来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡及其应用

摘要

本发明涉及来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡，所述微囊泡比所述有核细胞小。本发明的微囊泡可用于将治疗物质或诊断物质递送至特定组织或特定细胞，更具体地，本发明涉及来源于单核细胞、巨噬细胞、树枝状细胞、干细胞等等的微囊泡，所述微囊泡可用于递送治疗和/或诊断与癌症、血管疾病、炎症等相关的组织的特定治疗物质或诊断物质。

说明书

技术领域

本发明涉及来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡及其在治疗物质和/或诊断 物质的递送中的应用。

背景技术

药物递送系统(DDS)意在协助将药物递送至体内的靶位点从而带来治 疗效果。例如，如果药物由于其吸收速度或生物利用速度较低而从体内排出 太快，那么可使用DDS来改良药物释放曲线。需要将具有严重副作用的药物 仅递送至标靶组织或标靶细胞。例如，许多当前可用的抗癌药剂对正常细胞 和癌细胞都表现出细胞毒性。将抗癌药剂大部分递送至癌细胞或癌组织将减 少癌症患者在治疗期间的痛苦及不便。

自从脂质体在20世纪60年代首次使用以来，其在DDS中的用途已被广泛 研究。在脂质体研究中已经构建了与散布于细胞膜外部的诸如聚乙二醇(PEG) 之类的聚合物结合的先进脂质体，称为隐形脂质体，所述隐形脂质体可避免 被体内免疫系统检测出。PEG包被使药物递送机制的循环半衰期更长。实践中， 已开发出DOXIL(阿霉素的聚乙二醇化脂质体封装形式)。然而，脂质体及 隐形脂质体本身不能将药物递送至靶细胞或靶组织，因为它们缺乏识别靶细 胞或靶组织的能力。为了使脂质体结合于特定标靶，最近，研究已经指向诸 如单克隆抗体之类的靶向脂质体的配体的开发，但均未通过临床测试且均未 成功地商业化。

使用天然生成的细胞膜代替由脂质构成的人工合成脂质体来开发递送 系统。来源于在含有药物的培养基中生长的转化的微生物的囊泡用于药物递 送[WO 2005/079854，“Compositions and methods for targeted in vitro and in  vivo drug delivery to mammalian cells via bacterially derived intact minicells”]。 如果囊泡来源于革兰氏阴性细菌，那么，它们含有可导致包括体内免疫反应 在内的各种副作用的脂多糖，所述囊泡一般由细菌细胞膜构成。此外，使用 人类红细胞膜的递送系统也被公开[US 2007/0243137，“Cell and sub-cell  methods for imaging and therapy”]。如果将物质装载至由红细胞膜构建的囊泡 中，那么，该物质可在血液中保持一段较长的时间段，因为红细胞在血液中 保持120天。所装载的物质包括用于促进医学成像的图像造影剂以及用于放 射疗法的金属粒子或离子。然而，来源于红细胞的囊泡不能用于将药物递送 至特定的细胞或特定的组织，因为红细胞缺乏识别特定细胞或特定组织的能 力。此外，红细胞无核，因此，不可能将红细胞转化成在其表面上表达识别 特定细胞或特定组织的配体。

发明内容

技术问题

为了克服现有技术面临的问题，本发明对DDS进行了集中而深入的研 究，结果发现来源于可被转化的有核哺乳动物细胞的微囊泡可用于将治疗物 质和/或诊断物质有效地递送至特定细胞或特定组织，从而得到本发明。

因此，本发明的目的在于提供包含来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡的 组合物、包含装载了治疗物质和/或诊断物质的微囊泡的药物组合物、使用所 述微囊泡将物质递送至特定标靶的方法、包含所述微囊泡的用于递送治疗物 质或诊断物质的系统，以及包含所述微囊泡的试剂盒。

然而，本发明中将要实现的技术目的不限于上述目的，通过以下描述， 本领域技术人员可清楚地理解其他目的。

技术方案

本发明一方面提供一种组合物，所述组合物包含来源于有核哺乳动物细 胞的亚细胞尺寸的微囊泡。

本发明中有用的有核哺乳动物细胞包括能够靶向特定细胞或特定组织的 细胞，或者能够表达治疗物质或诊断物质的细胞。此外，所述有核哺乳动物 细胞包括转化为被导向特定细胞或特定组织的细胞，和/或转化为表达治疗物 质和/或诊断物质的细胞。

本发明的微囊泡可使用下列方法构建：对包含有核哺乳动物细胞的悬浮 液进行挤压、超声处理、细胞裂解、均匀化、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解 及化学物质处理。

本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含装载了治疗 物质或诊断物质的来源于有核哺乳动物细胞的亚细胞尺寸的微囊泡。

本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含装载了治疗 物质或诊断物质的来源于有核哺乳动物细胞的亚细胞尺寸的脱落微囊泡。

所述诊断物质和/或治疗物质来源于有核细胞，并且所述诊断物质和/或治 疗物质对所述细胞而言是外源的。

如下所述，本发明的微囊泡或脱落微囊泡可装载治疗物质和/或诊断物质。

首先，微囊泡可由已装载了目标治疗物质和/或诊断物质的细胞制备。例 如，当将细胞在包含目标治疗物质和/或诊断物质的培养基中培养时，它们可 包含其中的物质。可选地，所述物质可通过电穿孔导入细胞内。通过超声处 理、挤压或机械降解从包含所述物质的细胞中脱落的或由包含所述物质的细 胞构建的微囊泡装载了所述物质。

然后，在微囊泡的构建过程中，可将所述物质装载至微囊泡内。例如， 当通过亚细胞尺寸的过滤器挤压包含目标物质的细胞悬浮液时，由此形成的 微囊泡装载了所述物质。

在另一可选方式中，微囊泡或脱落微囊泡可在其构建或形成后装载目标 物质。例如，所述装载可通过用所述物质孵育微囊泡或脱落微囊泡的悬浮液 而实现，或者通过电穿孔使所述物质进入已经制备的微囊泡或脱落微囊泡中 而实现。

然而，本领域技术人员应当意识到，将目标物质装载至微囊泡或脱落微 囊泡内并不限于以上举例说明的方法。

本发明另一方面提供一种用于递送治疗物质或诊断物质的组合物，所述 组合物包含来源于有核哺乳动物细胞的亚细胞尺寸的微囊泡。

本发明另一方面提供一种用于递送治疗物质或诊断物质的组合物，所述 组合物包含来源于有核哺乳动物细胞的亚细胞尺寸的脱落微囊泡。

本发明另一方面提供一种治疗物质或诊断物质的递送系统，所述治疗物 质或诊断物质的递送系统包含来源于有核哺乳动物细胞的亚细胞尺寸的微囊 泡。

本发明另一方面提供一种治疗物质或诊断物质的递送系统，所述治疗物 质或诊断物质的递送系统包含来源于有核哺乳动物细胞的亚细胞尺寸的脱落 微囊泡。

本发明另一方面提供一种由有核哺乳动物细胞制备装载了治疗物质或 诊断物质的微囊泡的方法，所述方法包括：对有核哺乳动物细胞的悬浮液进 行处理以构建所述微囊泡，所述处理选自：挤压、超声处理、细胞裂解、均 匀化、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解及化学物质处理；从悬浮液中分离所述 微囊泡；以及用所述治疗物质或诊断物质孵育所述微囊泡的分离物的悬浮 液。

本发明另一方面提供一种由有核哺乳动物细胞制备装载了治疗物质或 诊断物质的微囊泡的方法，所述方法包括：用所述治疗物质或诊断物质孵育 所述有核哺乳动物细胞的悬浮液，从而将所述治疗物质或诊断物质装载至所 述有核哺乳动物细胞；以及对混合的悬浮液进行处理以构建所述微囊泡，所 述处理选自：挤压、超声处理、细胞裂解、均匀化、冷冻-解冻、电穿孔、机 械降解及化学物质处理。

本发明另一方面提供一种由有核哺乳动物细胞制备装载了治疗物质或 诊断物质的微囊泡的方法，所述方法包括：将所述治疗物质或诊断物质加至 所述有核哺乳动物细胞的悬浮液中以生成混合的悬浮液；以及对所述混合的 悬浮液进行处理以构建所述微囊泡，所述处理选自：挤压、超声处理、细胞 裂解、均匀化、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解及化学物质处理。

本发明另一方面提供一种由有核哺乳动物细胞制备装载了治疗物质或 诊断物质的脱落微囊泡的方法，所述方法包括：从所述有核哺乳动物细胞的 悬浮液中分离所述脱落微囊泡；以及在存在治疗物质或诊断物质的条件下孵 育所述脱落微囊泡的分离物的悬浮液。

本发明另一方面提供一种由有核哺乳动物细胞制备装载了治疗物质或 诊断物质的脱落微囊泡的方法，所述方法包括：在存在所述治疗物质或诊断 物质的条件下，培养所述有核哺乳动物细胞的悬浮液，从而将所述治疗物质 或诊断物质装载至所述有核哺乳动物细胞；以及从培养物中分离装载了治疗 物质或诊断物质的脱落微囊泡。

本发明另一方面提供一种将治疗物质或诊断物质递送至特定细胞或特 定组织的方法，所述方法包括使用来源于有核哺乳动物细胞的、装载了治疗 物质或诊断物质的、亚细胞尺寸的微囊泡。

本发明另一方面提供一种将治疗物质或诊断物质递送至特定细胞或特 定组织的方法，所述方法包括使用来源于有核哺乳动物细胞的、装载了治疗 物质或诊断物质的、亚细胞尺寸的脱落微囊泡。

本发明另一方面提供一种治疗疾病或诊断疾病的方法，所述方法包括使 用来源于有核哺乳动物细胞的、装载了治疗物质或诊断物质的、亚细胞尺寸 的微囊泡将所述治疗物质或诊断物质递送至特定细胞或特定组织。

本发明另一方面提供一种治疗疾病或诊断疾病的方法，所述方法包括使 用来源于有核哺乳动物细胞的、装载了治疗物质或诊断物质的、亚细胞尺寸 的脱落微囊泡将所述治疗物质或诊断物质递送至特定细胞或特定组织。

本发明另一方面提供一种用于诊断疾病的试剂盒，所述试剂盒包含：来 源于有核哺乳动物细胞的、亚细胞尺寸的微囊泡或脱落微囊泡，所述微囊泡 或脱落微囊泡装载了作为活性成分的引物、探针、反义核酸或抗体。

有益效果

根据本发明的装载了治疗物质和/或诊断物质的、来源于有核哺乳动物细 胞的微囊泡或脱落微囊泡可将所述物质选择性地且有效地递送至靶细胞或 靶组织，从而可消除将所述治疗物质递送至非标靶之后可发生的可能的副作 用，减轻治疗过程中癌症患者的痛苦和不便。此外，通过微囊泡将诊断物质 特异性递送至靶细胞或靶组织提高了治疗的功效。特别地，用本发明的微囊 泡可有效治疗传统化学疗法难以应用的转移的癌症而无副作用。此外，将所 述诊断物质特异性递送至靶细胞或靶组织使得易于准确诊断与疾病相关的 细胞或组织。

此外，只要任何靶向分子、治疗物质或诊断物质被有核哺乳动物细胞表 达，就可将其装载于微囊泡或脱落微囊泡上和/或微囊泡或脱落微囊泡内而无 需纯化。装载的物质可有效地实施其固有的功能。

此外，根据本发明的装载了治疗物质和/或诊断物质的微囊泡或脱落微囊 泡及其制备方法可用于体外和/或体内治疗和/或诊断，或者用于实验。

附图说明

图1为举例说明装载了各种物质的微囊泡的构建过程的示意图，所述物 质包括靶向分子、治疗物质、诊断物质等等。

图2为显示通过挤压由有核哺乳动物细胞构建的微囊泡的TEM图像。

图3为显示通过挤压由有核哺乳动物细胞构建的微囊泡的粒径的图。

图4为显示单核细胞中、通过挤压构建的微囊泡中以及通过超声处理构 建的微囊泡中的膜蛋白的拓扑结构的图。

图5为显示装载了环糊精的微囊泡的尺寸的图。

图6为显示装载了聚乙二醇的微囊泡的尺寸的图。

图7显示将来源于细胞的装载了miRNA的微囊泡应用于靶细胞后， miRNA递送效果的图。

图8为显示装载了VEGF受体的微囊泡结合至VEGF的能力的图，所述装 载了VEGF受体-的微囊泡来源于血管内皮细胞。

图9为显示来源于转化成表达VEGF受体的细胞的微囊泡结合至VEGF的 能力的图。

图10为显示来源于转化成表达ICAM-1的细胞的微囊泡对免疫细胞与血 管内皮细胞之间的相互作用的拮抗效应的图。

图11为显示通过挤压构建微囊泡之后，装载至微囊泡的阿霉素的水平与 所使用的阿霉素的各种浓度的图。

图12为显示通过挤压由有核细胞构建的装载了阿霉素的微囊泡的TEM 图像。

图13为显示装载至阿霉素-微囊泡的阿霉素的图像。

图14为显示来源于有核细胞的装载了氧化铁的微囊泡的照片。

图15为显示通过来源于有核细胞的微囊泡递送GFP基因的照片。

图16为显示通过来源于有核细胞的微囊泡递送RFP基因的照片。

图17为显示通过来源于有核细胞的微囊泡递送纳米颗粒Q-点(Q-dot) 的照片。

图18为显示将来源于有核细胞的微囊泡递送至细胞的照片。

图19为显示通过来源于有核细胞的微囊泡将核糖核酸酶A递送至细胞的 照片。

图20为显示通过来源于有核细胞的微囊泡将抗炎药递送至细胞后，由细 胞分泌的TNF-α和IL-6的水平的图。

图21为通过来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡将阿霉素递送至 细胞后，TNF-α-处理的HUVEC细胞的照片。

图22为显示通过来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡将阿霉素特 异性递送至TNF-α-处理的HUVEC细胞的图。

图23为显示通过来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡特异性递送 阿霉素而引起TNF-α-处理的HUVEC细胞的细胞死亡的图。

图24为显示通过来源于有核细胞的微囊泡递送各种药物而引起的细胞 死亡的图。

图25为显示通过来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡递送阿霉素 而引起细胞过表达ICAM-1或缺乏ICAM-1的效应的图。

图26为通过来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡将阿霉素特异性 递送至正在分裂的细胞的照片。

图27为显示将来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡给药于小鼠 后，癌细胞生长受到抑制的图。

图28为显示用来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡处理后，癌组 织中的内皮标记物CD31的区域的图。

图29为显示用来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡处理后，在癌 组织中用细胞增殖标记物PH-3染色的细胞计数的图。

图30为显示通过来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡将阿霉素递 送至癌组织的照片。

图31为显示在将来源于有核细胞的、装载了阿霉素的微囊泡和阿霉素给 药于小鼠后，阿霉素在脾脏和心脏中的出现的照片。

图32为显示根据装载了阿霉素的微囊泡的浓度和阿霉素的浓度的癌组 织生长的图。

图33为显示用装载了阿霉素的微囊泡和阿霉素处理后，小鼠的体重的 图。

图34为显示用装载了阿霉素的微囊泡和阿霉素处理小鼠后，血液中白细 胞计数的图。

图35为显示膜蛋白和拓扑结构在微囊泡的性能中的作用的图。

图36为显示装载了各种药物的微囊泡对癌组织生长的抑制的图。

图37为显示装载了吉西他滨和卡铂的微囊泡对人肺癌细胞生长的抑制 的图。

图38为显示用装载了阿霉素的微囊泡处理后，转移至肺部的黑色素瘤集 落的数目的图。

图39为显示用装载了阿霉素的微囊泡处理后，患上黑色素瘤的小鼠的生 存率的图。

图40显示来源于骨髓的微囊泡靶向骨髓的图像。

图41为显示通过来源于骨髓的微囊泡将阿霉素递送至骨髓的图。

图42为显示通过由转化成表达ICAM-1的有核细胞构建的微囊泡将药物 特异性递送至单核细胞的图。

图43为显示来源于细胞松弛素D-处理的单核细胞的脱落微囊泡的TEM 图像。

图44为显示装载了纳米颗粒Q-点的脱落微囊泡的TEM图像。

图45为显示由来源于单核细胞的脱落微囊泡递送阿霉素引起的特定细 胞的细胞死亡的图。

具体实施方式

本发明的一个方面设计了一种组合物，所述组合物包含来源于有核哺乳 动物细胞的亚细胞尺寸的微囊泡。

本发明中有用的有核哺乳动物细胞的例子包括：单核细胞、巨噬细胞、 树突状细胞及干细胞，但不限于上述细胞。此外，所述有核哺乳动物细胞可 选自由干细胞分化的细胞，但不限于由干细胞分化的细胞。

与术语“脱落微囊泡”不同，本文使用的术语“微囊泡”是指由有核哺 乳动物细胞人工合成的囊泡，所述“脱落微囊泡”为自发性分泌的。来源于细 胞膜的脂质双分子层形成微囊泡，所述脂质双分子层界定了与外部环境分离 的微囊泡中的内部空间。本发明的微囊泡除了膜脂外，还含有膜蛋白、核酸 和细胞成分，并且通常比细胞小，但本发明对尺寸不作限制。

脱落微囊泡为从细胞中自然脱落的微囊泡。同样地，来源于细胞膜的脂 质双分子层形成脱落微囊泡，所述脱落微囊泡含有与外部环境分离的内部空 间。所述脱落微囊泡为亚细胞尺寸的并且含有膜蛋白、核酸和细胞成分以及 膜脂。

本发明的微囊泡可使用下列方式构建：对包含有核哺乳动物细胞的悬浮 液进行挤压、超声处理、裂解、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解及化学物质处 理，但不限于以上方式。

本发明的一种实施方式中，所述微囊泡或脱落微囊泡在其膜中还包含除 了来源于有核哺乳动物细胞的细胞膜的成分以外的成分。

所述成分除了来源于细胞膜的成分以外还可包括：靶向分子、融合剂 (fusogen，膜与靶细胞融合所必须的)、环糊精和聚乙二醇。此外，可使用 多种方法添加除了来源于细胞膜的成分以外的成分，所述方法包括细胞膜的 化学修饰。

例如，微囊泡的膜成分可用巯基(-SH)或胺基(-NH₂)进行化学修饰， 或者通过将聚乙二醇结合于膜上进行化学修饰。

根据本发明的制备微囊泡或脱落微囊泡的方法还可包括膜成分的化学 修饰。

本发明的另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含装载了治 疗物质或诊断物质的亚细胞尺寸的微囊泡，所述微囊泡来源于有核哺乳动物 细胞。

本发明中有用的有核哺乳动物细胞可衍生为特定细胞或特定组织，或可 表达治疗物质或诊断物质。

此外，根据本发明的有核哺乳动物细胞可包括转化的细胞。具体而言， 所述转化的细胞可设计为表达治疗物质、诊断物质、靶向物质、融合剂或其 组合，但不限于上述物质。

本发明的一种实施方式中，所述有核哺乳动物细胞可通过物质处理或导 入遗传物质被转化一次或一次以上。

本发明的另一实施方式中，可将所述有核哺乳动物细胞转化成抑制一种 或一种以上特定蛋白的表达。

本发明的另一实施方式中，可将所述有核哺乳动物细胞转化成表达选自 以下的物质：细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、融合剂本身及其组合。

本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含装载了治疗 物质或诊断物质的亚细胞尺寸的脱落微囊泡，所述脱落微囊泡来源于有核哺 乳动物细胞。

本发明并不对装载至微囊泡或脱落微囊泡的物质给予特定限制。例如， 所述物质可为用于治疗和/或诊断的物质，或者可为由有核哺乳动物细胞本身 表达的蛋白或由转化的有核细胞本身表达的蛋白。如有必要，上述装载的物 质可不为细胞本身的物质，而可为外源物质。也就是说，所述治疗物质和/ 或诊断物质可为来源于有核细胞的物质或者从细胞外部导入的物质。此外， 所述装载的物质可为同质性的或异质性的。

本发明的另一实施方式中，所述微囊泡或脱落微囊泡可由表达选自以下 物质的细胞或由转化为表达选自以下物质的细胞制备：细胞因子、生长因子、 抗体、靶向蛋白、融合剂本身及其组合，然而，本发明中的细胞不限于上面 举例说明的细胞。此外，所述物质可使用物理方法、化学方法和/或生物学方 法装载至微囊泡或脱落微囊泡的表面，但不限于上述方法。

本发明的微囊泡或脱落微囊泡可以下述各种方式装载各种外源治疗物 质和/或诊断物质。

首先，可由已经装载了目标治疗物质或诊断物质的细胞制备微囊泡。例 如，当细胞在包含目标治疗物质或诊断物质的培养基中培养时，它们可包含 其中的物质。可选地，所述物质可通过电穿孔导入细胞内。通过超声处理、 挤压或机械降解从包含所述物质的细胞中脱落的或由包含所述物质的细胞 构建的微囊泡装载了所述物质。

其次，所述物质可在微囊泡的构建过程中装载至微囊泡内。例如，当包 含目标物质的细胞悬浮液通过亚细胞尺寸的过滤器挤压时，由此形成的微囊 泡装载了所述物质。

此外，可选地，微囊泡或脱落微囊泡可在它们构建后或形成后装载目标 物质。例如，所述装载可通过用所述物质孵育微囊泡或脱落微囊泡的悬浮液 而实现，或可通过电穿孔使所述物质进入已经制备的微囊泡或脱落微囊泡内 而实现。

然而，本领域技术人员应当意识到将目标物质装载至微囊泡或脱落微囊 泡中并不限于上面举例说明的方法。

本发明有用的治疗物质和/或诊断物质包括：抗癌剂、抗炎剂、血管生成 抑制剂、肽、蛋白、毒素、核酸、珠、微颗粒和纳米颗粒，但本发明并不因 此而受到限制。

所述核酸的例子包括：DNA、RNA、适体LNA(锁核酸)、PNA(肽核 酸)和吗啉基，但不限于上述例子。

示例性的、非限制性的纳米颗粒的例子包括：氧化铁、金、纳米碳管或 磁珠。

本发明的一种实施方式中，所述治疗物质和/或诊断物质可为荧光分子， 但不仅限于此。例如，所述荧光分子可为荧光蛋白或量子点(Q-点)。

本发明的另一实施方式中，所述治疗物质和/或诊断物质可为抗癌剂。

本发明的微囊泡或脱落微囊泡可被导向特定细胞或特定组织。所述特定 组织可包括：血管、癌组织或炎症组织，但不限于上述组织。

如本文所使用的术语“癌症”是指一组不同的疾病，所述疾病的特征为 由细胞程序性死亡的破坏而导致的不受控的细胞生长以及向邻近组织的浸 润。根据本发明的待治疗的目标可选自下列癌症：诸如肺癌、喉头癌、胃癌、 大肠/直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、肾癌、 皮肤癌之类的来源于上皮细胞的癌症，诸如骨癌、肌肉癌、脂肪癌、纤维细 胞癌之类的来源于结缔组织细胞的癌症，诸如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓 瘤之类的来源于造血细胞的血液癌症，以及神经瘤(一种神经组织肿瘤)， 但不限于上述癌症。

如本文所使用的术语“血管疾病”是指一组不同的疾病，在所述疾病中， 由代谢、感染、毒素或免疫引起在血管内或血管壁中产生功能异常。根据本 发明的待治疗的目标可选自下列血管疾病：动脉硬化(或动脉粥样硬化)， 心绞痛，急性心肌梗塞，中风，血管性痴呆，诸如缺血性血管疾病之类的代 谢性血管疾病，以及诸如败血症、弥漫性血管内凝血、血栓/栓塞、血管炎、 肾炎、急性呼吸窘迫综合征、肺气肿之类的感染性、毒性或免疫性血管疾病， 但不限于上述疾病。

本文所使用的术语“炎症”是指由下列原因引起的综合征或症状，所述 综合征或症状包括：由组织内体液的非正常积聚导致的水肿、由血管扩张引 起的充血、由发热源和血管舒张导致的发热，以及花生四烯酸代谢物诱导的 疼痛。可根据时间将炎症分为急性炎症、亚急性炎症、慢性炎症，并且可根 据病理生理学情况分为传染性、过敏性、自身免疫性、毒性、代谢性和创伤 性炎症性疾病。根据本发明的待治疗的目标可选自：呼吸道炎症性疾病(例 如，鼻炎、鼻窦炎、中耳炎、鼻咽炎、喉炎、支气管炎、哮喘、慢性阻塞性 肺部疾病、支气管扩张、细支气管炎、肺炎、肺纤维化等等)、消化系统的 炎症性疾病(例如，口腔炎、食管炎、胃炎、消化性溃疡、肠易激综合征、 溃疡性结肠炎、胆囊炎、胆管炎、胰腺炎、肝炎等等)、皮肤炎症(例如， 过敏性皮炎、牛皮癣等等)、心血管炎症性疾病(例如，心内膜炎、心肌炎、 心包炎、血管炎、动脉硬化、败血症等等)、内分泌系统的炎症性疾病(例 如，甲状腺炎、甲状旁腺炎、糖尿病等等)、泌尿生殖系统的炎症性疾病(例 如，肾炎、肾病、间质性肾炎、睾丸炎、卵巢炎、子宫内膜炎、阴道炎等等)、 肌肉骨骼系统的炎症性疾病(例如，类风湿关节炎、脊椎关节炎、骨关节炎、 痛风、全身性红斑狼疮、全身性硬化症、肌病、舍格伦(Sjogren)综合症、 白塞氏病、抗磷脂综合征等等)、神经精神系统的炎症性疾病(例如，血管 性痴呆、阿尔茨海默氏病、退行性脑部疾病、抑郁症、精神分裂症等等)， 但不限于上述疾病。

除了选自抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽、蛋白、毒素、核酸、 珠、微颗粒、纳米颗粒及其组合的活性成分以外，本发明的药物组合物还可 包含药学上可接受的载体，例如，盐水、无菌水、林格氏(Ringer’s)溶液、 缓冲盐水、环糊精、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、丙三醇、乙醇、脂质体 或其组合。如有必要，所述药物组合物还可包含诸如抗氧化剂、缓冲剂之类 的典型添加剂。此外，可借助于稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/ 或润滑剂将所述药物组合物配制成诸如水溶液、悬浮液、乳剂之类的注射剂、 丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。此外，所述药物组合物可根据本领域熟知的方 法或根据在Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company， Easton PA中公开的方法配制成合适的剂型。所述药物组合物的配制并无特定 限制。优选地，所述药物组合物可配制成注射剂形式或可吸入形式。

本发明的药物组合物的给药并无任何特定限制。所述药物组合物可口服 给药或肠胃外给药，例如，静脉内给药、皮下给药、腹膜内给药、经吸入给 药或局部给药。本发明的药物组合物中的活性成分的量可根据各种因素而改 变，所述各种因素包括患者体重、年龄、性别及健康状况、饮食、给药时间、 给药途径、排泄率、疾病严重性等等。术语每日剂量是指本发明的治疗有效 的成分的量，所述治疗有效的成分的量当给药于有此需要的受治者时足以减 轻疾病的症状。本发明的药物组合物中活性成分的合适剂量可取决于所装载 的化合物的种类、疾病严重性、需要治疗的受治者的症状，并且可由本领域 技术人员确定。例如，本发明的组合物的合适剂量可根据患者体重、年龄、 性别及健康状况、给药途径及疾病严重性而改变，且通常为0.1mg/日至1000 mg/日，并且，优选地，为1mg/日至500mg/日。本发明的药物组合物的总有 效量可以单剂量给药于患者，或者可通过分级治疗方案给药，在所述分级治 疗方案中，在一个更长的延长时间段内以多剂量给药。

本文所使用的术语“受治者”是指需要治疗癌症、血管疾病或炎症性疾 病的动物，包括人或诸如灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、奶牛之类的非 人类哺乳动物。

本发明的又一方面提供一种用于递送治疗物质和/或诊断物质的组合物， 所述组合物包含本发明的微囊泡。

所述组合物将治疗物质和/或诊断物质特异性递送至组织或细胞。

本发明的又一方面还设计了一种用于递送治疗物质和/或诊断物质的组 合物，所述组合物包含本发明的微囊泡。

本发明的另一方面设计了一种用于递送治疗物质或诊断物质的组合物， 所述组合物包含来源于有核哺乳动物细胞的亚细胞尺寸的脱落微囊泡。

本发明的另一方面设计了一种治疗物质或诊断物质的递送系统，所述递 送系统包含来源于有核哺乳动物细胞的脱落微囊泡。

本发明另一方面设计一种由有核哺乳动物细胞制备装载了治疗物质或 诊断物质的微囊泡的方法。

在一种实施方式中，本发明的方法包括：对有核哺乳动物细胞的悬浮液 进行处理以构建微囊泡，所述处理选自：挤压、超声处理、细胞裂解、均匀 化、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解及化学物质处理；从所述悬浮液中分离所 述微囊泡；以及用治疗物质或诊断物质孵育所述微囊泡的分离物的悬浮液。

在另一实施方式中，本发明的方法包括：用治疗物质或诊断物质孵育所 述有核哺乳动物细胞的悬浮液，从而将所述治疗物质或诊断物质装载至所述 有核哺乳动物细胞；以及，对所述悬浮液进行处理以构建微囊泡，所述处理 选自：挤压、超声处理、细胞裂解、均匀化、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解 及化学物质处理。

在另一实施方式中，本发明的方法包括：将治疗物质或诊断物质加至所 述有核哺乳动物细胞的悬浮液，从而产生混合的悬浮液；以及对所述混合的 悬浮液进行处理以构建微囊泡，所述处理选自：挤压、超声处理、细胞裂解、 均匀化、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解及化学物质处理。

本发明的又一方面设计了一种由有核哺乳动物细胞制备装载了治疗物 质或诊断物质的脱落微囊泡的方法。

在一种实施方式中，所述方法包括：从所述有核哺乳动物细胞的悬浮液 中分离脱落微囊泡；以及在存在所述治疗物质或诊断物质的条件下，孵育所 述脱落微囊泡的分离物的悬浮液。

在另一实施方式中，所述方法包括：在存在所述治疗物质或诊断物质的 条件下，培养所述有核哺乳动物细胞的悬浮液，从而将所述治疗物质或诊断 物质装载至所述有核哺乳动物细胞；以及从培养物中分离装载了所述治疗物 质或诊断物质的脱落微囊泡。

根据本发明的制备装载了治疗物质和/或诊断物质的微囊泡或脱落微囊 泡的方法还可包括从所述微囊泡或脱落微囊泡的悬浮液中分离装载了所述 治疗物质和/或诊断物质的微囊泡或脱落微囊泡。

该分离步骤可使用选自以下的步骤实施：密度梯度法、超速离心法、过 滤法、透析法及自由流动电泳法。

本发明的制备方法还可包括将细胞膜成分以外的成分加至微囊泡膜中。 所述成分包括环糊精和聚乙二醇。

此外，本发明的制备方法还可包括对所述微囊泡的膜成分进行化学修 饰。所述化学修饰可通过与上述方法相同的方法实施。

此外，本发明的制备方法还可包括除去其膜在拓扑结构上与有核哺乳动 物细胞的膜不同的微囊泡或脱落微囊泡。

本发明的另一方面设计了一种将治疗物质或诊断物质递送至特定细胞 或特定组织的方法，所述方法包括使用来源于有核哺乳动物细胞的、装载了 治疗物质或诊断物质的亚细胞尺寸的微囊泡。本发明的微囊泡可用于将治疗 物质或诊断物质递送至特定细胞或特定组织。

本发明的一种实施方式中，可将两种或两种以上的治疗物质或诊断物质 递送至特定细胞或特定组织。

例如，两种或两种以上的治疗物质或诊断物质可共同装载至相同的微囊 泡中。

本发明的另一实施方式中，装载了一种治疗物质或诊断物质的微囊泡、 装载了两种或两种以上的治疗物质或诊断物质的微囊泡或其组合可用于递 送所述治疗物质或诊断物质。例如，可同时给药两种或两种以上不同的微囊 泡。

本发明的另一实施方式中，可顺序给药选自以下的两种或两种以上不同 的微囊泡：装载了一种治疗物质或诊断物质的微囊泡、装载了两种或两种以 上治疗物质或诊断物质的微囊泡及其组合。

本发明的另一方面设计了一种将治疗物质和/或诊断物质递送至特定细 胞或特定组织的方法，所述方法包括使用来源于有核哺乳动物细胞的、装载 了治疗物质或诊断物质的脱落微囊泡。

本发明的另一方面设计了一种治疗疾病或诊断疾病的方法，所述方法包 括使用来源于有核哺乳动物细胞的、装载了治疗物质或诊断物质的亚细胞尺 寸的微囊泡，从而将所述治疗物质或诊断物质递送至特定细胞或特定组织。

本发明的另一方面设计了一种治疗疾病或诊断疾病的方法，所述方法包 括使用来源于有核哺乳动物细胞的、装载了治疗物质或诊断物质的亚细胞尺 寸的脱落微囊泡，从而将所述治疗物质或诊断物质递送至特定细胞或特定组 织。

本发明的另一方面设计了一种用于疾病诊断的试剂盒，所述试剂盒包含 来源于有核哺乳动物细胞的、装载了作为活性成分的引物、探针、反义核酸 或抗体的亚细胞尺寸的微囊泡或脱落微囊泡。

[使用微囊泡或脱落微囊泡递送物质]

本发明中，可采用来源于靶向特定组织的细胞的微囊泡或脱落微囊泡， 或可采用来源于表达靶向蛋白的转化的细胞的微囊泡或脱落微囊泡。在一种 实施方式中，所述微囊泡或脱落微囊泡可来源于表达融合剂的转化的细胞。

已知人体免疫系统的单核细胞及其衍生物(巨噬细胞和树突状细胞)及 其干细胞被导向癌组织和炎症组织。因此，将来源于单核细胞、巨噬细胞、 树突状细胞或其干细胞的微囊泡或脱落微囊泡导入癌组织或炎症组织中。此 外，来源于细胞的微囊泡或脱落微囊泡可被导向特定细胞或特定组织，所述 细胞转化为表达与在特定细胞或特定组织上表达的底物选择性结合的蛋白。 本发明中，装载治疗物质或诊断物质后，由这些细胞构建的微囊泡或脱落微 囊泡可用于将所述物质递送至靶细胞、靶组织或血液中。

存在涉及将单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和干细胞导向特定组织的 多种质膜蛋白。例如，在单核细胞的表面上存在包括诸如LFA-1(白血球功 能相关抗原-1)和Mac-1(巨噬细胞-1抗原)之类的整合素的细胞粘附分子。 这些细胞粘附分子可结合于血管细胞上的诸如ICAM-1(胞间粘附分子-1)和 VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)之类的其他细胞粘附分子。LFA-1与ICAM-1 的相互作用使单核细胞得以穿过血管内皮细胞，从而所述单核细胞可被导向 炎症组织或癌组织。

当细胞转化成表达对癌症具有特异性或对目标组织具有特异性的质膜 蛋白时，细胞可被导向所述癌症或所述组织(例如血管组织、癌组织或炎症 组织等等)。例如，ERBB2在乳腺癌细胞表面上过表达。通过将T细胞转化 成表达修饰的T细胞受体(TCR)，可使T细胞靶向癌细胞。如果将T细胞转 化成表达融合蛋白，在所述融合蛋白中，TCR在其外部结构域处与识别 ERBB2的抗体融合并且在其胞浆结构域处与负责胞内信号转导的CD3ζ (zeta)融合，那么该T细胞可被导向乳腺癌组织。此外，如果将T细胞转化 成表达融合蛋白，在所述融合蛋白中，识别大量在癌组织中发现的癌胚抗原 (CEA)的抗体与CD3ζ融合，那么该T细胞可被导向大肠癌组织、胰脏癌组 织和肺癌组织。

用于将物质递送至靶组织或靶细胞的细胞可受所述物质极大地影响。例 如，由于阿霉素毒性过高，装载了该药物的载体细胞可死亡。

如果使用来源于细胞的微囊泡或脱落微囊泡而不是细胞本身作为载体 则可避免该问题。来源于细胞的微囊泡或脱落微囊泡保留了与细胞的膜成分 几乎相同的膜成分，从而它们可被导向所述细胞靶向的特定组织或特定细 胞。如有必要，在构建微囊泡或脱落微囊泡的过程中，可采用核酸酶以从微 囊泡或脱落微囊泡中除去递送治疗物质或诊断物质所不必要的核酸。

[微囊泡或脱落微囊泡及其制备]

本发明中，术语“微囊泡”指的是由有核哺乳动物细胞人工合成的亚细胞 尺寸的囊泡，所述囊泡通过来源于所述细胞的脂质双分子层界定，并保留了 与所述细胞相同的膜蛋白、核酸和细胞质成分，然而，本发明中的微囊泡不 限于以上举例说明的微囊泡。本发明中，术语“脱落微囊泡”是指从有核哺 乳动物细胞中自然脱落的亚细胞尺寸的囊泡，因而所述“脱落微囊泡”由来 源于细胞的脂质双分子层界定，并且保留了与所述细胞相同的膜蛋白、核酸 和细胞质成分。

微囊泡可易于从细胞中以与脂质体相似的各种尺寸构建并装载各种待 递送的治疗物质或诊断物质。因此，微囊泡可用于单独疗法或联合疗法或诊 断或治疗和诊断这两者(治疗诊断、药物诊断)。本文中，当封装时，待递 送的物质可存在于微囊泡或脱落微囊泡内，当结合于受体时，待递送的物质 可存在于微囊泡或脱落微囊泡的表面，或者当如同跨膜蛋白一样被包埋或镶 嵌于脂质双分子层中时，待递送的物质可存在于脂质双分子层中。

得益于EPR(增强渗透和滞留)效应，一般而言，与在正常组织中相比， 尺寸为100nm或大于100nm的分子可在癌组织中积累更长的时间段。因此， 装载了药物尺寸为100nm或大于100nm的微囊泡在诊断和治疗上有利，因为 所述微囊泡在癌组织中可停留更长时间，从而增强治疗效果或诊断效果。另 一方面，当吸入颗粒时，基于肺部的结构，只有尺寸为1μm或低于1μm的颗 粒得以到达肺泡。如果将物质(例如，用于治疗哮喘的炎症抑制剂)装载至 尺寸小于1μm的微囊泡中，那么，所述物质可被递送至肺组织。如所描述的， 根据所装载的物质将应用的组织，可构建各种尺寸的微囊泡。优选地，本发 明的微囊泡尺寸为10nm至10μm。

为了将治疗物质和/或诊断物质给药于受治者，所述治疗物质和/或诊断 物质可装载至本发明的微囊泡或脱落微囊泡。就这点而言，所述微囊泡或脱 落微囊泡可来源于自体细胞。如果微囊泡或脱落微囊泡来源于异源细胞，由 于MHC(主要组织相容性复合体)的不同，所述微囊泡或脱落微囊泡可引起 免疫反应。相反，来源于自体细胞的微囊泡或脱落微囊泡并不诱导免疫反应。 然而，如果MHC具有相容性，可使用异源细胞或来源于所述异源细胞的微囊 泡或脱落微囊泡而不引起免疫反应。此外，在诱发免疫反应的情况下，微囊 泡或脱落微囊泡可与免疫抑制剂联合使用。

本发明中，可由所有种类的细胞构建微囊泡或脱落微囊泡，特别地，可 由通过转化可被导向诸如特定细胞或特定组织之类的标靶的有核哺乳动物 细胞构建微囊泡或脱落微囊泡。例如，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细 胞和间叶干细胞之类的体外培养的体外细胞，以及从身体组织获取的体内细 胞(例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、来源于骨髓或来源于脂肪的间 叶干细胞、其他干细胞、取自癌组织或炎症组织的细胞等等)可为可构建本 发明的微囊泡或脱落微囊泡的来源。

对于在将物质递送至特定组织中的应用而言，可由指向特定组织的完整 细胞或转化的细胞来构建微囊泡或脱落微囊泡。例如，由单核细胞、巨噬细 胞、树突状细胞或干细胞构建的微囊泡或脱落微囊泡可靶向癌组织或肿瘤组 织。此外，当由其中指向特定组织的蛋白被上调的细胞和/或其中涉及非特异 性导向的蛋白被下调的细胞构建时，微囊泡或脱落微囊泡可有效地用于将治 疗物质或诊断物质递送至目标组织，例如癌组织或肿瘤组织。

细胞的转化可通过使用本领域已知的典型方法实现，例如，通过刺激细 胞实现或通过将外源基因导入细胞对目标蛋白的表达进行修饰(例如，上调 或下调)来实现。特定刺激可诱导目标蛋白的表达的变化。例如，在用TNF-α 处理时，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在质膜中过表达ICAM-1[J.Exp.Med. 177；1277-1286(1993)]。在用PMA(佛波醇12-豆蔻酰13-乙酯)处理的单核 细胞中，膜蛋白LFA-1被激活[J.Exp.Med.163；1132-1149(1986)]。外源基因 的导入可诱导目标蛋白的表达或抑制。本文中，使用磷酸钙沉淀法[Current  Protocols in Cell Biology 20.3.1-20.3.8(2003)]、脂质体介导法[PNAS.84(21)； 7413-7417(1987)]、电穿孔法[Nucleic Acids Research.15(3)1311-1326 (1987)]、显微注射法[Mol Cell Biol.2(9)；1145-1154(1982)]、超声介导法 [Human Gene Therapy.7(11)；1339-1346(1996)]或本领域已知的其他方法，将 质粒DNA、RNA或病毒导入细胞中[PNAS.90(18)；8392-8396(1993)]。

将细胞转化成表达能与癌细胞、癌组织或血管或炎症组织结合的蛋白或 抗体(单独地或作为在其表面的融合蛋白)后，可由所述细胞构建微囊泡或 脱落微囊泡。此外，可由表达治疗物质和/或诊断物质的细胞，或由转化成表 达治疗物质和/或诊断物质的细胞制备微囊泡或脱落微囊泡。当然，其中表达 两种或两种以上治疗物质和/或诊断物质的细胞或转化的细胞可用作构建微 囊泡或脱落微囊泡的来源。为了下调目标蛋白的表达，可采用miRNA、 siRNA、反义RNA、LNA或PNA。当由细胞构建的微囊泡或脱落微囊泡指向 两个标靶时，所述细胞可通过下述方式转化：抑制一个或一个以上特定蛋白 的表达以减少细胞对两个标靶中的一个的导向。因此，来源于转化的细胞的 微囊泡或脱落微囊泡在物质递送方面的特异性被提高。可选地，可使用经过 两次或两次以上转化的细胞。例如，在用作构建微囊泡或脱落微囊泡的来源 前，可对初始转化子进行第二次转化。

用于物质递送的微囊泡可为从单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细 胞中自然脱落的微囊泡。这些脱落微囊泡可获自装载了治疗物质或诊断物质 的细胞，或者可在分离后装载治疗物质或诊断物质。细胞松弛素D、LPA(溶 血磷脂酸)、凝血酶、ATP(三磷酸腺苷)或KCl的处理促进脱落微囊泡从 细胞中分泌。细胞松弛素D改变肌动蛋白的结构，从而促进脱落微囊泡从细 胞膜中分泌。在细胞悬浮液流中，细胞和所述悬浮液相对运动以促进脱落微 囊泡的形成。然而，这些方法并不限制本发明。

根据本发明的微囊泡可使用各种机械方法、电学方法或化学方法来构 建。在上述方法中，可使用利用渗透作用的细胞裂解、电穿孔、超声处理、 均匀化、洗涤剂处理、冷冻-解冻、挤压、机械降解和化学物质处理，但这些 方法并不限制本发明。在机械降解方法中，将细胞溶液与金属珠、陶瓷珠或 足够硬的塑料珠一起震荡。在挤压的情况中，迫使细胞通过从大孔径开始并 下落至小孔径的方式顺序穿过过滤器。例如，使细胞顺序穿过孔径分别为10 μm→5μm→1μm的三个过滤器以形成微囊泡。

[治疗物质或诊断物质]

本发明中，可使用细胞或转化的有核哺乳动物细胞表达的物质，或者有 核哺乳动物细胞不表达的外源物质，然而，本发明的治疗物质或诊断物质并 不限于以上举例说明的治疗物质或诊断物质。包括蛋白或肽、核酸、脂质和 代谢物在内的各种物质可用作可装载至本发明的微囊泡或脱落微囊泡的治 疗物质或诊断物质，但不限于此，所述各种物质均来源于有核哺乳动物细胞。

本发明中有用的可装载的蛋白或肽的例子包括诸如VEGF(血管内皮生 长因子)、EGF(上皮生长因子)等等之类的生长因子、诸如IL-1、IFN-γ、 IL-10等等之类的细胞因子、抗体、受体和荧光蛋白，但不限于以上例子。所 述蛋白或肽可在细胞内表达，或者在质膜上展示。此外，所述蛋白或肽的整 体或活性位点可单独地表达或作为融合蛋白表达。已知，由于局部浓度较高， 在质膜上展示的蛋白或肽的活性比在细胞内表达时的活性更高。质膜上的蛋 白或肽可作为配体起作用，从而触发信号转导，或者作为拮抗剂起作用，从 而抑制各种配体的功能。

可装载至本发明的微囊泡或脱落微囊泡的核酸的例子包括DNA、 miRNA、siRNA、反义RNA和正义RNA，但不限于上述例子。这些核酸可用 来引起正义效应、反义效应、RNA干扰或者蛋白功能的抑制。

抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽、蛋白、毒素、核酸、珠、微粒 和纳米颗粒可用作可装载至微囊泡或脱落微囊泡的外源治疗物质或诊断物 质，但不限于此。

抗体是用于抑制癌症的生长和转移的药物的通用术语。大多数抗癌剂起 阻断癌细胞的复制、转录和/或翻译的作用。用于本发明的抗癌剂的种类不受 特定限制。在考虑到癌细胞的种类、抗癌剂的吸收率(治疗持续时间、给药 途径等等)、肿瘤的位置、肿瘤的尺寸等等的一般原则下选择抗癌剂。本发 明有用的抗癌剂的例子包括诸如二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸、 芥末、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫斯汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、 链脲霉素、白消安、塞替派、顺铂和卡铂之类的DNA烷化剂，诸如更生霉素 (放线菌素D)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、 普卡霉素、丝裂霉素和C争光霉素之类的抗癌抗生素，以及诸如长春新碱、 长春花碱、紫杉醇、多西他赛、柔红霉素、紫杉酚、长春碱、强的松、顺铂、 赫赛汀、美罗华、依托泊苷、替尼泊苷、拓扑替康和伊立替康之类的植物碱。 此外，可使用本领域已知的放射性物质。然而，用于本发明的抗癌剂并不限 于所述例子。

此外，可装载至本发明的微囊泡或脱落微囊泡的抗炎剂选自：地塞米松、 吲哚美辛、布洛芬、丙酸氯倍他索、双醋酸二氟拉松、卤倍他索丙酸酯、安 西奈德、醋酸氟轻松、糠酸莫米他松、去羟米松、双氯芬酸和吡罗昔康，但 不限于以上抗炎剂。

如本文所使用的术语血管生成抑制剂是指起到抑制从已形成的血管中 生长出新血管的作用的药物。大多数血管生成抑制剂具有抑制癌症生长和转 移以及抑制炎症反应的功能。可用作本发明的治疗物质的血管生成抑制剂的 种类不受特定限制。

装载至本发明的微囊泡或脱落微囊泡的治疗物质或诊断物质可包括蛋 白或肽。例如，可采用RNase A、诸如VEGF和EGF之类的生长因子、诸如IL-1、 IFN-γ和IL-10之类的细胞因子、抗体治疗剂、DNase，以及抑制癌细胞的生 长和转移并抑制炎症反应的各种蛋白或肽，但不限于此。

此外，装载至本发明的微囊泡或脱落微囊泡的治疗物质或诊断物质可包 括毒素。术语毒素是指在活细胞或有机体中产生的有毒物质，当接触所述有 毒物质或所述有毒物质被身体组织吸收时可引发疾病。使用毒素可诱导细胞 死亡。可用作本发明的治疗物质的毒素的种类不受特定限制。

本发明中，装载了编码荧光蛋白的核酸或各种荧光分子的微囊泡或脱落 微囊泡可用于诊断。当被设计成靶向特定细胞或特定组织的微囊泡或脱落微 囊泡装载了携带编码荧光蛋白的基因的质粒DNA并且当所述微囊泡或脱落 微囊泡被导入体内时，由荧光蛋白发出的荧光信号使靶细胞或靶组织存在的 位置能被识别。同样地，荧光量子点或其他各种荧光分子可装载至微囊泡或 脱落微囊泡并且用于探测特定细胞或特定组织在体内的位置。换言之，由靶 细胞或靶组织产生的荧光可用于诊断。此外，因为荧光发射量子点诱发细胞 凋亡，因此所述荧光发射量子点可用于疾病的治疗。

除了荧光分子外，可装载至微囊泡或脱落微囊泡的治疗物质或诊断物质 可通过微粒或纳米颗粒来举例说明。例子包括氧化铁颗粒、金颗粒和纳米碳 管，但并不限于以上例子。磁珠可用作治疗物质或诊断物质并可装载至微囊 泡或脱落微囊泡内。诸如氧化铁之类的磁性颗粒可用作MRI的图像造影剂。 此外，可采用与纳米颗粒结合的核酸或蛋白。也可利用诊断性的放射性物质。

本发明的微囊泡或脱落微囊泡可递送两种或两种以上的不同物质。例 如，同时装载两种或两种以上不同物质的微囊泡或脱落微囊泡可用于递送所 述物质。可选地，可联合采用单独地或联合地装载了不同物质的微囊泡或脱 落微囊泡，从而可递送两种或两种以上不同物质。就递送三种不同物质而言， 例如，可将所述三种不同物质分别装载至第一微囊泡、第二微囊泡和第三微 囊泡。另一方面，同时装载两种不同物质的第四微囊泡和装载另一不同物质 的第五微囊泡可用于递送所述三种不同物质。所述第一微囊泡、第二微囊泡 和第三微囊泡可同时地或顺序地使用。同样地，所述第四微囊泡和第五微囊 泡可同时地或顺序地使用。

存在从其他分子或其他细胞组分中分离微囊泡或脱落微囊泡的各种方 法，所述方法的例子包括密度梯度法、超速离心法、过滤法、透析法和自由 流动电泳法，但不限于以上方法。

密度梯度处理(分离具有不同密度的物质的最常用的处理方法之一)可 用来分离本发明的微囊泡或脱落微囊泡，因为它们的密度不同于游离分子的 密度。就密度梯度处理的使用而言，介质可选自：聚蔗糖、甘油、蔗糖和 OptiPrep^TM，但不限于以上介质。利用装载了治疗物质或诊断物质的微囊泡 和未装载治疗物质或诊断物质的微囊泡之间的密度差异可将其彼此分离。密 度梯度处理可与离心或电泳联合使用。还可通过凝胶过滤或超滤来分离微囊 泡或脱落微囊泡。可采用透析代替过滤来除去小分子。此外，自由流动电泳 在分离本发明的微囊泡或脱落微囊泡方面有用。

根据本发明的目的，使用前可选择某一尺寸范围内的微囊泡或脱落微囊 泡。某一尺寸范围内的微囊泡或脱落微囊泡的选择可在将治疗物质或诊断物 质装载至所述微囊泡或脱落微囊泡内之前、之时或之后进行。

本发明中，可构建部分膜组分被修饰的微囊泡或脱落微囊泡。例如，由 融合蛋白和细胞的混合物构建微囊泡时，所述融合蛋白可至少部分暴露于所 述微囊泡上。微囊泡可通过用聚乙二醇包被而转化成隐形微囊泡。将环糊精 加至微囊泡中可减少所述微囊泡的非特异性靶向。由于环糊精同时表现出亲 水性和疏水性，当其结合于微囊泡表面时，可具有阻断脂质之间非特异性结 合的作用。可对所述微囊泡或脱落微囊泡进行化学修饰。例如，在由如下细 胞构建微囊泡后，可将各种分子通过化学方法键合于蛋白暴露区的半胱氨酸 残基的巯基基团上，所述细胞为其膜或跨膜蛋白至少部分暴露于外侧的细 胞。

根据本发明的装载了治疗物质和/或诊断物质的微囊泡或脱落微囊泡及 其制备方法可用于将所述物质体外和/或体内递送至靶细胞或靶组织。例如， 装载了酶或治疗物质和/或诊断物质的来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡及 其制备方法可用于体外实验。此外，根据通过体外实验获取的数据，可将微 囊泡及其制备方法应用于体内，从而将疾病细胞变成可治疗的细胞。

图1举例说明构建装载了治疗物质和诊断物质的微囊泡的步骤。

图2为显示由单核细胞通过挤压构建的微囊泡的TEM(透射电子显微镜) 图像。如该TEM图像中可见的，微囊泡被脂质双分子层界定，并且通常是尺 寸为100nm至200nm的球形。

使用动态光散射(DLS)粒径分析仪测量微囊泡的尺寸后，实施例1中 通过挤压构建的微囊泡的粒径分布在图3中图示表示。微囊泡的尺寸为200 nm至300nm，平均尺寸为250nm，该尺寸与图2的TEM图像的测量一致。

如以下方法所测量的，发现实施例1中由单核细胞通过挤压构建的微囊 泡保留了与作为来源的质膜的拓扑结构相同的拓扑结构。用胰蛋白酶处理实 施例1中由单核细胞通过挤压构建的微囊泡和实施例2中由单核细胞通过超 声处理构建的微囊泡，从而消化膜蛋白的外部暴露区。胰蛋白酶在高温下变 性后，所述微囊泡被裂解，从而使所有内在蛋白和膜蛋白暴露在溶液中。然 后用对LFA-1的胞外结构域具有特异性或对胞内蛋白β-肌动蛋白具有特异性 的抗体处理所述溶液。这些免疫结果在图4中显示，其中，‘+’和‘-’分 别代表用胰蛋白酶处理和未用胰蛋白酶处理。胰蛋白酶处理后在通过挤压构 建的微囊泡中，尽管LFA-1的胞外结构域消失，但是肌动蛋白的量减少。即 使部分质膜内部翻出，LFA-1的胞外结构域可至少部分指向内部并不会被胰 蛋白酶消化，这导致诱发对抗体的免疫反应。然而，未检测出对LFA-1抗体 的免疫反应表明微囊泡的LFA-1的胞外结构域指向外部。从该结果可推测， 由细胞通过挤压构建微囊泡时，所述细胞的膜蛋白位于微囊泡中，从而所述 蛋白的胞外结构域指向所述微囊泡的外部。因此，所述微囊泡的膜拓扑结构 与细胞中的膜拓扑结构相同。

参照图4，不像通过挤压处理的微囊泡那样，通过超声处理构建的微囊 泡即使用胰蛋白酶处理后也显示出对LFA-1抗体的免疫反应。因此，通过超 声处理构建时，部分微囊泡的拓扑结构可与作为其来源的细胞的拓扑结构相 反。

微囊泡可使用可诱导膜拓扑反转的方法构建。就这点而言，可只选择与 作为其来源的细胞的膜拓扑结构相同的那些微囊泡。其中细胞质结构域暴露 于外部的微囊泡可使用识别膜蛋白的细胞质结构域的抗体除去。也就是说， 质膜内部翻出的微囊泡被除去，仅仅保留膜蛋白的胞外结构域被定位成指向 外部的微囊泡。

图43为显示用细胞松弛素D处理后，从细胞中自发分泌的脱落微囊泡的 TEM图像。

通过以下实施例可更好地理解本发明，所述实施例是为了举例说明，而 无意限制本发明。

实施例

实施例1：通过挤压制备微囊泡

图1为说明由有核哺乳动物细胞(不论是否转化)制备装载了各种物质的 微囊泡的步骤的示意图，所述各种物质包括靶向物质、治疗物质和诊断物质。

根据图1示意图中举例说明的步骤，由单核细胞或巨噬细胞制备微囊泡。 从图1所建议的方法中选择挤压法和密度梯度法。

将单核细胞U937(ATCC No.CRL-1593.2)或巨噬细胞Raw264.7(ATCC  No.TIB-71)以5×10⁶个细胞/ml的密度重悬于3mL PBS(磷酸缓冲盐水)中。 使该细胞悬浮液依次通过孔径为10μm、5μm和1μm的膜滤器，每个膜滤器通 过三次。在5mL的离心管中依次加入1mL 50％OptiPrep、1mL 5％OptiPrep 和3mL从膜滤器滤出的细胞悬浮液。以100,000×g的速度超速离心2小时，在 50％OptiPrep与5％OptiPrep之间形成一层微囊泡。

实施例2：通过超声处理制备微囊泡

根据图1示意图中举例说明的步骤，由单核细胞或巨噬细胞制备微囊泡。 从图1所建议的方法中选择超声法和密度梯度法。

将单核细胞或巨噬细胞以2×10⁷个细胞/ml的密度悬浮于3mL PBS中，然 后用超声发生器(UP 400S，Hielscher)以50％的振幅和0.5的周期超声处理30 个循环，然后用水浴超声发生器处理30min。在5mL超速离心管中依次加入1 mL 50％OptiPrep、1mL 5％OptiPrep和3mL超声处理的细胞悬浮液。以100,000 ×g的速度超速离心2小时，在50％OptiPrep与5％OptiPrep之间形成一层微囊 泡。

实施例3：分析来源于单核细胞的微囊泡的性质

使实施例1中由单核细胞生成的微囊泡吸附至辉光放电的碳包被的铜网 持续3min。用蒸馏水洗涤铜网并用醋酸铀酰染色1min，然后在JEM101电子 显微镜(Jeol，日本)下观察。电子显微图像在图2中显示。

如图2的透射电子显微镜(TEM)图像所示，通过挤压由单核细胞构建的 微囊泡由脂质双分子层构成，并且普遍呈尺寸为100nm至200nm的球形。

将实施例1中由单核细胞生成的微囊泡在1mL PBS中稀释至5μg/ml的浓 度，然后置于比色皿中并使用动态光散射(DLS)粒径分析仪分析粒径。结果 在图3中给出。可看出，微囊泡的尺寸为200nm至300nm，平均尺寸为250nm。

在37℃条件下，用0.5μg胰蛋白酶处理分别通过实施例1中的挤压法和实 施例2中的超声处理法由单核细胞生成的微囊泡(每种5μg)20min。在用胰 蛋白酶处理的或未用胰蛋白酶处理的微囊泡中，将5×浓度的上样染料(250 mM Tris-HCl，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油)最终稀释至1×浓度，然后 在100℃条件下孵育5min。将得到的微囊泡样品上样于8％聚丙烯酰胺凝胶并 在80V的条件下进行电泳持续2小时，然后在400mA的电场条件下转移至 PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上持续2小时。所述膜在3％脱脂牛奶溶液的PBS溶 液中封闭2小时，然后在4℃下用LFA-1和β-肌动蛋白的抗体孵育所述膜12小 时。然后，用PBS洗涤所述膜两次，并在室温条件下，用过氧化物酶结合的二 抗孵育1小时。用PBS洗涤30min，然后用ECL(增强化学发光，Amersham  Co.No.RPN2106)使底物显色。结果在图4中显示，其中，‘+’和‘-’分 别表示用胰蛋白酶处理或未用胰蛋白酶处理。

如图4所示，当用胰蛋白酶处理时，发现细胞和通过挤压生成的微囊泡失 去膜蛋白LFA-1的胞外结构域，但保留了与胰蛋白酶处理前的量相同的β-肌动 蛋白。即使部分细胞膜内部翻出，LFA-1的胞外结构域部分指向内部并诱导对 抗体的免疫反应，因为其不被胰蛋白酶降解。然而，在用胰蛋白酶处理的微 囊泡和细胞中没有检测到LFA-1抗体反应，说明存在于细胞和微囊泡上的 LFA-1的胞外结构域指向外部。

由该结果可推断出当通过挤压由细胞生成微囊泡时，细胞的膜蛋白(例 如LFA-1)位于微囊泡中，由此，使蛋白的胞外结构域指向微囊泡的外部。因 此，所述微囊泡具有与该细胞相同的膜拓扑结构。

此外，如图4所示，不像挤压得到的微囊泡那样，通过超声处理生成的微 囊泡即使在用胰蛋白酶处理之后也表现出对LFA-1抗体的免疫反应。因此，通 过超声处理生成微囊泡时，部分微囊泡的拓扑结构与作为其来源的细胞的拓 扑结构相反。

实施例4：制备装载了环糊精的微囊泡

用与实施例1相同的方法由单核细胞生成微囊泡，并在室温条件下用1μM 环糊精孵育微囊泡1小时。用1mL PBS将样品稀释至5μg/ml的浓度，然后置于 比色皿中并用动态光散射(DLS)粒径分析仪分析粒径。结果在图5中给出。

如图5所示，无环糊精的微囊泡的尺寸为约100nm，但当装载了环糊精时 尺寸扩大到约200nm。由该数据可推测，当用环糊精孵育时，由于环糊精出 现在膜周围，所以使微囊泡变大。

实施例5：制备装载了聚乙二醇的微囊泡

用与实施例1相同的方法由单核细胞生成微囊泡，并在室温条件下用1μM 胆固醇-聚乙二醇孵育微囊泡1小时。用1mL PBS将样品稀释至5μg/ml的浓度， 然后置于比色皿中并使用动态光散射(DLS)粒径分析仪分析粒径。结果在图 6中给出。

如图6所示，无聚乙二醇的微囊泡尺寸为约100nm。但当装载了聚乙二醇 时，尺寸收缩至约90nm。从该数据可推测，当用聚乙二醇孵育时，由于聚乙 二醇加入膜脂分子之间，所以使微囊泡变小。

实施例6：制备装载了来源于细胞的miRNA的微囊泡以及胞内递送miRNA

用与实施例1相同的方法由A172细胞(一种人胶质母细胞瘤细胞系，表达 或不表达微小RNA miR125)生成微囊泡。预见到来源于表达miR125的细胞的 微囊泡封装了miR125。

如下证明miR125存在于所述微囊泡中。基于ERBB2(EGF受体家族成员) 作为miR125的一种靶mRNA[J.Biol.Chem.282；1479-1486(2007)]的事实，用微 囊泡来检测所述miR125是否干扰EGF信号转导。

将人非小细胞肺癌细胞系A549以1×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板上 并孵育12小时。然后，用10μg/ml装载或未装载miR125的微囊泡处理细胞1小 时，并在新鲜的培养基中培养24小时。然后，在不含血清的培养基中再培养 细胞12小时，接着，用100ng/ml EGF处理10min。用M-PER(Pierce)溶解A549 细胞。

用SDS-PAGE分离由此得到的全部细胞溶解产物并用对磷-Erk(p-Erk)和 Erk具有特异性的抗体进行蛋白质印迹(Western blotting)分析。图7显示蛋白 质印迹分析的结果。如图7所示，EGF诱导p-Erk的表达，而在用装载了miR125 的微囊泡处理的细胞中没有发现p-Erk。

从这些结果可推断出在用装载了miR125的微囊泡处理的细胞中，miR125 表现出降低EGF受体ERBB2的表达的功能，从而抑制EGF信号转导。

因此，上述数据表明来源于细胞的物质可被装载至微囊泡并递送至细胞 中。

实施例7：使用来源于细胞的、装载了受体的微囊泡结合VEGF

用与实施例1相同的方法由人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生成微囊泡。 由于VEGF受体在HUVEC的质膜上表达，因此预见到来源于HUVEC的微囊泡 具有VEGF受体。

微囊泡也由表达VEGF受体的转化的细胞生成。在这点上，借助于脂质体 (Lipofectamine)，用携带VEGF受体cDNA的pCEP4载体转化鼠细胞系PT67 (ATCC No.CRL-12284)，并在存在250μg/ml潮霉素B(Invitrogen  No.10687010)的条件下培养。用与实施例1相同的方法，将转化成表达VEGF 受体的细胞用于构建微囊泡。

将微囊泡以每孔0ng、12.5ng和25ng的量接种于多孔板中并在4℃下孵育 12小时或12小时以上，然后用100μl 1％BSA/PBS固定1小时。随后，用100 ng/ml生物素结合的VEGF孵育微囊泡2小时并用1％BSA/PBS洗涤。用链霉亲 和素-POD孵育20min，然后用BM-POD使底物显色。

在图8和图9中给出了显色后的RLU值。图8和图9显示了由微囊泡得到的 RLU值，所述微囊泡分别来源于完整的内皮细胞以及表达VEGF受体的转化的 细胞。RLU值代表结合于微囊泡的VEGF的相对数目。如图8所示，发现来源 于内皮细胞的微囊泡结合VEGF，提供较高的RLU值。同样地，如图9所示， 发现VEGF也结合于来源于被转化成表达VEGF受体的细胞的微囊泡，表现出 较高的RLU值。

总的来说，这些数据说明由于被装载于微囊泡的表面上，VEGF受体可与 溶液中存在的VEGF结合，并且装载了VEGF受体的微囊泡可用作VEGF拮抗 剂。

实施例8：来源于装载了ICAM-1的细胞的微囊泡对免疫细胞的结合的抑制活性

使用人前列腺癌细胞系PC3(ATCC No.CRL-1435)的总RNA来生成 ICAM-1正义cDNA和ICAM-1反义cDNA。就这点而言，分别使用正义引物 5，-GATCGGATCCTCAGCCTCGCTAT-GGCTCCCAGCA-3’和反义引物 5，-GCTAGGATCCCGGGATA-GGTTCAGGGAGGCG-3’进行反转录PCR以得 到ICAM-1正义cDNA和ICAM-1反义cDNA。ICAM-1 cDNA长1.6kb，通过电 泳在琼脂糖凝胶上分离。分离的ICAM-1cDNA用限制性内切酶BamHI酶切， 并与也单独用BamHI酶切的pCEP4(Invitrogen No.V04450)连接。得到的重组 pCEP4载体分别携带ICAM-1正义cDNA和ICAM-1反义cDNA，借助于 FuGENE6转染试剂(Roche No.1 815 091)将该重组载体转化至人成纤维细胞 系HT1080(ATCC No.CCL-121)中。在存在250μg/ml潮霉素B的条件下培养 这些细胞。

用与实施例1相同的方式由HT1080细胞生成微囊泡，在所述HT1080细胞 中，ICAM-1的表达通过ICAM-1正义cDNA和ICAM-1反义cDNA的转化分别被 上调和下调。

将HUVEC[J.Clin.Invest.52；2745-2756(1973)]以1×10⁴个细胞/孔的密度 接种于用0.1％明胶包被的96孔板，培养12小时，然后在含有或不含10ng/ml  TNF-α(肿瘤坏死因子-α)(R&D systems，No.210TA)的条件下再培养16小 时。TNF-α刺激HUVEC以增加诸如ICAM-1、VCAM-1和选择素E之类的细胞 粘附分子的表达，上述细胞粘附分子可结合单核细胞和巨噬细胞的细胞粘附 分子(例如LFA-1和Mac-1)，使HUVEC与单核细胞和/或巨噬细胞之间发生 相互作用。

使单核细胞U937装载5μM细胞跟踪物并在30min内用绿色荧光染料染 色。用PBS洗涤96孔板之后，将绿色荧光单核细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接 种于96孔板中，并用装载了0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml ICAM-1的微 囊泡或未装载ICAM-1的微囊泡孵育1小时。然后，除去培养基，用PBS洗涤细 胞。在荧光显微镜下对与HUVEC结合的绿色荧光单核细胞进行计数，结果在 图10中显示。

在图10中，白色柱和黑色柱分别表示通过ICAM-1正义和ICAM-1反义转化 而被修饰成上调和下调ICAM-1表达的绿色单核细胞的数量。Y轴的值表示与 TNF-α处理的HUVEC结合的单核细胞数量的百分数。用TNF-α刺激使HUVEC 表达多种细胞粘附分子，从而诱导HUVEC与免疫细胞中的单核细胞结合。在 未经TNF-α处理的HUVEC中几乎检测不到单核细胞，而在TNF-α处理的 HUVEC中发现大量单核细胞。

如图10所示，与HUVEC结合的单核细胞数量随装载了ICAM-1的微囊泡的 浓度的增加而增加。然而，不含ICAM-1的微囊泡不抑制单核细胞与HUVEC 的任何结合。

该数据显示，装载了ICAM-1的微囊泡作为单核细胞与HUVEC的结合的抑 制剂起作用。

实施例9：制备装载了抗癌剂的微囊泡

根据图1的示意图由单核细胞或巨噬细胞生成微囊泡。根据图1示意图所 举例说明的步骤，由单核细胞或巨噬细胞制备微囊泡。从图1所建议的那些方 法中选择挤压法和密度梯度法。在挤压步骤中，将抗癌剂装载于微囊泡中。

将单核细胞或巨噬细胞以5×10⁶个细胞/ml的密度悬浮于3mL PBS中。向 细胞悬浮液中加入浓度为0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml的抗癌药 物阿霉素(Sigma，No.D1515)。使得到的混合物依次通过孔径为10μm、5μm 和1μm的膜滤器，每个过滤器通过三次。依次将1mL 50％OptiPrep、1mL 5％  OptiPrep和3mL从膜滤器滤出的细胞悬浮液加至5mL超速离心管中。以 100,000×g的速度超速离心2小时，在50％OptiPrep和5％OptiPrep之间形成一 层装载了阿霉素的微囊泡。

将阿霉素溶于PBS中至浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40 μg/ml。在存在300μl每种阿霉素溶液的条件下挤压微囊泡。将浓度为100μg/ml 的装载了阿霉素的微囊泡以100μl的量一式三份接种于96孔板中。在 Wallac1420 VICTOR酶标仪(Perkin-Elmer Life Sciences)中定量荧光度，所述 酶标仪装配有488nm的激发滤光片和530nm的发射滤光片。使用来源于阿霉 素溶液的值绘制标准曲线，并用所述标准曲线对包在微囊泡中的阿霉素进行 定量。结果在图11中显示。

图11为显示装载至1μg微囊泡中的阿霉素的量的图。当使用浓度为100 μg/ml、200μg/ml和400μg/ml的阿霉素溶液时，观察到微囊泡分别装载了大约 50ng、200ng和300ng的量的阿霉素。

下列所有实施例中使用的装载了阿霉素的微囊泡均使用400μg/ml阿霉素 生成。

实施例10：分析装载了抗癌药物的微囊泡的性质

将用与实施例1相同的方法由单核细胞生成的微囊泡吸附至辉光放电的 碳包被的铜网上持续3min，然后用蒸馏水洗涤所述铜网，并用2％醋酸铀酰染 色1min。图12中显示该微囊泡的JEM101图像。

如图12的透射电子显微镜图像所示，由单核细胞生成的微囊泡被脂质双 分子层界定并形成尺寸为100nm至200nm的球形。

将实施例9中由单核细胞生成的微囊泡在1mL PBS中稀释至5μg/ml，然后 置于1mL比色皿中。如通过动态光散射(DLS)粒径分析仪在1mL比色皿中 所测量的，发现所述微囊泡的尺寸为100nm至300nm，平均尺寸为250nm。 装载了抗癌药物的微囊泡与那些未装载抗癌药物的微囊泡尺寸相似。

用5μM DiO(Invitrogen，No.V22886)孵育分别在实施例1和实施例9中生 成的每种装载了阿霉素的和未装载阿霉素的微囊泡30min。DiO是具有绿色荧 光的亲脂跟踪物。将DiO标记的微囊泡浓缩至20μg/ml并以50μl的量慢慢滴至 盖玻片上。通过4℃下孵育12小时使微囊泡粘在盖玻片上。将载玻片置于该盖 玻片下。在荧光显微镜下观察到微囊泡由于具有DiO而呈绿色荧光，而阿霉素 本身显示红色荧光。图13显示荧光图像。

图13显示装载了阿霉素的和未装载阿霉素的微囊泡的荧光图像。如图13 所示，观察到用DiO标记的微囊泡呈现绿色荧光并且未出现未装载阿霉素时的 阿霉素的红色荧光。相反，装载了阿霉素的微囊泡显示出绿色和红色两种荧 光。将荧光图像合并在一起时，绿色荧光和红色荧光出现在相同的位置，证 实阿霉素被装载至微囊泡。

实施例11：制备装载了氧化铁的微囊泡

根据图1示意图中举例说明的步骤由单核细胞或巨噬细胞生成微囊泡。从 图1示意图中举例说明的那些方法中选择挤压法和密度梯度法。在细胞水平进 行物质的装载。使巨噬细胞在培养板中生长至80％汇合，并用50μg/ml氧化铁 纳米颗粒孵育24小时。用刮板分离巨噬细胞之后，使巨噬细胞悬浮于PBS中。 如实施例1所举例说明的那样，使用挤压法和Optiprep分离装载了氧化铁的微 囊泡。

图14为装载了氧化铁的微囊泡的TEM图像。在该图像中，因为装载了黑 色的氧化铁，因此微囊泡的内部出现黑色。如图14所示，具有高电子密度的 氧化铁颗粒被封装至微囊泡中。

结果显示氧化铁可被装载于微囊泡中。

实施例12：通过来源于单核细胞的微囊泡递送基因

用与实施例9(除了装载阿霉素之外)的步骤类似的步骤由单核细胞生成 装载了绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的微囊泡，所述单核细胞通过电穿孔转 化以表达绿色荧光蛋白(GFP，Clontech No.6085-1)或红色荧光蛋白(RFP， Clontech No.632465)。

将用正义ICAM-1转化的HT1080细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种至24 孔板中，孵育12小时。用20μg/ml装载了GFP或RFP的微囊泡处理24小时后， 用PBS洗涤细胞，并在500μl培养基中孵育48小时。在共聚焦显微镜下观察细 胞。图15和图16中显示了共聚焦显微镜图像。在共聚焦显微镜上使用光干涉 得出DIC(微分干涉相衬)图像。在DAPI(4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐) 波长下显示Hoechst染色，在FITC(异硫氰酸荧光素)波长下显示GFP，在若 丹明波长下显示RFP。

图15和图16分别为GFP和RFP被递送至其中的细胞的图像。如图15和图16 所示，在胞液中检测到GFP的绿色荧光和RFP的红色荧光。

这些结果说明微囊泡可有效地将基因递送至细胞。

实施例13：用来源于单核细胞的微囊泡递送纳米颗粒

将单核细胞以5×10⁷个细胞/ml的密度悬浮于加入了最终浓度为5μM的 DiI(1，1’-双十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁高氯酸盐，Invitrogen，No.V22885) 的PBS中，然后在37℃下孵育30min。在以500×g的速度离心收集单核细胞之 后，使用电穿孔将Qdot705导入单核细胞。通过与实施例9(除了装载阿霉素 之外)的步骤类似的步骤由所述单核细胞生成微囊泡。独立地，用与实施例1 相同的方法生成未装载Qdot705的微囊泡。

将用0.1％明胶包被的盖玻片置于24孔板中，然后将正义ICM-1转化的 HT1080细胞以1×10⁴个细胞/盖玻片的密度接种于所述盖玻片，然后孵育12小 时。用20μg/ml装载或未装载Qdot705的微囊泡处理细胞24小时，再用PBS洗涤。 盖玻片用4％多聚甲醛固定10min，并将载玻片置于盖玻片下。在共聚焦显微 镜下观察细胞，图像在图17和图18中显示。因为Qdot705具有600nm激发波长 和705nm发射波长的波长差，所以在Cy7波长下观察到荧光，且该荧光被表示 为伪红色。在若丹明波长下观察到用DiI标记的微囊泡显示红色荧光。在共聚 焦显微镜上使用光干涉得到DIC图像。

图17和图18分别为用含有Qdot705的微囊泡处理或不含Qdot705的微囊泡 处理的细胞的图像。

在图17中，在细胞中检测到分别来源于微囊泡和Qdot705的红色荧光和蓝 色荧光，这说明微囊泡和Qdot705装载物可被有效地递送至细胞。在图17的DIC 图像中，用箭头标出的细胞将要死亡并正在被溶解。与图18中未装载Qdot705 的微囊泡的图像相比，Qdot705被递送至细胞，由此诱导细胞凋亡。

实施例14：用来源于单核细胞的微囊泡递送蛋白质

用与实施例9(除了装载阿霉素之外)的步骤类似的步骤由通过电穿孔将 RNase A(Sigma，No.R4875)导入其中的单核细胞生成装载了RNase A的微囊 泡。

HT1080细胞被转化成表达正义ICAM-1，将所述HT1080细胞以1×10⁴个细 胞/孔的密度接种于24孔板中，孵育12小时，然后在37℃下用0μg/ml、20μg/ml 或50μg/ml装载RNase A的微囊泡处理30min。用PBS洗涤之后，将细胞在10％ FBS/MEM中培养24小时。再用PBS洗涤细胞，并用1μM钙黄绿素AM染料 (Invitrogen，No.C3099)和2μM乙锭均二聚物-1染料(Invitrogen，No.E1169) 孵育细胞30min。钙黄绿素AM通过胞内的酯酶转化为绿色荧光钙黄绿素。所 述绿色荧光钙黄绿素由于不能穿过质膜渗透活细胞，因而在活细胞中积累。 相反，死细胞允许钙黄绿素容易地通过其质膜，从而它们不能用钙黄绿素的 荧光信号来监测。乙锭均二聚物-1不能穿过质膜渗透进入活细胞，但是可容易 地进入死细胞，所述乙锭均二聚物-1与核酸结合时发出红色荧光。因此，活细 胞不能用乙锭均二聚物-1染色而死细胞可用乙锭均二聚物-1染色。换言之，这 两种染料的荧光颜色不同，并可用于容易地区分死细胞和活细胞。用这种方 法，在荧光显微镜下观察活细胞和死细胞，结果见图19。

如图19所示，当装载了RNase A的微囊泡应用于活细胞时，所述微囊泡以 剂量依赖的方式诱导细胞死亡。该结果说明RNase A可由本发明的微囊泡递送 至细胞。

实施例15：由来源于巨噬细胞的微囊泡递送抗炎药物并抑制炎症反应

将巨噬细胞以5×10⁶个细胞/ml的密度悬浮于PBS中，除了用400μg/ml地 塞米松(Sigma，No.D2915)溶液替代阿霉素之外，用与实施例9相同的方式由 该细胞悬浮液生成微囊泡。

为了检测其抗炎效果，将由此得到的装载了地塞米松的微囊泡应用于巨 噬细胞，引起免疫反应之后，使用ELISA定量分析巨噬细胞分泌的促炎细胞因 子TNF-α和IL-6。

通过用10ng/ml LPS(脂多糖)处理6小时诱导巨噬细胞引发炎症反应。 测试组用LPS和10μg/ml微囊泡同时处理，而对照只用LPS处理。处理6小时后， 得到条件培养基(conditioned media)，以500×g的速度离心5min。将100μl 1％ BSA/PBS溶液加至96孔板的每个孔中以封闭抗体，所述96孔板用TNF-α和IL-6 的抗体包被。将所述条件培养基稀释1/10或1/2，并将稀释液置于平板中，室 温下孵育2小时。分别用TNF-α和IL-6的生物素结合的捕捉抗体孵育细胞2小时 之后，用1％BSA/PBS洗涤细胞。用链霉亲和素-POD处理20min，然后用 BM-POD使底物显色。

图20显示显色后的RLU(相对光单位)，RLU表示促炎细胞因子TNF-α 和IL-6的相对水平。图中，黑色柱和白色柱分别表示在不存在LPS(-)和存 在10ng/ml LPS(+)的条件下TNF-α和IL-6的水平。

如图20所示，在没有LPS的条件下，因为没有炎症反应，TNF-α和IL-6均 不被分泌。相比之下，LPS的处理诱导炎症反应从而增加TNF-α和IL-6的分泌。 此外，当用LPS和装载了地塞米松的微囊泡同时处理时，细胞表现出明显较低 的RLU值，代表几乎不分泌细胞因子。数据显示装载了地塞米松的微囊泡可 有效地抑制LPS诱导的促炎细胞因子的分泌。

实施例16：由来源于单核细胞的微囊泡体外递送药物以及递送至特定细胞

将用0.1％明胶包被的盖玻片置于在24孔板中，然后将HUVEC以1×10⁴个 细胞/盖玻片的密度接种至所述盖玻片，孵育12小时。用或不用10ng/ml TNF-α 处理细胞16小时。如上所述，TNF-α诱导HUVEC，从而使质膜上的细胞粘附 分子(例如ICAM-1，VCAM-1和选择素E)的表达增加。所述细胞粘附分子与 其它细胞粘附分子(例如存在于单核细胞和巨噬细胞中的那些分子(被识别 为LFA-1和Mac-1))相互作用，使血管内皮细胞与单核细胞和巨噬细胞结合。

用PBS洗涤细胞，并将500μl培养基加至每个孔中。随后，用装载了5μg/ml 阿霉素的微囊泡孵育细胞，所述装载了阿霉素的微囊泡如实施例9所述的由单 核细胞生成。用PBS再次洗涤细胞，将500μl不含血清的培养基加至每个孔中， 然后用5μM细胞跟踪物(Invitrogen，No.C2925)孵育细胞30min。

用PBS再次洗涤细胞，并在每孔500μl补充血清的培养基中孵育细胞30 min。在每孔中用500μl 4％多聚甲醛固定盖玻片10min，并在共聚焦显微镜下 观察。结果见图21。

如图21所示，当用TNF-α处理HUVEC时，在细胞发出绿色荧光的位置检 测到阿霉素的红色荧光。这些结果说明装载于微囊泡的阿霉素被递送至 HUVEC细胞核。相比之下，未用TNF-α处理的HUVEC中未观察到阿霉素。

由于只有有限数量的细胞可被显微镜监测，使用FACS(荧光激活细胞分 选术)定量分析检测递送至所有细胞的阿霉素。

装载或未装载阿霉素的微囊泡分别用与实施例9和实施例1相同的方法由 单核细胞生成。

将HUVEC细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于用0.1％明胶包被的24孔 板中，孵育12小时，然后在存在10ng/ml TNF-α的条件下再孵育16小时。用PBS 洗涤细胞，并将500μl培养基加至每个孔中。随后，用5μg/ml如上所生成的装 载了阿霉素的或未装载阿霉素的微囊泡孵育细胞1小时。用PBS再次洗涤细胞， 在37℃条件下，用100μl 1×TE(胰蛋白酶-EDTA)缓冲液处理5min来分离细 胞。向每孔中加入200μl PBS，然后进行FACS分析。结果见图22。

图22中，X轴上的“红”表示阿霉素的相对荧光强度，Y轴上的“计数” 表示细胞数目。此外，红色和紫色曲线分别显示细胞数目与由装载或未装载 阿霉素的微囊泡处理的细胞产生的红色荧光强度。

如图22所示，检测到用不含阿霉素的微囊泡处理的细胞的红色荧光强度 为约1.1×10¹。当用装载了阿霉素的微囊泡处理时，检测到细胞的红色荧光强 度为约1.2×10²，增加了10倍或10倍以上。因此，阿霉素必定被微囊泡递送至 细胞。

将HUVEC细胞以3×10⁴个细胞/孔的密度接种于用0.1％明胶包被的24孔 板中，在96孔板中培养HUVEC细胞12小时，然后在存在或不存在10ng/ml TNF-α的条件下再培养16小时。用PBS洗涤细胞，悬浮于每孔100μl的培养基 中，用0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml装载了阿霉素的微囊泡处理20min， 所述微囊泡用与实施例6相同的方法由单核细胞生成。然后，用PBS洗涤细胞 并在500μl新鲜培养基中培养24小时。然后，用PBS再次洗涤细胞并用1μM钙 黄绿素AM染料染色。在荧光显微镜下拍摄图像并对活细胞进行计数。

图23显示着色细胞的“细胞计数”，这表示活细胞的数目。

如图23所示，当用TNF-α处理时，HUVEC以剂量依赖的方式发生细胞死 亡，但是在未用TNF-α处理的细胞中几乎未诱导细胞死亡。

结果显示细胞死亡可被装载于微囊泡的阿霉素诱导，并在TNF-α处理的细 胞(即，活化的细胞)中具有较高的强度。

将HUVEC细胞以3×10⁴个细胞/孔的密度接种于用0.1％明胶包被的24孔 板中，在96孔板中孵育12小时，然后在存在或不存在10ng/ml TNF-α的条件下 再孵育16小时。用PBS洗涤细胞，悬浮于每孔100μl培养基中，并用0μg/ml、 1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml微囊泡处理20min，除了用5-氟尿嘧啶、吉西他滨 或卡铂代替阿霉素之外，用与实施例9相同的方法由单核细胞生成所述微囊 泡。然后，用PBS洗涤细胞并在500μl新鲜培养基中培养24小时。随后，用PBS 再次洗涤细胞并用1μM钙黄绿素AM染料染色。在荧光显微镜下拍摄图像并对 活细胞进行计数。

图24显示着色细胞的“细胞计数”，这表示活细胞的数目。

如图24所示，当用TNF-α处理时，HUVEC以剂量依赖的方式发生细胞死 亡，但是在不存在TNF-α的条件下处理的细胞中几乎未诱导细胞死亡。

为了证实细胞粘附分子在来源于单核细胞的微囊泡的活化中的重要作 用，制备HT1080细胞，在所述HT1080细胞中ICAM-1的表达分别通过正义 ICAM-1或反义ICAM-1的转化被上调或下调。

37℃下，用0.1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml微囊泡处理所述细胞30min，所 述微囊泡用与实施例9相同的方法由单核细胞生成。然后，用PBS洗涤细胞并 在新鲜培养基中培养24小时。然后，用PBS再次洗涤细胞并用1μM钙黄绿素 AM染料染色。在荧光显微镜下拍摄图像并对活细胞进行计数。

图25显示图像中检测到的着色细胞的计数。

如图25所示，当表达ICAM-1时，被诱导发生细胞死亡的HT1080细胞的数 目大于当其不表达ICAM-1时的数目。该结果说明如同单核细胞那样，来源于 单核细胞的微囊泡具有暴露在其表面的LFA-1蛋白，并且所述微囊泡可通过 LFA-1和ICAM-1之间的特异性相互作用更有效地将它们的装载物递送至 ICAM-1-过表达的HT1080细胞。

因此，得益于细胞粘附分子之间的相互作用，具有在其上表达的诸如 LFA-1之类的细胞粘附分子的、装载了抗癌药物的来源于单核细胞的微囊泡可 特异性结合于表达诸如ICAM-1之类的细胞粘附分子的细胞，从而可将抗癌药 物装载物递送至所述细胞，诱导细胞死亡。

实施例17：用来源于单核细胞的微囊泡在分裂的细胞中进行毒性诱导

将HUVEC以1×10⁵个细胞的密度接种于用0.1％明胶包被的35mm培养板 中，生长12小时至完全汇合。随后，使用200p头(tip)对细胞进行划痕实验 并在存在10ng/ml TNF-α的条件下孵育16小时。

用PBS洗涤细胞并向每孔中加入1ml培养基。随后，用5μg/ml微囊泡培养 所述细胞20min，所述微囊泡如同实施例9那样由单核细胞生成。然后用PBS 洗涤细胞并在1mL新鲜培养基中培养24小时。用PBS再次洗涤细胞并用1μM钙 黄绿素AM染料染色。使用荧光显微镜拍摄图像，所述图像在图26中给出。

在图26中，活细胞显示为绿色而划痕部分显示为红色。当生长至汇合时， 由于接触抑制使HUVEC细胞不发生分裂。通过划痕产生空间，细胞开始分裂 并向空隙处迁移。

如图26所示，未用物质处理的细胞已经分裂并迁移至空隙处，从而在荧 光显微镜上观察到它们充满绿色。然而，当细胞用装载了阿霉素的微囊泡处 理时，划痕部分仍然保持空隙。此外，在无划痕的、汇合的区域也未检测到 变化，即使将装载了阿霉素的微囊泡应用于所述无划痕的、汇合的区域。这 些数据显示，装载了阿霉素的微囊泡特异性作用于分裂中的细胞。

实施例18：通过来源于巨噬细胞的、装载了阿霉素的微囊泡在体内诱导癌症中的细胞死亡

将小鼠结肠26细胞系以1×10⁶个细胞的剂量皮下注射至小鼠体内[Cancer  Res.57；1625-1629(1997)]，并培养5天。

用与实施例1类似的方式，通过挤压由巨噬细胞产生不含阿霉素的微囊 泡。单独地，用与实施例9类似的方式通过挤压由悬浮于400μg/ml阿霉素溶液 中的巨噬细胞生成装载了3μg阿霉素的微囊泡(阿霉素-微囊泡)。

皮下注射五天后，将PBS、含有10μg挤压的微囊泡(微囊泡)的PBS溶液、 含有2μg装载了0.6μg阿霉素的挤压的微囊泡(阿霉素-微囊泡(2))的PBS 溶液、或含有10μg装载了3μg阿霉素的挤压的微囊泡(阿霉素-微囊泡(10)) 的PBS溶液以100μl的剂量一天一次经尾静脉注射入小鼠组(每组10只)。每 两天检测一次癌组织的尺寸。癌组织的体积通过方程式v＝ls²/2来计算，其中， (l)为肿瘤的最长轴的长度，以及(s)为与所述最长轴垂直的轴的长度。

将癌细胞皮下移植之后，测量癌组织的尺寸并在图27中显示测量结果。

如图27所示，发现当装载了阿霉素的挤压的微囊泡以每天10μg的剂量注 射时癌症生长最慢。无阿霉素的微囊泡对癌组织的生长没有影响。 该结果表明抗癌药物阿霉素可通过微囊泡递送至癌组织。

实施例19：通过来源于巨噬细胞的、装载了阿霉素的微囊泡使癌细胞死亡的体内机理

将从PBS处理的或实施例18中的阿霉素-微囊泡处理的小鼠中切除的癌 组织在4％多聚甲醛中固定24小时。为了脱水，将固定的癌组织在70％乙醇中 浸泡一次，在95％乙醇中浸泡四次，在100％乙醇中浸泡三次，并且在100％ 二甲苯中浸泡三次，上述所有浸泡操作每次持续一小时。然后，将所述组织 用石蜡包埋，切成4μm厚的切片，并吸附于载玻片上。在60℃下孵育一小时 使石蜡熔化。为了水化，将所述组织在100％二甲苯中浸泡三次，在100％乙 醇中浸泡四次，并且在95％乙醇中浸泡三次，上述所有浸泡操作每次持续一 分钟，然后在流水中储存5min。

水化之后，对组织进行免疫组化分析。就这点而言，使用微波法进行抗 原修复。将组织置于10mM柠檬酸钠缓冲液(Sigma，No.S4641)中并用微波 辐照三次，每次持续五分钟。用流水将组织冷却并用含有5％马血清和 0.02％Triton X-100的TBS(Tris缓冲盐水)封闭2小时。以1∶200的比率将识别 内皮标记物CD31的抗体(SantaCruz，No.SC1506)与含有5％马血清和 0.02％Triton X-100的TBS混合，然后在4℃下孵育12小时。所述组织用含有 0.02％Triton X-100的TBS洗涤三次并在室温下用绿色荧光Alexa 488结合的 二抗孵育1小时。用含有0.02％Triton X-100的TBS洗涤该组织三次，并用5μM 主染料(host dye)染色10分钟。用TBS洗涤组织五次并将载玻片置于盖玻片 下，在共聚焦显微镜下观察。测量图像中染成绿色的区域。

在图28中，在图像上对血管区域进行定量分析。在图28的Y轴上测量绿 色区域(表示血管的CD31阳性区域)。在总共10幅图像中对血管进行分析。 如图28所示，微囊泡使血管区域以剂量依赖的方式减少。

为了检测破坏血管是否减少癌细胞的分裂周期数，对水化组织进行免疫 组化分析。在该分析中，将所述组织置于10mM柠檬酸钠缓冲液中并用微波 辐照三次(每次持续5分钟)，以修复抗原。用流水冷却组织并用含有5％马 血清和0.02％Triton X-100的TBS(Tris缓冲盐水)封闭2小时。将识别细胞分 裂标记物磷酸-组蛋白3(PH-3)的抗体(Upstate，No.06-570)与含有5％马血 清和0.02％Triton X-100的TBS以1∶200的比率混合，然后在4℃下孵育12小时。 用含有0.02％Triton X-100的TBS洗涤组织三次并在室温下用绿色荧光Alexa  488结合的二抗孵育1小时。用含有0.02％Triton X-100的TBS洗涤组织三次并 用5μM主染料染色10分钟。用TBS洗涤所述组织五次并将载玻片置于盖玻片 下，在共聚焦显微镜下观察。

在图29中，对图像上正在分裂的细胞进行定量分析。在图29中的Y轴上 测量绿色细胞数(PH3阳性细胞)。在总共10幅图像中对细胞进行计数。如 图29所示，微囊泡使分裂的细胞数以剂量依赖的方式减少。

总之，上述数据说明装载了阿霉素的微囊泡诱导破坏癌组织中的血管内 皮细胞，从而减少癌细胞的分裂。

实施例20：通过来源于巨噬细胞的、装载了阿霉素的微囊泡将阿霉素递送至体内癌组织血管

将实施例18中使用的小鼠结肠26细胞系以1×10⁶个细胞的剂量皮下注射 至小鼠体内并培养5天。

用与实施例9相似的方式，通过挤压由巨噬细胞在400μg/ml阿霉素溶液 中的悬浮液生成装载了3μg阿霉素的微囊泡(阿霉素-微囊泡)。

培养10天之后，将PBS、含有100μg挤压的微囊泡(阿霉素-微囊泡)的 PBS或含有30μg阿霉素的PBS以100μl的剂量经尾静脉注射至小鼠体内。

注射后六小时，从小鼠体内切除癌组织、脾脏和心脏并将上述组织在4％ 多聚甲醛中固定24小时。为了脱水，将固定的组织在70％乙醇中浸泡一次， 在95％乙醇中浸泡四次，在100％乙醇中浸泡三次，并在100％二甲苯中浸泡 三次，上述所有浸泡的操作每次持续一小时。然后，组织用石蜡包埋，切成 4μm厚的切片，并粘附于载玻片上。通过在60℃下孵育一小时使石蜡熔化。 为了水化，将组织在100％二甲苯中浸泡三次，在100％乙醇中浸泡四次，并 在95％乙醇中浸泡三次，上述所有浸泡的操作每次持续一分钟。然后在流水 中储存5分钟。

水化之后，对组织进行免疫组化分析以检测阿霉素是否被递送至每种组 织。就这点来说，使用微波法进行抗原修复。将组织置于10mM柠檬酸钠缓 冲液中并用微波辐照三次(每次持续五分钟)。在流水中冷却该组织并用含 有5％马血清和0.02％TritonX-100的TBS封闭2小时。将识别内皮标记物CD31 的抗体(SantaCruz，No.SC1506)与含有5％马血清和0.02％Triton X-100的TBS 以1∶200的比率混合，然后在4℃下孵育12小时。所述组织用含有0.02％Triton  X-100的TBS洗涤三次并在室温下用绿色荧光Alexa 488结合的二抗孵育1小 时。用TBS洗涤该组织五次并将载玻片置于盖玻片下，在共聚焦显微镜下观 察。

图30显示所拍摄的癌组织的图像，图31为所拍摄的脾脏和心脏的图像。 在这些图像中，血管呈现绿色，而红色代表阿霉素。

如图30中所示，阿霉素只通过微囊泡被递送至癌症血管，而不能由其自 身递送。

从这些结果可看出，显然，装载至来源于巨噬细胞的微囊泡中的阿霉素 可被递送至癌组织的血管细胞。

此外，图31的数据显示单独的阿霉素被大量递送至心脏，但是当将阿霉 素装载至微囊泡中时，递送至心脏的阿霉素的量显著减少。

该结果表明本发明的微囊泡可减轻阿霉素引起的心脏中毒。

实施例21：通过来源于巨噬细胞的、装载了阿霉素的微囊泡诱导体内癌细胞死亡以及与阿霉素诱导体内癌细胞死亡的比较

将实施例18中使用的小鼠结肠26细胞系以1×10⁶个细胞的剂量皮下注射 至小鼠体内，培养5天。

用与实施例9类似的方式，通过挤压由巨噬细胞在400μg/ml阿霉素溶液 中的悬浮液生成装载了3μg阿霉素的微囊泡(阿霉素-微囊泡)。

培养5天之后，将PBS、含有10μg装载了3μg阿霉素的挤压的微囊泡(阿 霉素-微囊泡)的PBS或含有3μg、15μg或60μg阿霉素的PBS以100μl的剂量 每天一次经尾静脉注射至小鼠组(每组5只)体内。每两天监测一次癌组织 的体积。通过方程式v＝ls²/2计算肿瘤体积，其中，(l)为肿瘤最长轴的长 度，且(s)为与所述最长轴垂直的轴的长度。

将癌细胞皮下移植后，测量癌组织的尺寸，测量结果在图32中显示。如 所显示的，发现当装载了阿霉素的挤压的微囊泡以每天10μg的剂量注射时癌 症生长最慢。不含阿霉素的微囊泡对癌组织的生长没有影响。检测到当阿霉 素单独给药时表现出与装载了阿霉素的微囊泡相同的治疗效果的阿霉素的 剂量为60μg，所述剂量比微囊泡中阿霉素的装载量高20倍。

图33为显示小鼠组(每组五只)体重的图。

如图33所示，每天给药10μg阿霉素-微囊泡的小鼠和给药PBS对照的小鼠 的体重没有明显改变。然而，给药60μg阿霉素的小鼠的体重明显下降。

通过腹部注射150μl麻醉剂来麻醉小鼠，所述麻醉剂包含1∶3∶6的氯胺酮∶ 隆朋∶PBS混合物，并从心脏采取血样并置于含有抗凝剂的试管中。将10μl 血液和90μl 1％HCl的混合物在室温下保存7分钟，将10μl所述混合物加入血 细胞计数器中，对白细胞进行计数。

图34显示如该步骤所测量的血液中存在的白血球的数目。

如图34的数据所显示的，与对照相比，每天注射10μg装载了阿霉素的微 囊泡的小鼠中白细胞的数量没有下降，而注射60μg阿霉素的小鼠的白细胞数 量下降了至少50％。

该结果表明微囊泡的使用降低了阿霉素的副作用。

实施例22：通过来源于巨噬细胞的、装载了阿霉素的微囊泡诱导体内癌细胞死亡以及膜蛋白的作用

将实施例18中使用的小鼠结肠26细胞系以1×10⁶个细胞的剂量皮下注 射至小鼠体内，培养5天。

用与实施例9类似的方式，通过挤压由巨噬细胞在400μg/ml阿霉素溶液 中的的悬浮液生成装载了3μg阿霉素的微囊泡(阿霉素-挤压的微囊泡)。对 装载了阿霉素的微囊泡进行胰蛋白酶处理，以除去来源于所述微囊泡的膜蛋 白(阿霉素-挤压的微囊泡(T))。独立地，使用超声处理制备装载了阿霉 素的微囊泡(阿霉素-超声处理的微囊泡)。

培养5天之后，将PBS、含有10μg装载了3μg阿霉素的挤压的微囊泡 的PBS、含有10μg阿霉素-挤压的微囊泡(T)的PBS或含有10μg装载了 3.6μg阿霉素的超声处理的微囊泡的PBS以100μl的剂量每天一次经尾静脉 注射至小鼠组(每组5只)体内。每两天监测一次癌组织的体积。通过方程 式v＝ls²/2计算肿瘤体积，其中，(l)为肿瘤最长轴的长度，且(s)为与所 述最长轴垂直的轴的长度。

将癌细胞皮下移植后，测量癌组织的尺寸，测量结果在图35中显示。

如图35所示，发现当装载了阿霉素的挤压的微囊泡以每天10μg的剂量 注射时癌症生长最慢。相比之下，通过胰蛋白酶处理而除去其膜蛋白的微囊 泡和膜蛋白拓扑结构改变的超声处理的微囊泡对癌组织的生长并无显著影 响。

该结果表明，膜蛋白和膜蛋白的拓扑结构对微囊泡的活性具有重要作用。

实施例23：来源于巨噬细胞的、装载了抗癌药物的微囊泡透导体内癌细胞死亡

用与实施例9类似(除了用5-氟尿嘧啶、吉西他滨、卡铂或EGCG(表 没食子儿茶素没食子酸酯)代替阿霉素)的方法，由单核细胞生成装载了5- 氟尿嘧啶、吉西他滨、卡铂或EGCG的微囊泡。

将实施例18中使用的小鼠结肠26细胞系以1×10⁶个细胞的剂量皮下注 射至小鼠体内，培养5天。随后，将含有15μg装载了5-氟尿嘧啶的微囊泡的 PBS，或含有10μg装载了吉西他滨、卡铂或EGCG的微囊泡的PBS以100μl 的剂量每天一次经尾静脉注射至小鼠组体内。每两天监测一次癌组织的体积。 通过方程式v＝ls²/2计算肿瘤体积，其中，(l)为肿瘤最长轴的长度，且(s) 为与所述最长轴垂直的轴的长度。

将癌细胞皮下移植后，测量癌组织的尺寸，测量结果在图36中显示。如 图36所示，发现当每天注射装载了相应药物的挤压的微囊泡时肿瘤生长缓慢。

该结果显示所述微囊泡可装载各种药物并且保证药物的治疗效果，例如， 抗癌效果。

实施例24：通过来源于巨噬细胞的、装载了抗癌药物的微囊泡诱导体内异种移植肺癌细胞死亡

将与基底胶混合的人肺癌细胞系A549以2×10⁶个细胞的剂量皮下注射 至裸鼠体内，培养25天。

用与实施例9类似(除了同时使用吉西他滨和卡铂代替阿霉素)的方式， 由巨噬细胞生成装载了吉西他滨和卡铂两种物质的微囊泡。

培养25天后，将PBS、含有5μg装载了所述药物的挤压的微囊泡的PBS 或含有20μg装载了所述药物的挤压的微囊泡的PBS以100μl的剂量每两天 一次经尾静脉注射至小鼠组(每组5只)体内。每两天监测一次癌组织的体 积。通过方程式v＝ls²/2计算肿瘤体积，其中，(l)为肿瘤最长轴的长度，且 (s)为与所述最长轴垂直的轴的长度。

将肺癌细胞皮下移植后，测量癌组织的尺寸，测量结果在图37中显示。 如图37所示，发现当装载了所述药物的挤压的微囊泡以每两天20μg的剂量 注射时癌症生长最慢。

该结果表明装载了抗癌药物的微囊泡对移植了人癌细胞异种移植物的癌 组织具有治疗效果。

实施例25：通过来源于巨噬细胞的、装载阿霉素的微囊泡抑制体内癌症转移

将小鼠黑素瘤细胞系B16BL6以2×10⁵个细胞的剂量经尾静脉注射至 BNX小鼠体内，培养3天。

根据实施例9的步骤，由巨噬细胞在400μg/ml阿霉素溶液中的悬浮液生 成装载了3μg阿霉素的微囊泡。

培养3天后，将PBS、含有2μg装载了0.6μg阿霉素的挤压的微囊泡(阿 霉素-微囊泡(2))的PBS或含有10μg装载了3μg阿霉素的挤压的微囊泡 (阿霉素-微囊泡(10))的PBS以100μl的剂量每天一次经尾静脉注射至小 鼠组(每组5只小鼠)体内。

图38为显示每组5只小鼠中转移至肺部的黑素瘤集落数量的图。如图38 所示，发现每天给药10μg装载了阿霉素的微囊泡的小鼠中转移至肺部的黑素 瘤集落最少。该实验一式两份进行。

将黑素瘤细胞移植至10只小鼠体内，然后用装载了阿霉素的微囊泡进行 给药。测量小鼠的存活率。

图39为显示小鼠存活率的图。如图39所示，与PBS对照相比，用10μg 装载了阿霉素的微囊泡给药增加了存活率。

该数据显示，本发明的装载了阿霉素的微囊泡可抑制转移癌症的生长。

实施例26：来源于骨髓的微囊泡的制备及其药物递送

在骨盆骨中进行骨髓穿刺。就这点而言，切除小鼠的后肢并除去后肢的 肌肉块，得到纯骨盆骨。使用1mL注射器从该骨中取出骨髓细胞，然后以500 ×g的速度离心。室温下，在RBC裂解缓冲液(0.15M NH₄Cl，10mM KHCO₃， 0.1mM Na₂EDTA，pH 7.2)中孵育所述骨髓细胞10min。以500×g的速度离 心后，使没有RBC的细胞悬浮于PBS中。用类似于实施例1的方法由该悬浮 液生成微囊泡。

为了证明来源于骨髓的微囊泡靶向骨髓，进行了以下实验。用5μM DiI (一种红色荧光染料)孵育所述微囊泡30min。将DiI-标记的微囊泡经尾静 脉注射至小鼠体内。注射后六小时，从小鼠中取出骨髓细胞。除去所述骨髓 细胞中的红细胞后，对细胞进行FACS分析。

图40显示FACS分析结果。使用未注射微囊泡的小鼠作为对照。如图40 所示，DiI信号强度为2×10¹或更高的细胞的百分比在未注射微囊泡之后为 1.01％，但在注射微囊泡后增加了约2.5倍，即增加至2.47％。

该结果表明来源于该骨髓的微囊泡靶向骨髓。

为了测定来源于骨髓的微囊泡能否将阿霉素递送至骨髓，根据实施例9 的方法由骨髓细胞生成装载了阿霉素的微囊泡。

将PBS、80μg微囊泡、24μg阿霉素或包含80μg装载了24μg阿霉素的 微囊泡的PBS以100μl的剂量注射至小鼠尾静脉内。注射后六小时，从每只 小鼠中取出骨髓细胞，并且定量分析骨髓中的阿霉素水平。根据实施例10的 方法用荧光度测定阿霉素的水平。将取自每只小鼠的骨髓蛋白归一化。

图41显示从每组3只小鼠的骨髓中获取的1μg蛋白中的阿霉素水平。如 图41所示，观察到PBS对照中每μg蛋白含有约20μg阿霉素，而在用阿霉 素-微囊泡给药的小鼠的骨髓内检测出约28μg阿霉素/μg蛋白。

该结果表明来源于骨髓的微囊泡可用来将阿霉素递送至骨髓。与阿霉素- 微囊泡相比，阿霉素以明显较低的量自发地递送至骨髓。

实施例27：使用转化细胞的细胞特异性递送

根据实施例9的方法，由ICAM-1反义转化的HT1080细胞和ICAM-1正 义转化的HT1080细胞制备装载了阿霉素的微囊泡。当由ICAM-1正义转化的 HT1080细胞生成时，所述微囊泡装载了ICAM-1，但当由ICAM-1反义转化 的HT1080细胞生成时，所述微囊泡未装载ICAM-1。

将单核细胞U937细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种至含有500μl/孔培养 基的24孔板中，然后用浓度为0μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml的由 HT2和HT3生成的微囊泡孵育24小时。随后，向96孔板的每一孔中加入50 μl细胞溶液，然后加入50μl的台盼蓝。因为台盼蓝会再被分泌出胞外，所以 该染料不对活细胞染色。将10μl该混合物置于血细胞计数器中，然后对不含 台盼蓝的细胞进行计数。

图42为显示每一测试组中测得的活细胞数量的图。如图42所示，来源 于ICAM-1正义转化的HT1080细胞的微囊泡诱导单核细胞U937凋亡的效率 比来源于ICAM-1反义转化的HT1080细胞的微囊泡效率高，所述ICAM-1正 义转化的HT1080细胞表达能与单核细胞上的LFA-1结合的ICAM-1。

该数据表明，使用由转化成表达靶向物质的细胞生成的微囊泡可实现将 物质特异性递送至细胞。

实施例28：来源于单核细胞的脱落微囊泡的分离和纯化及其药物装载

在存在或不存在10μM细胞松弛素D(Sigma，No.C8273)的条件下，孵 育10mL密度为1×10⁶个细胞/ml的单核细胞。以500×g的速度将条件培养基 离心10min，然后再以800×g的速度将由此获得的上清液离心两次，每次10 min。以100,000×g的速度将获得的上清液再次超速离心2小时。使由此获得 的微囊泡团块悬浮于PBS中。

图43为来源于细胞松弛素D-处理的细胞的脱落微囊泡的TEM图像。

如图43所示，所述脱落微囊泡的尺寸为约50nm至100nm。

4℃下，将来源于细胞松弛素D处理的细胞的脱落微囊泡和来源于未经细 胞松弛素D处理的细胞的脱落微囊泡用400μg/ml阿霉素孵育12小时。孵育 12小时后，以100,000×g的速度将培养基超速离心2小时。使由此获得的团 块悬浮于PBS中，得到装载了阿霉素的脱落微囊泡。

实施例29：装载了纳米颗粒的脱落微囊泡的分离和纯化

将人宫颈癌细胞系HeLa(ATCC No.CCL-2)以1×10⁷个细胞的密度接 种至150mm平板中，然后孵育至80％汇合。以5nM的浓度将羧基(-COOH)- 包被的Qdot 705(Invitrogen，No.Q21361MP)加入20mL不含血清的培养基 中，然后在所述培养基中培养癌细胞24小时。就这点而言，用PBS充分洗涤 在先前培养基中生长的细胞，然后将其转移至包含Qdot的培养基中。孵育24 小时后，收获条件培养基，并以800×g的速度离心10min以除去细胞碎片， 然后以3000×g的速度离心10min。在此情况下，所述以3000×g的速度离 心与截留10kDa(cutoff)的离心过滤器联合运行，从而将20mL不含细胞碎 片的上清液浓缩至3mL。在5mL超速离心管中依次加入1mL 50％OptiPrep、 1mL 5％OptiPrep和3mL浓缩的条件培养基。以100,000×g的速度超速离心 2小时，在50％OptiPrep与5％OptiPrep之间形成一层装载了Qdot的脱落微 囊泡。

图44为装载了Qdot的脱落微囊泡的TEM图像。由于Qdot具有高电子 密度，其在TEM图像上显示为黑点。如图44所示，观察到Qdot颗粒存在于 大多数微囊泡被检测到的相同位置，表明诸如量子点之类的纳米颗粒可装载 至脱落微囊泡。

实施例30：通过来源于单核细胞的、装载了阿霉素的脱落微囊泡对药物进行细胞特异性递送

在0.1％明胶包被的24-孔板中放置盖玻片，再将HUVEC细胞以3×10⁴个细胞/玻片的密度接种于所述盖玻片上，然后孵育12小时。随后，在存在 10ng/ml TNF-α的条件下再孵育所述细胞16小时。用PBS洗涤所述细胞，使 其悬浮在500μl培养基中，用5μg/ml来源于单核细胞的装载了阿霉素的脱落 微囊泡孵育细胞20min，所述脱落微囊泡根据实施例27的方法生成。用PBS 再次洗涤所述细胞，使其悬浮在500μl不含血清的培养基中，并在存在5μM 细胞跟踪物的条件下孵育细胞30min。随后，用PBS洗涤细胞，在500μl补 充血清的培养基中孵育30min。室温下，将盖玻片在500μl 4％多聚甲醛中固 定10min，盖上载玻片，然后在荧光显微镜下观察。

图45为显示使用所述微囊泡递送药物后的活细胞数量的图。从图45的 数据可见，无论使用细胞松弛素D处理还是未使用细胞松弛素D处理，装载 了阿霉素的脱落微囊泡都诱导细胞死亡。

TNF-α处理的HUVEC细胞的凋亡效果更高，由此还可推断，与正常细 胞相比，装载了阿霉素的脱落微囊泡选择性诱导癌细胞中的凋亡。

虽然本发明为了举例说明而公开本发明的优选实施方式，但是本领域技 术人员将意识到还可进行各种修改、添加和替换，而不背离如所附权利要求 公开的本发明的范围和实质。

产业应用性

如上所述，包含治疗物质和/或诊断物质的、来源于有核哺乳动物细胞的 微囊泡可选择性地且有效地将所述物质递送至靶细胞或靶组织，从而可消除 将治疗物质递送至非标靶时可能发生的副作用，降低在治疗过程中癌症患者 的痛苦和不便。此外，只将诊断物质递送至靶细胞或靶组织使得易于精确检 测疾病相关的细胞或组织。