产丁二酸基因工程菌的构建及其厌氧发酵的初步研究

摘要

丁二酸，俗称琥珀酸，作为一种常见的天然有机酸，广泛存在于动植物和微生物中，许多厌氧微生物能够生产丁二酸作为其能量代谢的主要末端产物。作为一种优秀的C4平台化合物，丁二酸可被广泛应用于制备药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物。传统化学法合成丁二酸以不可再生资源石油为原料，成本高，环境污染严重，严重阻碍了丁二酸作为大宗化学品的发展潜力。生物法转化可再生资源生产丁二酸，成本低，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收大量CO2用于菌体的代谢，具有绿色环保的优点。
　　 本论文考察在编码丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl和乳酸脱氢酶基因ldh双突变的E.coli中过量表达苹果酸酶对其厌氧发酵产丁二酸的影响。从E.coli DH5α基因组上通过PCR的方法扩增出编码苹果酸酶的基因sfcA，将其连接至pGEM-T vector上，序列测定结果与KEGG数据库中报道的E.coli K-12苹果酸酶基因序列一致。将扩增得到的sfcA基因，连接至载体pTrc99a上，构建出表达载体pTrc99a-sfcA，并转化进E.coli FMJ39、DC1500、NZN111以及DC1502中，选择0.5 mmol/L IPTG诱导剂浓度，30℃，200 rpm诱导8h后，超声破碎细胞取上清液测定酶活力并进行SDS-PAGE分析。结果表明：测定的重组菌苹果酸酶的比酶活在26.78～57.44 U/mg之间，比酶活比受体菌提高的倍数在87.37～161.52之间。SDS-PAGE分析的结果表明，在大约64 kDa位置上，有一明显的诱导表达条带，与预测的sfcA分子量和文献报道均一致。
　　 厌氧条件下考察了在上述宿主菌中过量表达苹果酸酶对厌氧混合酸发酵途径的影响，结果表明：除FMJ39以外，在宿主菌中过量表达苹果酸酶，皆能够重新恢复菌株在厌氧条件下的生长能力，丁二酸是积累的主要有机酸，且其产量比宿主菌有了显著提高。其中重组NZN111的丁二酸对葡萄糖质量收率最高，当在发酵培养基中添加17.00 g/L初始葡萄糖时，厌氧发酵48 h后，葡萄糖完全消耗，丁二酸的产量为8.96 g/L，丁二酸对葡萄糖的质量收率为52.71％，其产酸性能在选择的宿主菌中为最优。重组NZN111发酵液中没有检测到甲酸和乳酸，有少量乙酸产生，丙酮酸也有部分积累。
　　 进一步对重组NZN111厌氧发酵过程中使用的诱导剂IPTG浓度，好氧与厌氧切换时机、转接方式进行考察，结果表明：选择IPTG终浓度为0.7 mmol/L，采用接入30 mL有氧培养菌泥的方式比按照10％接种量转接对数生长期后期菌种(即OD600为3.5左右)进行厌氧发酵效果要好，丁二酸的质量收率由69.18％提高到了72.93％，且20 g/L左右的葡萄糖消耗时间由48 h降低到36 h。重组NZN111葡萄糖耐受性实验表明：葡萄糖浓度在20-60 g/L之间时，重组NZN111菌体的生长和丁二酸产量都较好，丁二酸的收率随着葡萄糖浓度的增加而增加，为73.23-78.42％之间。当葡萄糖浓度高于60 g/L时，对重组NZN111的生长和产酸都会有一定的抑制作用，且葡萄糖浓度越高，抑制作用越明显。5 L发酵罐上采用42.5 g/L的初始葡萄糖，发酵结束时，丁二酸对葡萄糖的质量收率为63.07％，厌氧发酵过程中葡萄糖消耗速率为0.51g/(L·h)，丁二酸的生产强度为0.25 g/(L·h)。
　　 为了进一步提高丁二酸的质量收率，研究中还选择了NZN111的ptsG基因自发突变缺失菌株AFP111为宿主菌，在其中过量表达苹果酸酶，进一步提高了丁二酸的质量收率，达到了80.88％，发酵液中没有检测到甲酸、丙酮酸和乳酸，但同时乙酸有大量积累。