ACTIN在哺乳动物细胞早期内涵体上转运囊泡形成过程中的作用研究

摘要

在真核细胞中，胞吞途径中区室化形态结构是胞吞分子胞内分选转运的结构基础，而区室化形态结构之间的物质转运和信息交流依赖于囊泡的形成与转运。早期内涵体（early endosome，EE）作为胞吞途径中高度动态的区室化形态结构，是胞吞货物的分选平台。EE通过高度动态的管状结构进行货物蛋白的循环转运，或通过膜内陷形成腔内囊泡将胞吞货物转运到溶酶体中进行降解。胞吞物质在EE上的分选与转运是一个复杂而又精细的过程，需要多种蛋白和脂质的参与，它们共同调控EE上胞吞物质的分选与转运囊泡的形成。前期研究表明，在哺乳动物细胞中，ACTIN与EE上物质的分选和转运囊泡的形成密切相关。然而，ACTIN在转运囊泡形成过程中膜的重塑，主要包括膜的成管和剪切作用机制仍不清楚。
　　鉴于此，在本研究中，不同种属哺乳动物细胞COS-7和HeLa细胞作为研究载体；借助荧光标记和激光共聚焦荧光显微成像技术，观察ACTIN在COS-7和HeLa细胞内涵体/溶酶体系统上的定位情况。为了观察ACTIN和其调控因子WASH在EE上转运囊泡形成中的动态行为，在COS-7细胞上瞬时表达常激活型荧光标签RAB5蛋白（RAB5 Q79L）和LifeAct-mKate2或GFP-WASH；由于表达RAB5 Q79L，造成EE发生同源融合，从而形成空泡结构，形成的空泡结构有利于在荧光显微镜分辨率有限的情况下观察EE上的动态事件。通过药物处理抑制ACTIN动态组装实验探索了ACTIN在EE上转运囊泡形成过程中的具体作用机制；同时也借助药物处理实验进一步探究了ACTIN功能缺陷对转铁蛋白（transferrin，Tfn）和10 KDa Dextran在胞内转运的影响。最后，借助荧光三标记和活细胞实时成像技术，初步探索了ACTIN和WASH在EE上转运囊泡形成事件中两者在动态行为上的相关性。
　　ACTIN胞内定位研究数据显示，ACTIN在COS-7和HeLa细胞中的定位呈现高度一致性，主要分布在EE上，在循环内涵体（recycling endosomes，RE）上有少量数量上的分布，且以离散型ACTIN微域的形式分布在EE膜上。荧光标记活细胞实时成像实验数据表明，在COS-7细胞中，ACTIN和WASH与EE上转运囊泡的形成密切相关。COS-7上药物处理实验表明，当使用Latrunculin B抑制ACTIN动态组装时，会造成EE上可能由于剪切功能缺陷而出现长膜管状结构；同时在HeLa细胞上药物处理实验表明，ACTIN功能缺陷会影响Tfn和10 KDa Dextran胞内转运，造成Tfn和10 KDa Dextran在EE滞留。本研究首次在不同类型哺乳动物细胞中初步探究了ACTIN胞内定位以及在EE上转运囊泡形成中的作用机制；同时通过荧光标记活细胞成像技术初步探索了ACTIN与其在EE上成核促进因子（nucleation-promoting factors，NPF）WASH在转运囊泡形成事件中两者在动态行为上的相关性；为以后有关ACTIN和WASH在EE上货物分子的分选以及转运囊泡形成的研究提供一定的理论依据。

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1 绪论

1.1 ACTIN在转运囊泡生物发生中作用机制

1.2 ACTIN组装调节因子WASH在早期内涵体上调控物质分选与内涵体剪切的作用机制

1.3 本文研究的出发点和主要内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 荧光成像系统

2.4 反卷积（deconvolution）

2.5 蛋白间共定位比例定量分析

2.6 数据分析及统计

3 ACTIN在哺乳动物细胞早期内涵体上转运囊泡形成过程中

3.1 前言

3.2 实验方法

3.3 实验结果与讨论

4 ACTIN组装调控因子WASH和ARP2在哺乳动物细胞早期

4.1 前言

4.2 实验方法

4.3 实验结果与讨论

5 总结与展望

致谢

参考文献