提高厌氧发酵产丁二酸强度和浓度的方法

摘要

本发明属于工业发酵有机酸技术领域，涉及一种提高厌氧发酵产丁二酸强度和浓度的方法。本发明的技术要点在于，在发酵体系中添加表面活性剂，表面活性剂的加入量为：0.25~5g/L。通过添加表面活性剂的作用，来破坏细胞膜，提高膜内酶活性，加快细胞生长，缩短细胞生长周期。而且，表面活性剂对细胞渗透压起到调节作用，维持菌体活力，从而可以实现丁二酸的浓度与生产强度的提高，提高了生产效率，对工业化具有应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于工业发酵有机酸技术领域，涉及一种提高厌氧发酵产丁二酸强度和浓度的方法，具体的是一种添加表面活性剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法。

背景技术

丁二酸，俗称琥珀酸，作为一种常见的天然有机酸，广泛存在于动植物和微生物中，许多厌氧微生物以丁二酸作为其能量代谢的主要末端产物。作为一种优秀的C4平台化合物，丁二酸可被广泛用于药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物前体，如可作为1,4-丁二醇、四氢呋喃、脂肪酸、γ-丁内酯等的中间物，而这些化学制品都具有很大的市场潜力。

利用生物法转化可再生资源生产丁二酸，成本低，污染小，环境友好，且在微生物发酵过程中可吸收大量的CO₂用于菌株的代谢，能够有效减轻温室效应，这也是丁二酸生产有别于传统有机酸生产的一个重要特点。US5504004、US5573931、US5723322、EP0389103B1公开了丁二酸生产菌及其发酵方法，这些生产菌株大多是从瘤胃、狗的口腔等特征性厌氧环境中筛选出来的，在发酵过程中存在产物收率较低、副产物较多、丁二酸浓度偏低、生产强度较低的问题，因此寻找高效的丁二酸生产方法是目前丞待解决的问题。

表面活性剂破坏细胞膜，有利于充分发挥细胞内酶的催化活性，对细菌生长和丁二酸的的合成有较大促进作用，达到缩短细胞生长周期的目的。而且，在丁二酸的发酵过程中，表面活性剂增大细胞渗透性，可以使甲酸、乙酸等副产物的抑制作用得到缓解。现有技术《改善细胞通透性促进1,3-丙二醇生物合成》公开了一种提高1,3-丙二醇发酵产率的新工艺，发明了一些表面活性剂对1,3-丙二醇产出的影响，从而提高1,3-丙二醇发酵产率。而目前国内外还未见利用表面活性剂应用于丁二酸的发酵生产中。

发明内容

本发明的技术目的在于提供一种提高厌氧发酵产丁二酸生产强度的方法，以提高丁二酸的生产强度与浓度。

为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案如下。

一种提高厌氧发酵产丁二酸强度和浓度的方法，包括菌种活化、种子培养、发酵产丁二酸的步骤；其特征在于，在所述的发酵产丁二酸步骤开始后6～7 h向发酵体系中加入0.25～5 g/L的表面活性剂，且表面活性剂选自Tween-80、壬基酚聚氧乙烯醚-10（OP-10）、曲拉通X-100、十二烷基磺酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），聚乙二醇（PEG）中的一种。

具体地，菌种活化步骤是：将产丁二酸微生物菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37℃厌氧培养箱中活化培养24 h。

种子培养步骤是：将活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37℃培养10～12 h后作为种子液。

发酵产丁二酸的步骤：将种子液和灭好的葡萄糖接入发酵培养基中，接种量为体积比3～10%，温度为37℃，始终通入CO₂气体来保持厌氧环境，整个发酵过程中pH控制在6.5～7.0。

其中，本发明所述的菌种，即厌氧发酵生产丁二酸的微生物，为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113 (CGMCC NO.1716)。

作为本发明的优选实施方式：所述的表面活性剂为PEG，且其加入量最佳值为：0.5 g/L。

本发明的有益效果在于，通过在丁二酸发酵体系中添加适量的表面活性剂，使细胞膜的通透性改变，从而加快菌体的生长，促进丁二酸产物的分泌，提高产物的浓度和生产强度。并且减缓甲酸、乙酸等副产物的抑制，从而提高了生产效率，具有工业化应用价值。其原理是：表面活性剂具有两亲结构，根据相似相容的原理，表面活性剂的疏水基会和磷脂的疏水基作用，或者表面活性剂的基团与细胞膜上蛋白质基团作用，从而使细胞膜通道增大，使底物更容易进入细胞内，发挥胞内酶的活性，促进细胞的生长和丁二酸的合成。

具体实施方式

以下所述实施例对本发明做了详细说明，但对本发明没有限制。

实施例1

菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC NO.1716) 该菌已申请专利并获得授权，专利授权公告号为CN100537744C。

发酵条件如下：

菌种活化：菌种在斜面培养基中进行平板划线后，在37℃厌氧培养箱中活化培养24 h。种子培养：活化培养后的菌种转接到种子培养基中，37℃培养10～12 h后作为种子液。

发酵产丁二酸：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为5 %（v/v），搅拌转速为200 rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25 vvm；该步骤开始时计时，至第6小时，向发酵体系中添加浓度0～5 g/L Tween-80；培养时间共计15h，整个发酵过程中pH控制在6.5。

其中，斜面培养基( g/L)：葡萄糖 10 (分消)，酵母膏 5，NaHCO₃ 10，NaH₂PO₄·2H₂O 9.6，K₂HPO₄·3H₂O 15.5，NaCl 1，琼脂20，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

种子培养基(g/L)：葡萄糖 10 (分消)，酵母膏 5，NaHCO₃ 10，NaH₂PO₄·2H₂O 9.6，K₂HPO₄·3H₂O 15.5，玉米浆干粉2.5，NaCl 1，pH 7.0，121 ℃灭菌15 min。

发酵培养基(g/L)：Tween-80  0～5，葡萄糖 30 (以总还原糖浓度计)并分开灭菌单独加入，酵母粉 10，乙酸钠 1.36，KH₂PO₄ 3，MgCl₂·6H₂O 0.2，CaCl₂ 0.2，NaCl 1，NaH₂PO₄·2H₂O0.31，NaH₂PO₄ ·2H₂O 1.6，玉米浆干粉 7.5，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

发酵结果见表1。

由上表可知，当初始葡萄糖浓度为30 g/L，Tween-80添加浓度为0.5 g/L时，丁二酸产量最高，达17.15 g/L，但原始发酵培养基几乎相等。所以Tween-80对丁二酸的生产的促进作用很小。

实施例2

菌种活化及斜面培养基、种子培养基及种子培养方法同实施例1。

发酵产丁二酸：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为10 %（v/v），搅拌转速为200 rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25 vvm；该步骤开始时计时，至第7小时，向发酵体系中添加浓度0～5 g/L OP-10；培养时间共计15h，整个发酵过程中pH控制在7。

    发酵培养基(g/L)：OP-10 0～5，葡萄糖 30 (以总还原糖浓度计) 并分开灭菌单独加入，酵母粉 10，乙酸钠 1.36，KH₂PO₄ 3，MgCl₂·6H₂O 0.2，CaCl₂ 0.2，NaCl 1，NaH₂PO₄·2H₂O 0.31，NaH₂PO₄ ·2H₂O 1.6，玉米浆干粉 7.5，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

发酵结果见表2。

由上表可知，当初始葡萄糖浓度为30 g/L，OP-10添加浓度为0.5 g/L时，丁二酸产量最高，达20.3 g/L，比原始发酵培养基提高了21%。所以，OP-10对丁二酸的生产具有较大的促进作用。

实施例3

菌种活化及斜面培养基、种子培养基及种子培养方法同实施例1。

发酵产丁二酸：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为3 %（v/v），搅拌转速为200 rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25 vvm；该步骤开始时计时，至第6.6小时，向发酵体系中添加浓度0～5 g/L SDS；培养时间共计15h，整个发酵过程中pH控制在6.8。

发酵培养基(g/L)：SDS 0～5，葡萄糖 30～60 (以总还原糖浓度计) 并分开灭菌单独加入，酵母粉 10，乙酸钠 1.36，KH₂PO₄ 3，MgCl₂·6H₂O 0.2，CaCl₂ 0.2，NaCl 1，NaH₂PO₄·2H₂O  0.31，NaH₂PO₄ ·2H₂O 1.6，玉米浆干粉 7.5，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

发酵结果见表3。

由上表可知，当初始葡萄糖浓度为30 g/L，随着SDS添加浓度的递增，对菌体生长及丁二酸的生产起到抑制作用。

实施例4

菌种活化及斜面培养基、种子培养基及种子培养方法同实施例1。

发酵产丁二酸：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为6 %（v/v），搅拌转速为200 rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25 vvm；该步骤开始时计时，至第6.8小时，向发酵体系中添加浓度0～5 g/L Triton X-100；培养时间共计15h，整个发酵过程中pH控制在6.9。

发酵培养基(g/L)：Triton X-100  0～5，葡萄糖 30～60 (以总还原糖浓度计) 并分开灭菌单独加入，酵母粉 10，乙酸钠 1.36，KH₂PO₄ 3，MgCl₂·6H₂O 0.2，CaCl₂ 0.2，NaCl 1，NaH₂PO₄·2H₂O 0.31，NaH₂PO₄ ·2H₂O 1.6，玉米浆干粉 7.5，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

发酵结果见表4。

由上表可知，当初始葡萄糖浓度为30 g/L，随着Triton X-100添加浓度为0.25 g/L时，丁二酸产量最高，达17.55 g/L，比原始发酵培养基提高了15.4%。所以，Triton X-100对丁二酸的生产也具有很好地促进作用。

实施例5

菌种活化及斜面培养基、种子培养基及种子培养方法同实施例1。

发酵产丁二酸：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为4 %（v/v），搅拌转速为200 rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25 vvm；该步骤开始时计时，至第6.6小时，向发酵体系中添加浓度0～5 g/L CTAB；培养时间共计15h，整个发酵过程中pH控制在6.9。

发酵培养基(g/L)：CTAB 0～5，葡萄糖 30～60 (以总还原糖浓度计) 并分开灭菌单独加入，酵母粉 10，乙酸钠 1.36，KH₂PO₄ 3，MgCl₂·6H₂O 0.2，CaCl₂ 0.2，NaCl 1，NaH₂PO₄·2H₂O 0.31，NaH₂PO₄ ·2H₂O 1.6，玉米浆干粉 7.5，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

发酵结果见表5。

由上表可知，当初始葡萄糖浓度为30 g/L，随着SDS添加浓度的递增，对菌体生长及丁二酸的生产起到明显的抑制。

实施例6

菌种活化及斜面培养基、种子培养基及种子培养方法同实施例1。

发酵产丁二酸：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为8 %（v/v），搅拌转速为200 rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25 vvm；该步骤开始时计时，至第6.6小时，向发酵体系中添加浓度0～5 g/L PEG；培养时间共计15h，整个发酵过程中pH控制在6.9。

发酵培养基(g/L)：PEG 0～5，葡萄糖 30～60 (以总还原糖浓度计) 并分开灭菌单独加入，酵母粉 10，乙酸钠 1.36，KH₂PO₄ 3，MgCl₂·6H₂O 0.2，CaCl₂ 0.2，NaCl 1，NaH₂PO₄·2H₂O0.31，NaH₂PO₄ ·2H₂O 1.6，玉米浆干粉 7.5，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

发酵结果见表6。

由上表可知，当初始葡萄糖浓度为30 g/L，PEG添加浓度为0.5 g/L时，丁二酸产量最高，达22.4 g/L，比原始发酵培养基提高了33%。所以，PEG对丁二酸的生产具有较大的促进作用。

实施例7

    种子培养基及种子培养方法同实施例1。

发酵培养基(g/L)：PEG 0.5，葡萄糖 30～80 (以总还原糖浓度计) 并分开灭菌单独加入，酵母粉 10，乙酸钠 1.36，KH₂PO₄ 3，MgCl₂·6H₂O 0.2，CaCl₂ 0.2，NaCl 1，NaH₂PO₄·2H₂O  0.31，NaH₂PO₄ ·2H₂O 1.6，玉米浆干粉 7.5，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

在3 L发酵罐中加入发酵培养体积为1.26L，接种量为6%（v/v），温度为37℃，通入含有CO₂气体来维持发酵体系的厌氧环境。搅拌速率在200rpm，发酵时间为34 h。

发酵过程中OD、残糖、丁二酸、乙酸等参数变化如图1所示。

    从图1中可以看出，丁二酸的产率可高达73.03%，生产强度为0.86 g/L·h，比未添加表面活性剂时的发酵结果有很大的提高。