙腈层3mL用氮气吹干，残渣用含0.05体积％吐 温20的10mM PH为7.4的Tris-HCl溶液0.5mL溶解。

注：本方法对样品的稀释倍数是0.5。

6.3 ELISA测定程序

取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔 架；加无色结晶紫标准品溶液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两 个平行实验，记录下标准品和样品的位置；加4B10单克隆抗体工作液50μL至 各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60分钟；甩净孔中液体，在吸水纸 上拍干。准确吸取PBST 250μL于各孔，静置30秒，甩净PBST，在吸水纸上拍 干。重复洗涤3-5次。加辣根过氧化物酶(HR)标记的羊抗鼠IgG抗体工作 液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60分钟；甩净孔中液体， 在吸水纸上拍干。准确吸取PBST 250μL于各孔，静置30秒左右，甩净PBST， 在吸水纸上拍干。重复洗涤3-5次。加底物液100μL至各孔，充分混合；水平 置湿盒内，37℃孵育15分钟；加终止液50μL至各孔；充分混合；30分钟内在 450nm处测量吸光值。

6.4 结果判定

以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B₀)为纵坐标，无色结晶紫 浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。按照公 式计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以相应的 稀释倍数，即为样品中无色孔雀石绿、无色结晶紫和孔雀石绿的残留浓度。

实施例7 本发明试剂盒的灵敏度、精密度和准确度

7.1 本发明试剂盒的灵敏度

以标准曲线的IC₅₀值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的 灵敏度指标。将无色结晶紫标准品稀释成0μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、16μg/L、 32μg/L等6个浓度，每个浓度5个重复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定 5次，取5次测定的IC₅₀的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白鱼 肉的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的无色结晶紫浓度，然后计 算出无色结晶紫浓度的平均值和标准差(SD)，根据公式计算出组织中的最低检测限。本发明的IC₅₀值为5.34±2.2μg/L，无色结晶紫在 鱼肉中的最低检测限为1.15μg/kg。

7.2 本发明试剂盒的精密度

分别将2、4、8、16、32μg/L的无色结晶紫标准品浓度对应的OD值代入其 标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争 ELISA标准曲线的板内板间变异系数，结果见表4。结果表明，标准曲线的板内 及板间变异系数均＜15％，说明本研究建立的间接竞争ELISA方法具有较好的 精密度。

表4 本发明ELISA试剂盒的精密度

7.3 本发明试剂盒的准确度

在2g均质的鱼肉中加入孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫标准溶液， 使其终浓度分别为1μg/kg、2μg/kg和4μg/kg；每个浓度5个重复，重复测定3 次。测定添加组织中孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的浓度，按照下述 公式计算回收率，考核试剂盒的准确度；计算批内和批间变异系数，考核试剂 盒的重复性。准确度和重复性结果见表5、表6和表7，表明该试剂盒具有可靠 的准确度，批内和批间变异系数小，重复性好。

表5 鱼肉中无色结晶紫添加回收率与变异系数

表6 鱼肉中孔雀石绿加回收率与变异系数

表7 鱼肉中孔雀石绿加回收率与变异系数