6种牛羊病毒性病原GeXP多重PCR检测方法的建立

摘要

山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）、绵羊痘病毒（Sheep pox virus，SPPV）、牛疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)、传染性脓疱病毒(Contagiousecthyma virus，CPDV)、蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）、小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）能引起反刍动物急性、热性传染病，发病率高，危害严重。6种病毒中除传染性脓疱病毒外，其余五种病毒均为OIE通报疫病病毒;我国农业部将山羊痘、绵羊痘、牛疙瘩皮肤病、蓝舌病、小反刍兽疫列为一类疫病，羊传染性脓疱为三类疫病。此外，山羊痘、绵羊痘、传染性脓疱亦是人畜共患传染病，在危害畜牧养殖业造成严重经济损失的同时，对人类健康也构成严重危害。目前，国内未见牛疙瘩皮肤病流行的报道。由于这6种疫病均以皮肤、黏膜产生疱疹、溃疡为相似临床症状，常呈混合感染，仅从临床症状上难以诊断与区分。传统的诊断方法如病毒分离鉴定、血清学方法有操作繁琐、耗时费力、灵敏度低、假阳性率高等不足，难以同时对多种病原进行检测。因此，应临床和口岸快速通关检测需要，急需建立一种快速、准确、灵敏、稳定性好，且能同时鉴别诊断上述6种疫病病原的检测方法。
　　GeXP-PCR(Gene eXpress Profiler-polymerase chain reaction)是将通用引物与特异性嵌合引物按比例混合进行PCR扩增，由GeXP系统对经染色标记处理的扩增产物进行片段长度的测定的一种新技术，具有特异性强、灵敏度高、高通量等优点。近年来GeXP系统常用于基因表达分析、病毒检测等领域的研究与运用。
　　本研究以山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛疙瘩皮肤病毒、传染性脓疱病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒为对象，优化建立GeXP多重PCR检测方法。该方法能同时对上述6种牛羊病毒性病原进行鉴别检测，为山羊痘等6种疫病的鉴别诊断、疫情监控、流行病学调查、出入境动物检疫等提供技术保障，对保障我国的畜牧业生产安全、人类健康具有十分重要的意义。
　　主要研究内容与结果如下:
　　(1)根据山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛疙瘩皮肤病毒、传染性脓疱病毒、蓝舌病病毒和小反刍兽疫病毒的保守序列设计了6对特异性引物，经PCR扩增、目的片段的克隆及测序，结果发现扩增产物与GenBank中各毒株的同源性都在97％以上，表明设计的6对特异性引物均能扩增出目标序列。
　　(2)通过对特异性嵌合引物的引物浓度及退火温度进行优化，分别建立6种牛羊病毒性病原的GeXP单重PCR体系，进行单重GeXP-PCR的灵敏度试验，并与OIE推荐方法进行比较。结果表明，牛疙瘩皮肤病病毒、传染性脓疱病毒的灵敏度为103 copies/μL;山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒和蓝舌病病毒的灵敏度可达到102 copies/μL。可见，GeXP单重PCR检测方法具有较高的灵敏度，比OIE推荐方法的灵敏度(106～107 copies/μL)高10000～100000倍。
　　(3)建立并优化6种牛羊病毒性病原GeXP多重PCR检测体系，并进行特异性、灵敏度试验。特异性试验结果显示，牛疙瘩皮肤病病毒、传染性脓疱病毒、山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒和蓝舌病病毒均产生了清晰且与预期目标片段大小相符的特异性扩增峰，呈阳性;其余的毒株均无非特异性扩增，呈阴性，说明本研究所建立的方法特异性良好。灵敏度检测结果显示，发现6种病原单管扩增均能同时检测到的灵敏度达104 copies/μL。
　　(4)用本研究建立的GeXP多重PCR检测方法和OIE推荐的方法对模拟临床样本进行检测。在制备的54份模拟样品中，GeXP多重PCR检测方法的阳性率为94.87％，假阳性率为6.67％，假阴性率为5.13％。在35份单独感染的模拟样本（除CPDV）及阴性样本中，GeXP多重PCR检测方法的阳性率为95％，假阳性率为6.67％％，假阴性率为5％; OIE推荐方法检测的阳性率为70％，假阳性率为0％，假阴性为30％。结果表明，GeXP多重PCR检测方法较大程度地提高了阳性率并减小了假阴性率，可采用本研究建立的方法对临床样本进行检测。
　　总之，本研究建立的GeXP多重PCR，能同时检测牛疙瘩皮肤病病毒、传染性脓疱病毒、山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒和蓝舌病病毒，且特异性好、灵敏度高，为预防和监控上述6种牛羊病毒性病原提供了一种快速、准确、灵敏的诊断方法。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 山羊痘病毒属

1．1．1 山羊痘病毒属概述

1．1．2 山羊痘病毒属分子生物学特征

1．1．3 羊痘属病毒的诊断方法

1．2 传染性脓疱病毒

1．2．1 传染性脓疱病毒概述

1．2．2 传染性脓疱病毒的分子生物学特征

1．2．3 传染性脓疱病毒的诊断方法

1．3 蓝舌病病毒

1．3．1 蓝舌病病毒的概述

1．3．2 蓝舌病病毒的分子生物学特征

1．3．3 蓝舌病病毒的诊断方法

1．4 小反刍兽疫病毒

1．4．1 小反刍兽疫病毒的概述

1．4．2 小反刍兽疫病毒的分子生物学特征

1．4．3 小反刍兽疫病毒的诊断方法

1．5 GeXP基因表达分析系统

1．5．1 GeXP的功能和原理

1．5．2 GeXP的优势

1．5．3 GeXP的应用

第2章 引言

2．1 研究目的及意义

2．2 研究内容

2．2．1 基因序列分析及引物设计

2．2．2 GeXP单重PCR检测方法的建立

2．2．3 GeXP多重PCR检测方法的建立

2．3 技术路线

第3章 GeXP单重PCR检测方法的建立

3．1 材料、试剂及仪器

3．1．1 标准毒株及组织细胞

3．1．2 主要试剂

3．1．3 试剂配置

3．1．4 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 核酸的提取

3．2．3 目的基因的扩增

3．2．4 目的片段的克隆及测序

3．2．5 GeXP单重PCR检测体系的构建及优化

3．2．6 GeXP单重PCR检测体系的灵敏度

3．3 结果

3．3．1 引物设计

3．3．2 目的基因的扩增

3．3．3 目的片段的克隆及测序结果

3．3．4 GeXP单重PCR检测体系的优化

3．3．5 GeXP单重PCR检测体系的灵敏度

3．4 讨论

3．4．1 目的基因的选择

3．4．2 引物设计

3．4．3 GeXP单重PCR的灵敏度

3．5 小结

第4章 GeXP多重PCR检测方法的建立

4．1 材料、试剂及仪器

4．1．1 标准毒株及组织细胞

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 GeXP多重PCR检测体系的构建及优化

4．2．2 GeXP多重PCR检测体系的特异性

4．2．3 GeXP多重PCR检测体系的灵敏度

4．2．4 GeXP多重PCR检测体系的样品检测

4．3 试验结果

4．3．1 GeXP多重PCR检测体系的构建及优化

4．3．2 GeXP多重PCR检测体系的特异性

4．3．3 GeXP多重PCR检测体系的灵敏度

4．3．4 GeXP多重PCR检测体系的样品检测

4．4 讨论

4．4．1 GeXP-PCR的影响因素

4．4．2 GeXP-PCR的特异性和灵敏度

4．4．3 GeXP-PCR的优势

4．4．4 展望

4．5 小结

结论及创新点

参考文献

缩略词表

致谢

在学期间发表的文章、参与的专利及项目