拟南芥白粉病抗病性抑制基因EDTS3的克隆及应用

摘要

本发明涉及一种拟南芥白粉病抗病性抑制基因EDTS3的分离克隆、功能验证及应用。本发明还涉及所述EDTS3基因的突变基因、所述EDTS3基因编码的蛋白及其应用。

说明书

技术领域

本申请涉及植物基因工程技术领域，具体涉及在模式植物拟南芥中 对白粉菌抗性的正调控因子的克隆、功能验证及应用。

背景技术

白粉病是由真菌中的白粉菌科引起的植物病害。当植物被侵染发病 时，会产生大量由菌丝体、分生孢子梗和分生孢子构成的肉眼可见的白色 粉状物并由此而得名。白粉病在全世界分布广泛，危害双子叶植物尤为普 遍。同时它也侵染多种禾本科植物，如小麦、大麦、燕麦和多种牧草。例 如小麦白粉病是由专化性寄生真菌禾布氏白粉菌引起，是影响小麦生产的 主要病害之一。在我国小麦白粉病曾连续几次大流行，造成了重大的经济 损失。

由于自然界中存在各种各样的病原菌，植物在长期的协同进化中逐渐 形成了多层次的防御体系，它主要包括非寄主抗性、基础抗性以及抗病基 因介导的抗性。

非寄主抗性主要通过植物自身结构和次生代谢物防御，如植物细胞骨 架和从头合成植物抗毒素-抗菌复合物，所以具有广谱、抗性强烈和持久的 特点，是植物可以抵御大多数潜在病原菌侵染的主要原因。

基础抗性又名基于病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)激发的抗性(PAMP-Triggered Immunity，PTI)。病原相关 分子模式是寄主自身没有，但在病原菌中却广泛存在，且对其生活史又至 关重要并高度保守的分子特征，如细菌的鞭毛蛋白、延伸因子，真菌中的 脂多糖和几丁质等。寄主细胞表面的受体能识别这些分子，并激活下游的 MAPK的级联信号通路，最终将信号传递入核，激活WKRY蛋白诱导病 程(Pathogen-Responsive，PR)基因的表达，活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的产生和葡聚糖(callose)在侵入点的积累(1)，从而抵御病原 菌的入侵。基础抗性的特点是抗谱广，但通常抗性程度较低。

抗病基因介导的抗性又名效应因子激发的抗性(Effector Triggered Immunity，ETI)。在寄主植物进化出PTI之后，部分病原菌演化出新的侵 染机制。例如，细菌利用III型分泌系统将效应因子直接导入植物细胞内部， 来抑制PTI的产生。为了抵抗这些病原菌的侵染，植物进化出了抗病基因 (Resistance gene，R基因)来识别效应因子(这时就可以称为Avr蛋白)并诱导 过敏反应(Hypersensitive Response，HR)的发生来限制病原菌的生长和蔓 延(Chisholm et al.，2006)。R基因介导的抗性的特点是特异性强，抗谱窄， 抗性较高。

植物的抗病反应常受体内的三种信号分子的调节与控制，这些信号分 子分别是水杨酸SA，茉莉酸JA和乙烯ET。其中SA是各种植物抗病反 应的中心调控因子，是建立(System Acquire Resistance，SAR)的基础。而 由JA/ET介导的抗病信号通路与SA通路是相互拮抗的。较为典型的例子 就是假单胞杆菌产生类似JA/MeJA的一种植物生长物质冠菌素(coronatine) 来抑制SA-介导的抗性，从而降低植物的抗性(2)。

目前，抗病基因克隆方法主要有：扣除杂交法、酵母双杂交系统、图 位克隆技术、转座子标签法和同源基因克隆等。对于模式植物拟南芥，图 位克隆分离基因成为最主要的方法之一，尤其是全基因组测序计划的完成 和各种分子标记的发现，以及DNA提取方法的日趋简化，使克隆基因花 费时间大幅缩短。

目前的抗病研究表明，拟南芥和其他双子叶植物和单子叶禾本科植物 在抗病的分子机理上是相似的。与R基因相比，抗病相关基因可以为植物 提供更为广谱和长效的抗性。利用模式植物克隆植物抗病相关基因的目 的，是为了寻找重要植物中具有类似功能的同源基因，通过植物基因工程 技术，提高植物对病原菌的广谱抗性。

从拟南芥中克隆的抗病基因在生产上有潜在的应用价值。例如，RPW8 是在拟南芥上克隆的一个抗病基因，NPR1是在拟南芥中克隆的一个抗病 反应的重要调控因子。在烟草中过表达RPW8基因能提高烟草对白粉病菌 的抗性；在水稻中过表达拟南芥基因NPR1能提高水稻对细菌的抗性。

EDR1，EDR2和EDR3是拟南芥中调控白粉病抗性的相关基因，这些 基因的突变导致植物对白粉菌的抗病性增强以及诱导产生的细胞死亡 (Program Cell Death)(3-5)。其中，EDR1编码一个蛋白激酶，与乙烯反应 中的CTR1具有很高的同源性；EDR3编码一个大分子的GTPase。edr2 突变体，与edr1，edr3具有类似的表型，也具有增强的白粉病抗性及乙烯 衰老反应，而且它的抗病性也需要水杨酸信号通路，不需要茉莉酸或乙烯 信号通路。EDR2编码一个新型的蛋白，具有三个结构域，包括一个 Pleckstrin Homology(PH)结构域，一个STeroidogenic Acute Regulatory protein-related lipid-Transfer(START)结构域以及一个功能未知但序列保 守的羧基端结构域DUF1336。前两个区域的功能可能是与脂类结合，而 羧基端结构域则可能参与蛋白与蛋白的相互作用。EDR2具有两个脂类分 子结合区，暗示脂类代谢与白粉病的抗病性以及植物细胞的程序性死亡密 切相关。

以edr2为切入点，利用模式植物拟南芥的研究较为完整和系统，技术 较为先进和成熟的优势，挖掘抗病相关基因，加快对抗病基因功能的了解 及信号通路乃至网络结构的认识拓展，将很有可能为农作物的抗病防治和 分子设计育种提供理论依据和技术支持。

发明内容

本申请包括在模式植物拟南芥中对白粉菌抗性的正调控因子EDTS3 的克隆、功能验证及应用。EDTS3基因的突变可以抑制拟南芥突变体edr2 的白粉菌抗性，并同时抑制白粉菌诱导产生细胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)。

(1)一种拟南芥抗白粉病抑制基因EDTS3序列，CDS全长序列264bp， 无内含子。其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

(2)一种拟南芥抗白粉病相关基因EDTS3编码的蛋白序列，编码87 个氨基酸，大小9.784kD。其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

(3)EDTS3基因突变丧失自身功能后，表现出抑制edr2突变体的白 粉菌抗性并抑制受白粉菌诱导产生细胞死亡。其表型见图1。

(4)根据EDTS3基因突变后的抑制抗病表型，可以通过基因工程技 术使其表达量升高，从而提高蔬菜及作物的抗病性。

具体内容如下：

1.一种拟南芥白粉病抗病性抑制基因EDTS3，其为下列核苷酸序列之 一：

1)SEQ ID No.1的核苷酸序列；

2)与SEQ ID No.1的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功 能蛋白质的核苷酸序列。

2.一种蛋白质，其由以上1的基因EDTS3编码。

3.以上2的蛋白质，其为：

1)由SEQ ID No.2的氨基酸序列所示的蛋白；或

2)将(1)的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且 具有与(1)相同的功能的由(1)衍生的蛋白。

4.以上1的基因EDTS3的突变基因edts3，其核苷酸序列与SEQ ID No. 1的核苷酸序列的区别在于其中发生A104G突变。

5.以上4的突变基因edts3编码的蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID No. 2的氨基酸序列的区别在于其中发生R35K突变。

6.以上1的基因EDTS3或以上2或3的蛋白质用于调控(增强或抑 制)植物抗白粉病抗性或调控(促进或抑制)白粉菌诱导产生细胞程序性 死亡的应用，其中所述植物包括拟南芥、大麦、小麦，优选为拟南芥突变 体edr2。

7.以上6的应用，其中增强植物抗白粉病抗性或促进白粉菌诱导产生 细胞程序性死亡的应用通过在所述植物中过量或超量表达以上1的基因 EDTS3或以上2或3的蛋白质来实现，抑制植物抗白粉病抗性或抑制白粉 菌诱导产生细胞程序性死亡的应用通过在所述植物中抑制以上1的基因 EDTS3或以上2或3的蛋白质的表达来实现，其中抑制权利要求1的基因 EDTS3或权利要求2或3的蛋白质的表达可以通过使权利要求1的基因 EDTS3发生失功能突变来实现。

8.以上4的突变基因edts3用于抑制植物抗白粉病抗性和抑制白粉菌 诱导产生细胞程序性死亡的应用，其中所述植物包括拟南芥、大麦、小麦， 优选为拟南芥突变体edr2。

附图说明

图1.野生型和突变体edr2，edts3/edr2生长4-6周后接种白粉病菌(G. cichoracearum)8天后的表型(上)，Trypan blue染色结果(下)。

图2.通过图位克隆的方法分离EDTS3基因的略图。

图3.野生型、突变体edr2，edts3/edr2和互补载体转化突变体 edts3/edr2(T1)生长4-6周后接种白粉病菌(G.cichoracearum)8天后的 表型。

具体实施方式

实施例一  edts3突变体抑制抗病表型分析

1.edts3/edr2突变体抑制edr2突变体的白粉病抗性及白粉菌诱导的细胞死 亡

(1)材料和方法

edts3/edr2(其中edts3是enhanced disease resistance two suppressor 3) 是通过用0.03％EMS(购自sigma公司)诱变突变体edr2(4)，从诱变群体 中筛选出得到的一个可以抑制edr2白粉病菌抗性增强的突变体。进而将得 到的一个突变体命名为edts3/edr2。

首先，把突变体edr2，edts3/edr2和野生型col-0(购自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC))的种子播到MS培养基(商购自 PhytoTechnology Laboratories)，在4℃春化2-3天后，转移到9h light/15h dark光照条件下的植物生长室。大约7-10天，把幼苗移至土中。在幼苗 生长4-6周后，接种白粉病菌(G.cichoracearum)(6)。该白粉病菌用拟南 芥的一个对该白粉病菌易感的突变体pad4(7)保存。接菌时将生长有大量 白粉孢子的pad4的植株轻轻地刮在待接白粉的植物叶片上，然后将接完 菌的植物先用保鲜膜覆盖保湿1天，后移去保鲜膜，植物继续生长7天后， 进行抗病表型鉴定。将具有典型表型的叶片剪下，照相并进行trypan blue 染色。

(2)结果与分析

在接种白粉菌8天后，野生型和双突变体edts3/edr2的叶片上长满白 粉，而突变体edr2的叶片上基本上无可见的白粉菌孢子，并且表现白粉菌 诱导的细胞死亡。染色也证明了上述结果：野生型和双突变体edts3/edr2 的叶片布满了菌丝和分生孢子梗，而突变体中死亡的叶肉细胞被染成蓝色 (图1)。上述结果表明edts3/edr2突变体抑制了edr2白粉菌抗性。

实施例二EDTS3基因的获得

1.利用图位克隆分离出EDTS3基因

我们利用图位克隆分离了EDTS3基因。具体做法是：突变体 edts3/edr2与生态型Lansberg(商购自ABRC)做杂交，获得的F1代自交 产生F2代。在F2代，选择含有edr2突变的野生型表型的单株，然后使 其自交产生F3代。在F3代各株系中选择野生型的个体，通过PCR方法 及利用均匀分布在5条染色体上染色体的定位标记 (http://signal.salk.edu/genome/SSLP_info/SSLPsordered.html)，将基因初步 定位在第1条染色体断臂的前端。随后，又利用大约3000株F3代单株， 将基因精细定位在F9H16和F26F24之间40kb的区域(8)(图2)。此区域 包括12个基因。通过测序发现在基因At1g21327的CDS中含有一个碱基 突变A104G，而其他基因没有任何变化，从而确定该基因为EDTS3基因 的候选基因。

2.EDTS3基因的结构

EDTS3CDS全长264bp，不含有内含子；EDTS3蛋白是一个丝氨酸丰 富的小蛋白，其中有一个低复杂度结构域由23个氨基酸组成。

实施例三EDTS3基因的功能验证

为验证edts3突变对edr2突变体白粉菌的抗性抑制是否由于 At1g21327碱基突变引起，我们构建了带自身启动子的At1g21327的遗传 转化载体，利用花侵染的方法转化双突变体edts3/edr2植株，在T1代，转 基因株系恢复了edr2突变体的表型。

我们以野生型col-0的DNA为模板，用一对PCR引物F：5′- AACTGCAGAAGTGGTGCTCACGTTGTTGTATTT-3′和R： 5′-AACTGCAGAAGTGGTGCTCACGTTGTTGTATTT-3′扩增出带有 KpnI和PstI的5.7kb的At1g21327基因片段。

PCR反应体系

DNA：            2.0ul

10xbuffer：      5.0ul

dNTPs(2.0mM)：   5.0ul

MgSO4(25mM)：    2.0ul

引物F(10uM)：    1.6ul

引物R(10uM)：    1.6ul

KOD Taq(1U)：    1.0ul

H2O：31.8ul

PCR反应程序：预变性，95℃3分钟；热循环，变性95℃30秒钟， 退火55℃30秒钟，延伸72℃5分钟，循环数30个。

整个片段包括3.6Kb的启动子区、0.26kb的编码区和1.8Kb的3′-UTR。 扩增的片段与pCAMBIA1300(9)同时双酶切(KpnI和PstI，购自TaKaRa 公司，37℃)、连接(T4连接酶(购自NEB公司)，16℃)和热激法转化 大肠杆菌E.coli DH10B(购自全式金公司)后，经测序(华大基因公司) 鉴定正确的质粒，随后用冻融法转化农杆菌GV3101(9)。用花浸染的方 法(10)转化双突变体edts3/edr2植株，7周后获得T1代种子。对种子消毒、 清洗，然后播种到添加潮霉素(80μg/ml)的MS培养基中。7-10天后， 选出T1代转基因阳性植株。

在22℃，9h light/15h dark条件下，当幼苗长到4-6周，我们同时把 野生型、突变体和转基因T1代接种白粉菌，8天后观察表型。结果 At1g21327基因的转入完全互补了双突变体edts3/edr2表型，表现为edr2 表型(见图3)。由此表明突变体的抗病表型由于At1g21327基因的突变引 起。因此EDTS3基因即为At1g21327基因。

实施例四 拟南芥白粉菌抗性相关基因EDTS3在作物抗病改良中的应用

EDTS3基因突变丧失自身功能后，表现出抑制edr2突变体的白粉菌 抗性并抑制受白粉菌诱导产生细胞死亡。根据这一特性可以通过基因工程 技术使其过量或者超量表达，从而提高蔬菜及作物的抗病性，培育具有抗 病性状的作物品种。

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