六种牛源致病性细菌多重PCR检测方法的建立

摘要

多数病原菌通过损伤消化道、呼吸道局部黏膜组织，突破黏膜免疫屏障，进入血液循环系统，引发人或动物的细菌性疾病。在实际生产中，由于饲料普遍添加抗生素，动物长期采食引发细菌耐药性增强，加之不同细菌引发消化道、呼吸道疾病的临床症状相似等原因，在治疗细菌病的过程中只得加大抗生素的用量，同时联合广谱抗菌药物治疗疾病，使得细菌抗药性的问题进一步恶化。因此，快速、准确鉴别诊断病原以便针对性用药，对于缓解乃至解决细菌耐药性问题至关重要;对于保障养殖业及其下游产业的健康发展，减少社会公共卫生安全维持成本具有重要价值。
　　 本研究以奇异变形杆菌urR基因、沙门氏菌invA基因、产气荚膜梭菌α毒素基因、多杀性巴氏杆菌kmt-1基因、溶血曼氏杆菌1ktA-artJ intergenic region、化脓隐秘杆菌plo基因为靶位点，设计特异性引物，建立两套多重PCR检测方法，并对扩增体系（引物浓度、dNTP浓度和Mg2+浓度）及扩增条件（退火时间、退火温度和循环次数）等各因素进行优化。扩增得到的序列经BLAST分析，同源性均在98％以上。针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌的多重PCR方法，最低检出限均在4 pg/μL以上，略低于3种细菌的单重PCR检测方法的灵敏度（依次为4×10-1 pg/μL、4×10-1 pg/μL和4×10-4 pg/μL）;针对溶血曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌的多重PCR方法最低检出限均在40 pg/μL以上，与针对3种细菌的单重PCR方法灵敏度相当(依次为40 pg/μL、4 pg/μL和40 pg/μL)。用实验室分离的17株细菌验证两套多重PCR的特异性，结果表明建立的多重PCR检测方法特异性良好。应用建立的多重PCR方法，多次扩增阳性样品和阴性样品，结果与预期相符，并且不同时间扩增不同批次的菌株结果均一致，表明建立的多重PCR方法检测结果稳定、重复性较好。应用建立的两套多重PCR方法检测人工感染小鼠的病变组织和人工模拟混合感染的临床样品，结果证实建立的检测方法可用于对模拟临床样本的检测。对模拟临床样本进行多重PCR检测，同时分离细菌，两种检测方法结果符合率达100％。
　　 本研究建立了针对奇异变形杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌以及多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌的两套三重PCR检测方法，为相应细菌感染引发疾病的诊断和鉴别检测提供了特异、敏感、高通量的实验室诊断方法，为畜禽养殖及畜产品安全生产体系提供一种有效的疫病监控手段。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 黏膜—病原体入侵的主要途径

1．2 消化道与呼吸道细菌性疾病

1．2．1 消化道细菌性疾病

1．2．2 呼吸道细菌性疾病

1．3 细菌性疾病的防治

1．4 疫病的诊断方法

1．4．1 传统的检测方法

1．4．2 免疫学检测方法

1．4．3 分子生物学检测方法

1．4．4 生物传感技术

1．4．5 色谱技术

1．4．6 红外分光分析技术

1．5 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 病料来源

2．1．2 菌株与载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要设备

2．1．5 引物

2．1．6 试验动物

2．2 试验方法

2．2．1 多重PCR检测方法的建立

2．2．2 多重PCR扩增产物的克隆及序列分析

2．2．3 特异性试验

2．2．4 敏感性试验

2．2．5 重复性试验和稳定性试验

2．2．6 人工感染小鼠样本的多重PCR检测

2．2．7 人工感染临床样本的多重PCR检测

3 结果与分析

3．1 消化道疾病细菌多重PCR方法的建立

3．1．1 多重PCR最佳反应体系及条件的确定

3．1．2 多重PCR扩增产物的克隆及序列分析

3．1．3 特异性试验

3．1．4 敏感性试验

3．1．5 多重PCR的重复性及稳定性试验

3．1．6 人工感染小鼠的多重PCR的检测

3．1．7 模拟临床样品多重PCR检测

3．2 呼吸道疾病细菌多重PCR方法的建立

3．2．1 多重PCR最佳反应体系及条件的确定

3．2．2 多重PCR扩增产物的克隆及序列分析

3．2．3 特异性试验

3．2．4 敏感性试验

3．2．5 多重PCR的重复性及稳定性试验

3．2．6 人工感染小鼠的多重PCR的检测

3．2．7 模拟临床样品多重PCR检测

4 讨论

4．1 多重PCR检测方法的优势

4．2 靶基因的选择

4．3 多重PCR的灵敏度分析

4．4 基因组制备方法的比较

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文