褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测用引物，其核苷酸序列如下：5’-CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3’，5’-ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3’。本发明还涉及PCR检测试剂盒及其检测方法和应用。本发明褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测用引物及其试剂盒，检测结果稳定，成本低，准确可靠，可实现高通量检测，对褐牛AS致病位点可以进行准确的分型，能及时发现褐牛蜘蛛腿综合征携带者个体。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种褐牛疾病的分子检测 方法。

背景技术

家畜遗传疾病(Animal genetic disease)是指由遗传物质变异对 家畜个体造成有害影响，表现为身体结构缺陷或功能障碍，这种有 害的遗传信息按一定的遗传方式在世代间垂直传递，在某些品种的 家系内呈现一定的表达方式，不会延伸到无亲缘关系的个体(张沅， 2001)。动物遗传疾病的爆发给畜牧育种和生产者造成巨大经济损 失。由于奶牛和肉牛AI繁育体系的建立，种公牛的优秀生产性能基 因在全群内的推广传播效率越来越高，对全群奶牛的生产性能改良 起到巨大的推动作用。奶牛和肉牛遗传种质资源(包括优秀个体、公 牛冻精、优质胚胎)世界范围内交换的日益频繁，也加速了有害基因 在世界牛群范围内的传播扩散。

牛蜘蛛腿综合征(Arachnomelia Syndrome，AS；OMIA  pheneID139，Group 000059)是一种先天性致死性骨骼畸形遗传病， 患病个体出生时或出生不久后死亡。该病最早是于1975年，由德国 科学家Rieck和Schade报道的，现除了个别在荷斯坦牛群中散发的 患病牛外，该病主要存在于德系西门塔尔牛和瑞士褐牛群体中。虽 然在两个品种中，AS症状相似，但遗传基础并不相同。在西门塔尔 牛群中，该病是由MOCS1基因外显子11的缺失突变 c.1224 1225delCA引起的，该突变将造成移码突变产生不成熟的短 链蛋白，突变位点发生在一个该蛋白质物种间共同的保守域前，突 变导致MoC结构域丢失，蛋白质在二级结构上也发生变异。 (Buitkamp等，2011；焦士会，2011)

在20世纪80年代，欧洲瑞士褐牛中大量报道了蜘蛛腿综合征患 病个体(等，1987)，2004年，意大利也报道了4头AS瑞士 褐犊牛，并详细描述了其主要的临床症状和病理特征(Testoni， 2004)。科学家对历经20年时间收集到的15头患病瑞士褐牛进行系 谱分析，所有个体都能追溯到同一个祖先——来自美国Norvic Larry  牛场的瑞士褐公牛LILASON，并且推断AS呈现简单孟德尔隐性遗 传病特征(等，2009)。瑞士褐牛群体有可能是由于大 量使用这头经高度选育的公牛及其后代的冻精，从而引起该病致病 基因的广泛传播，导致发病。

2009年，等对瑞士褐牛群AS进行了研究，使用了 覆盖牛29对常染色体的240个微卫星标记，对15头患病个体和36 头已知确认的AS杂合子进行全基因组扫描，将基因定位在BTA5上 3个连续标记间。进一步精细定位和单倍型分析的结果揭示导致瑞士 褐牛蜘蛛腿综合征的致病基因可能存在于BTA5上微卫星标记 BMS490和DIK5248之间，跨度约8cM，物理距离在7.19Mb范围 内。随后，等(2010)报道了瑞士褐牛AS是由BTA5 定位区间内SUOX基因外显子4上的一个G的插入c.363-364insG突 变所致。经预测，插入突变c.363-364insG会导致SO蛋白的氨基酸 序列从124位置发生移码突变并且会由于移码提前产生终止密码 子，最终导致发病。

在我国，新疆褐牛(Xinjiang Brown)是经长期选育培育出来的 优秀的乳肉兼用型品种，于1983年通过新疆自治区畜牧厅组织品种 审定。新疆褐牛最初是以当地哈萨克牛为母本，引入瑞士褐牛、阿 拉托乌牛及少量的科斯特罗姆牛与之杂交改良经长期选育形成。19 世纪70年代至今，我国曾大量引入西德、奥地利褐牛和美国瑞士褐 牛及其遗传物质(包括冻精及活体胚胎等)进行新疆褐牛优良遗传品 质及生产性能的巩固和提高(郑丕留等，1998)。大量外血的引入对 新疆褐牛的生产性能提高发挥了重要作用，然而也可能将一些不利 的致病基因引入。据文献报道，瑞士和奥地利的瑞士褐牛群体中AS 致病等位基因估计频率为0.16(等，2010)，但该致病 突变是否已存在于我国新疆褐牛群体中尚处于未知状态。因此，建 立褐牛AS致病位点检测方法具有重要意义。

PCR产物测序的方法对于寻找DNA序列上的突变是一种准确 性最高的检测方法。使用PCR产物测序的方法，比对测序结果与参 考序列能够快速确定测序个体DNA序列与参考序列的差异。

荧光自动化检测分析方法其基本原理就是，通过在引物上标记1 个荧光发色基团，经PCR扩增后，再采用毛细管电泳或聚丙烯酰胺 凝胶电泳技术进行产物分离，利用基于荧光扫描技术的遗传分析 仪，结合分子量标准自动计算PCR产物长度大小，是一种常见的用 于检测长度多态的技术手段。此法通过直接判定扩增片段的长度， 能够实现高通量和自动化的分型。另外，该技术具有灵敏度高、特 异性和可靠性更强、检测实现高通量分型、自动化程度高、无污染 性、具实时性、快捷性和准确性等特点，此外，该方法还能够与其 他位点检测进行组合，如扩增片段长度不同或者携带不同的荧光发 色基团，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种褐牛蜘蛛腿综 合征(AS)致病位点的快速检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种褐牛蜘蛛腿综合征 (AS)致病位点PCR检测用引物，其核苷酸序列如下：

5’-CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3’，

5’-ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3’。

上述引物配合使用的荧光标记引物，其荧光染料为FAM、HEX、 TET等。

本发明还提供含有上述引物的检测试剂盒，其还包括：DNA裂解 液、阴性模板和/或阳性模板。

本发明进一步提供利用上述引物或试剂盒检测褐牛蜘蛛腿综合 征的方法，包括以下步骤：

1)目的基因的扩增

以褐牛组织细胞DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，回收 PCR扩增产物；

2)基因分型：对上述PCR扩增产物直接测序或者利用荧光毛细 管电泳或者荧光聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。

所述PCR扩增条件优选为95℃预变性5min，然后95℃变性30s、63℃ 退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，72℃最终延伸10min。

所述引物用量为1.5μL，引物的终浓度为10μM。

本发明还提供了上述方法在牛抗病育种中的应用，所述牛为褐 牛。

该检测方法是在已知SUOX基因的c.363-364insG证位点为褐牛 蜘蛛腿综合征(AS)致病位点的基础上，结合PCR直接测序方法或 者荧光引物PCR后电泳检测方法，设计的一种快速准确遗传致病基 因检测的方法。对褐牛AS致病突变位点准确有效的分子检测方法的 建立，目的在于筛选出我国牛群中的突变携带者个体，进行不利基 因的筛查和剔除，对我国进口的褐牛种用动物及遗传物质(冷冻精 液，胚胎等)，以及我国褐牛群体和含有褐牛血缘的群体进行检测， 防止AS在我国牛群中的传播，对我国牛的遗传改良提供保障。

本发明褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测用引物及其试剂 盒，检测结果稳定，成本低，准确可靠，可实现高通量检测，对褐 牛AS致病位点可以进行准确的分型，能及时发现褐牛蜘蛛腿综合征 携带者个体。

附图说明

图1为本发明冻精中提取公牛基因组1％琼脂糖凝胶检测结果；

图2为本发明不同引物、相同样品PCR扩增产物2％琼脂糖凝胶 检测结果；其中：泳道1-12为引物MOCS扩增产物；泳道19-30为 引物SUOX 1扩增产物；泳道13-18，31-36为引物SUOX 2扩增产 物；M为100bp ladder；

图3为本发明中PCR产物突变位点附近测序结果与文献报道的 测序结果比较；其中：a为本研究测序结果；b、c为文献报道的欧洲 瑞士褐牛PCR产物测序结果，黑色箭头位置为报道的瑞士褐牛AS 致病突变位点c.363-364insG；

图4为本发明被检测个体PCR产物测序序列与基因参考序列进 行多重比对的结果；其中：前5行序列分别为本研究中检测个体； 第6行序列为参考序列(NCBI Gene ID：509837)；

图5为本发明使用荧光自动化判型法进行SUOX基因突变位点 新疆褐牛基因型检测结果；

图6为本发明SUOX基因c.363-364insG和MOCS1基因 c.del1224_1225CA位点同时检测结果；其中：黑色箭头指示峰图为 250bp内标。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在 不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所 作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。

实施例1试验材料的准备和DNA的提取

本研究采用的试验材料来自两个部分，一部分是我国新疆地区 现在推广使用的55头褐牛公牛，其中50头公牛的冻精来自天山畜牧 种公牛站，另外5头来自新疆畜禽繁殖改良总站，共55支细管冷配 精液。系谱分析显示55头褐牛公牛不同程度的含有欧洲及美国褐牛 血缘(表1)。

表155头褐牛种公牛含美国及欧洲瑞士褐牛外血情况

另外一部分来自10个牛品种(品系)公牛管制冻精样品(表2)。 其中，4头德系西门塔尔牛中的一头ROMEL为已知西门塔尔牛蜘蛛腿 综合征AS致病基因(MOCS1基因c.del1224_1225CA突变)携带者， 其余个体均为正常非携带者。

表210个牛品种或品系冻精样品信息

本试验提取DNA的方法参考陈慧勇(2005)方法提取公牛冻精 DNA。使用1％琼脂糖凝胶检测基因组DNA，结果如图1所示。同时， 使用NanoDrop2000色谱法检测DNA浓度150ng/μl左右，稀释到 50ng/μl，4℃保存备用。

实施例2褐牛AS致病突变PCR扩增引物的筛选

使用primer3和Oligo 6针对导致褐牛蜘蛛腿综合征的致病基因 SUOX突变的位点c.363-364insG附近序列(Genbank登录号：509837) 设计引物，共设计了2对引物SUOX1和SUOX2，由上海英俊公司 合成。引物序列及扩增片段长度如下表3：

表3引物序列及扩增片段长度

PCR采用20μL PCR体系：DNA模板1μL，10×PCR Buffer 2μL， 25mmol.L^-1 MgCl₂1.2μL，2.5mmol.L^-1 dNTP 2μL，正反向引物稀 释至10mmol.L^-1各添加1.5μL，Taq DNA聚合酶(5U.μL^-1) 0.25μL，加灭菌去离子水至20μL。梯度PCR显示两对引物都可以得到 预期片段，退火温度选定为63℃。PCR反应程序为：95℃预变性5min， 然后95℃变性30s、63℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，最 后72℃充分延伸10min。

随机选择12个样品对两对引物的扩增效果进行比较，2％琼脂糖 凝胶检测PCR产物，经过比较发现引物SUOX 2能够稳定扩增每一 个样品(图2泳道13-18，泳道31-36)，且产物浓度高于引物SUOX 2 (图2泳道19-20)，因此最终确定引物SUOX 2作为后面研究使用的 引物。

实施例3PCR产物的直接测序

使用表3中普通PCR引物SUOX 2进行扩增，反应体系和条件同 实施例2。PCR产物经回收纯化后测序，由华大基因公司完成。测序 峰图使用Chromas软件查看，序列用BioEdit软件ClustalW Mutiple  alignment进行多重比对。

通过对目的片段PCR产物回收纯化后测序，测序结果见图3。本 研究中，所有55头褐牛测序结果全部相同，测序峰图每个碱基峰型 均单一而清晰，显示为纯合子，未在突变位点附近发现规律套峰(移 码突变)，也就是说，在PCR产物的127位鸟氨酸(G)和128位的 胞嘧啶(C)之间不存在鸟氨酸(G)的插入。测序结果使用BioEdit 软件进行多重比对分析，结果表明55头个体测序所得序列在突变位 置都与参考序列(NCBI Gene ID：509837)相同。如果出现杂合子则 测序结果应该如图3中c所示。

此外，将所有测序序列与NCBI参考序列(NCBI Gene ID： 509837)比对，证实测序结果与参考序列一致，均为野生型纯合子(图 4)。说明本研究扩增和检测的序列是正确的目的片段序列，并且在 55头推广使用的褐牛公牛中不存在携带者。

实施例4荧光自动化检测

荧光引物PCR法常用于微卫星等多等位基因的检测，灵敏度 高，可分辨1bp差异的片段。此方法的优点在于可结合多重PCR进 行高通量检测。本研究使用荧光引物SUOX2： 5’-CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3’(引物5’端HEX荧光标记)， 5’-ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3’，对55头褐牛公牛以及其他10 个品种公牛135头，总共190个个体进行了PCR扩增，并进行荧光 引物PCR产物判型。结果所有参与测定的个体均为274bp长度左右 的单一峰，均为纯合基因型，与测序结果一致，说明使用荧光引物 PCR扩增结合凝胶电泳电泳分型技术的检测方法可以对褐牛AS疾病 进行快速高通量的检测，部分个体检测峰图如图5所示。

本研究中，所有190个个体均在274bp片段处出现一个主峰，说 明所有个体均为野生纯合型，如果有突变位点的存在，则会在275bp 位置出现第二个峰，可以根据峰的位置来准确推断每一个检测个体 的基因型。

实施例5荧光自动化方法同时检测SUOX基因c.363-364insG和 MOCS1基因c.del1224_1225CA位点

荧光自动化检测方法的优点还在于可以对多个位点、多个片段进 行同时检测。本研究中使用实施例4中的引物同时对引起褐牛AS的 突变位点SUOX基因c.363-364insG，以及西门塔尔牛AS的突变位 点MOCS1基因c.del1224_1225CA位点，进行了检测，荧光引物信息 如表4，结果如图6所示。

表4荧光引物信息

检测结果显示：a)ROMEL检测结果，在249、251bp处出现两 个主峰，MOCS1基因c.del1224_1225CA位点处为杂合子，是携带 者；274bp处出现一个主峰，SUOX基因c.363-364insG位点为纯合子 野生型，非携带者；b)其他个体检测结果，在251bp处出现一个主 峰，MOCS1基因c.del1224_1225CA位点处为纯合子非携带者；274bp 处出现一个主峰，SUOX基因c.363-364insG位点为纯合子野生型， 非携带者；箭头所示浅灰色峰图为250bp内标所在位置。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。