基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测酶及其抑制剂的生物传感方法

摘要

本发明建立了一个基于磷脂分子修饰纳米金颗粒团聚的生物分析方法，用于生物学研究、食品检测、环境分析的通用的传感技术平台。此技术包括基于磷脂分子修饰纳米金颗粒方法；磷脂分子修饰纳米金颗粒与酶及其抑制剂的特异反应；特定磷脂分子的绑定蛋白标记纳米金颗粒技术；磷脂分子修饰的纳米金颗粒与蛋白标记的纳米金颗粒发生团聚反应引起紫外可见吸收光强度的变化，定量分析检测酶及其抑制剂。该方法灵敏度高、操作简单、特异性强，可望成为一种用于生物学研究、食品检测、环境分析的通用技术。

说明书

技术领域

本发明属于一种基于磷脂分子修饰纳米金颗粒团聚的生物分析技术，其具体涉及：基于 磷脂分子修饰纳米金颗粒方法；磷脂分子修饰纳米金颗粒与磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑 制剂的特异反应；特定磷脂分子的绑定蛋白标记纳米金颗粒；磷脂分子修饰纳米金颗粒与蛋 白标记的纳米金颗粒发生的团聚反应引起紫外可见吸收光度的变化，可定量分析检测磷酸激 酶、去磷酸化酶等及其抑制剂，及其在实际分析中的应用。

背景技术

磷酸脂酶及其抑制剂等的快速筛选与检测对于生物学研究、食品与公共安全、药毒物分 析、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的酶及其抑制剂的检测方法主要有放射 性标记法、荧光标记法以及测定酶蛋白的免疫活性等。这些检测方法或存在反应步骤复杂问 题，或灵敏度不高、可靠性差，又或需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，建立了一种基于磷脂分子修饰纳米金颗粒的团聚反应 分析检测磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的生物传感方法。该方法可将磷脂分子直接作 用于纳米金表面，操作快速、简单，通用性强，灵敏度高。

本发明的技术方案是：基于不同磷脂分子修饰的纳米金颗粒，与其相应的磷酸激酶、去 磷酸化酶等及其抑制剂发生特异反应，此反应后的纳米金颗粒与特定磷脂分子的绑定蛋白所 标记的纳米金颗粒发生团聚反应，引起紫外可见吸收光强度的变化，可定量分析检测磷酸激 酶、去磷酸化酶等及其抑制剂。其步骤包括：

(1)磷脂分子修饰纳米金颗粒；

(2)磷脂分子修饰纳米金颗粒与酶及其抑制剂的特异反应；

(3)与磷酸分子对应的磷脂分子绑定蛋白标记纳米金颗粒；

(4)经步骤(2)特异反应后的纳米金与步骤(3)蛋白标记的纳米金混合反应；

(5)定量分析检测酶及其抑制剂。

其中，所述的酶及其抑制剂是磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂；

其中，所述的磷脂分子为PIP2，PIP3，DPPC等；

其中，步骤(1)所述磷脂分子修饰纳米金颗粒是直接合成带有表面活性剂修饰的纳米 金颗粒，再将含磷脂分子溶液加入到修饰表面活性剂的纳米金溶液中，于纳米金表面直接形 成单分子磷脂层。表面活性剂修饰的纳米金颗粒表面可以直接修饰各种不同的磷脂分子 (PIP2，PIP3，DPPC等)形成单分子磷脂层，此时的纳米金颗粒可与磷脂分子对应各种不 同的磷酸激酶、去磷酸化酶等(PI3K，PTEN，PLD等)及其抑制剂发生特异反应，产生团 聚现象，实现对磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的检测；

其中，步骤(3)中与修饰的不同磷脂分子对应的磷脂分子绑定蛋白直接标记于纳米金 颗粒表面。

以下对本发明做出进一步说明。

1、磷脂分子修饰纳米金颗粒及其与磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的特异反应

a、冰水浴中新鲜配制的0.1M NaBH₄在搅拌状态下加入到4％HAuCl₄与0.01M柠檬酸 钠混合物中，制备成种子液备用。4％HAuCl₄溶液中加入表面活性剂，搅拌状态下加热制成 生长液。将种子液加入到生长液中，搅拌混合，制备成合适尺寸的表面修饰表面活性剂的纳 米金溶液。将合成好的纳米金溶液与PB(50mM；pH＝7.4)以体积比1∶2的比例混合后，浓缩离 心洗涤三次(4℃；10000r/min；15min)。

b、将不同的磷脂分子溶液加入到a溶液中，持续搅拌，使磷脂分子直接修饰到纳米金 颗粒上。

c、在磷脂分子修饰纳米金溶液加入牛血清蛋白(BSA)于37℃恒温水浴下封闭10min， 再将酶及其抑制剂加入此纳米金溶液中，30℃恒温水浴反应。

2、与磷酸分子对应的磷脂分子绑定蛋白标记纳米金颗粒

a、250ml超纯水中加入2.5ml 1％HAuCl₄加热沸腾后，再加入1％新配制的柠檬酸钠， 继续加热搅拌至溶液呈酒红色，以制备好裸纳米金溶液。将纳米金溶液与超纯水以1∶2的体 积比混合浓缩离心洗涤。洗涤之后以0.1mol/LK₂CO₃调节溶液pH值至待标记的特定磷脂分 子的绑定蛋白的等电点略偏碱。

b、将磷脂分子的绑定蛋白融入相应的缓冲液，搅拌状态下，逐滴加入裸纳米金溶液中。 完毕后，继续搅拌30min，再将溶液放入4℃冰箱内冷藏老化过夜(避光，备用)。

3、磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂的定量分析检测

a、与磷酸激酶、去磷酸化酶等及其抑制剂反应后的磷脂分子修饰纳米金溶液和磷脂分 子绑定蛋白标记纳米金溶液混合反应，于37℃恒温水浴反应10min。纳米金表面的磷脂分 子与其特定的绑定蛋白发生特异性结合，引起纳米金之间距离发生改变，产生团聚反应。

b、将a中反应后的溶液取出于紫外比色皿中进行测量，不同磷酸激酶、去磷酸化酶等 及其抑制剂的反应浓度与紫外可见吸收光强度的定量关系可用于磷酸激酶、去磷酸化酶等及 其抑制剂的定量分析检测。

具体实施方式

实施例1：基于PIP2修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测磷酸激酶(Phosphoinositide 3 kinase)及Phosphoinositide 3 Inhibitor的生物传感方法

一、检测磷酸激酶(Phosphoinositide 3 kinase)的方法与步骤：

(1)冰水浴中新鲜配制的60uL 0.1M NaBH₄在搅拌状态下加入到2mL4％HAuCl₄与 0.01M柠檬酸钠混合物中，制备成种子液备用。4％HAuCl₄溶液中加入十六烷基三甲基溴化 铵(CTAB)，搅拌状态下加热制成生长液。将种子液加入到生长液中，搅拌混合，制备成颗 径约为10nm左右的纳米金溶液。将合成好的纳米金溶液与PB(50mM；pH＝7.4)以体积比1∶2 的比例混合后，浓缩离心洗涤三次(4℃；10000r/min；15min)。将0.64mM PIP₂加入到CTAB 修饰的纳米金溶液中，持续搅拌，使PIP₂直接修饰到纳米金颗粒上。在PIP₂修饰的纳米金 溶液加入1％BSA，于37℃恒温水浴下封闭10min。再将Phosphoinositide 3 kinase(2.4U/g～2.4 ×10^-10U/g)加入此纳米金溶液中，30℃恒温水浴反应，在酶的作用下产生PIP₃修饰的纳米金 溶液。

(2)250ml超纯水中加入2.5ml 1％HAuCl₄加热沸腾后，再加入1％新配制的柠檬酸钠， 继续加热搅拌至溶液呈酒红色，以制备好裸纳米金溶液。将纳米金溶液与超纯水以1∶2的体 积比混合浓缩离心洗涤。洗涤之后以0.1mol/LK₂CO₃调节溶液pH值至8左右。将10ul 0.002M PIP₃绑定蛋白溶液搅拌状态下，逐滴加入裸纳米金溶液中。完毕后，继续搅拌30min，再将溶 液放入4℃冰箱内冷藏老化过夜(避光，备用)。

(3)与Phosphoinositide 3 kinase作用后产生的PIP₃修饰纳米金溶液和PIP₃绑定蛋白标 记纳米金溶液混合反应，于37℃恒温水浴反应10min。纳米金表面的PIP₃与其绑定蛋白发 生特异性结合，引起纳米金团聚，产生紫外信号。不同Phosphoinositide 3 kinase的浓度 (2.4U/g～2.4×10^-10U/g)与紫外可见吸收光强度(400～800nm波长范围)的定量关系可用于 Phosphoinositide 3 kinase的定量分析检测。

二、检测磷酸激酶抑制剂(Phosphoinositide 3 Inhibitor)的方法与步骤：

在检测Phosphoinositide 3 kinase的步骤(1)中，加入Phosphoinositide 3 kinase后，同 时再加入5ul 325uM的Phosphoinositide 3 Inhibitor。Inhibitor的加入阻止了kinase的作用， 纳米金的团聚作用也相应受到阻碍，同样引起紫外可见吸收光强度(400～800nm波长范围)的 相应变化，其定量关系可用于Phosphoinositide 3 Inhibitor的分析检测。

实施例2：基于PIP₃修饰纳米金颗粒的团聚反应分析检测去磷酸化酶(PTEN)的生物 传感方法

(1)冰水浴中新鲜配制的60uL 0.1M NaBH₄在搅拌状态下加入到2mL4％HAuCl₄与 0.01M柠檬酸钠混合物中，制备成种子液备用。4％HAuCl₄溶液中加入十六烷基三甲基溴化 铵(CTAB)，搅拌状态下加热制成生长液。将种子液加入到生长液中，搅拌混合，制备成颗 径约为10nm左右的纳米金溶液。将合成好的纳米金溶液与PB(50mM；pH＝7.4)以体积比1∶2 的比例混合后，浓缩离心洗涤三次(4℃；10000r/min；15min)。将0.6mM PIP₃加入到CTAB 修饰的纳米金溶液中，持续搅拌，使PIP₃直接修饰到纳米金颗粒上。

(2)250ml超纯水中加入2.5ml 1％HAuCl₄加热沸腾后，再加入1％新配制的柠檬酸钠， 继续加热搅拌至溶液呈酒红色，以制备好裸纳米金溶液。将纳米金溶液与超纯水以1∶2的体 积比混合浓缩离心洗涤。洗涤之后以0.1mol/LK₂CO₃调节溶液pH值至8左右。将10ul 0.002M PIP₃绑定蛋白溶液搅拌状态下，逐滴加入裸纳米金溶液中。完毕后，继续搅拌30min，再将溶 液放入4℃冰箱内冷藏老化过夜(避光，备用)。

(3)本来PIP₃修饰纳米金溶液和PIP₃绑定蛋白标记纳米金溶液混合后，由于PIP₃与 其绑定蛋白发生特异性结合，引起纳米金团聚，产生紫外信号。但是，如果在PIP₃修饰的 纳米金溶液加入1％BSA，于37℃恒温水浴下封闭10min，再将PTEN(2pM～2aM)加入此纳 米金溶液中，30℃恒温水浴反应30min，在PTEN的作用下产生PIP₂修饰的纳米金溶液。 此时，PIP₂修饰的纳米金将不会与PIP₃的绑定蛋白发生特异性结合，纳米金则不会发生团聚， 从而引起紫外可见吸收光强度的逆向变化。不同PTEN的浓度(2pM～2aM)与紫外可见吸收 光强度(400～800波长范围)的定量关系可用于PTEN的定量分析检测。