具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白质及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白质及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，为如下(a)或(b)或(c)：(a)序列表中序列1自N末端第23至883位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供的蛋白质可以高效降解pNP-GlcNAc，从而可以作为饲料添加物用于制备饲料中。本发明具体有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白质及其编码基因和应 用。

背景技术

几丁质又名甲壳素、几丁聚糖，是N-乙酰氨基葡萄糖的β-1，4糖苷键多聚物。 几丁质广泛存在于低等植物、菌类、藻类，节肢动物虾、蟹及昆虫的外壳和软骨，高等 植物的细胞壁等，是自然界中仅次于纤维素的第二大天然生物有机资源，年生物合成量 达100亿吨。

微生物对几丁质的有效降解通过几丁质酶(chitinase，EC 3.2.1.14)和几丁二 糖酶即β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase，Nag，EC 3.2.1.52) 等的协同作用得以实现。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白质及其编码基 因和应用。

本发明提供的蛋白质，获自维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)，命名为NAG565蛋 白，是如下(a)或(b)或(c)：

(a)序列表中序列1自N末端第23至883位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)或(b)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨 基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

  标签   残基   序列   Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR   Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH   FLAG   8   DYKDDDDK   Strep-tag II   8   WSHPQFEK   c-myc   10   EQKLISEEDL

上述(c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(c)中的蛋白质的编码基因可通过将(a)或(b)的编码基因中缺失一个或几个氨 基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′ 端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’末端第第67至2649位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有β-N-乙酰氨基葡萄 糖苷酶活性的蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有β-N-乙酰氨基葡萄 糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂 交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保 护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外 源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达 的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基 因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型 启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重 组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以 是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证 整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的， 也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛 选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因， 直接根据表型筛选。

所述重组表达载体具体可为所述基因插入载体pET28a(+)的多克隆位点得到的重组 质粒。

所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆 菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还保护一种制备所述蛋白质的方法，包括如下步骤：

(1)培养所述重组菌并在培养过程中加入IPTG进行诱导；

(2)将完成步骤(1)的培养体系离心收集沉淀，超声破碎后收集上清液即为含有 所述蛋白质的溶液。

所述方法具体包括如下步骤：

(1)将所述重组菌培养至OD₆₀₀＝0.6，然后加入IPTG并使其初始浓度为1mol/L，然后 18℃振荡培养12h；

(2)将完成步骤(1)的培养体系离心收集沉淀，超声破碎后收集上清液，即为含 有所述蛋白质的溶液。

所述方法更具体包括如下步骤：

(1)所述重组菌在液体LB培养基(含100μg/mL卡那霉素)中37℃振荡培养至 OD₆₀₀＝0.6，然后加入IPTG并使其初始浓度为1mol/L，然后18℃、180×g振荡培养12h；

(2)将完成步骤(1)的培养体系10,000×g离心5min收集沉淀，超声破碎后收集上 清液，即为含有所述蛋白质的溶液。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对均属于本发明的保护范围。所述引物对具 体可为序列表的序列3所示DNA片段和序列表的序列4所示DNA片段组成的引物对。

本发明还保护所述蛋白作为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的应用。所述应用中，所述 蛋白的底物可为pNP-GlcNAc、pNP-(GlcNAc)₂、pNP-(GlcNAc)₃、几丁二糖、几丁三糖、 几丁四糖、几丁五糖和几丁六糖中的至少一种。

本发明还保护所述蛋白在制备饲料中的应用。

本发明提供的蛋白质是一种几丁二糖酶，具有高比活力、宽松的应用范围和良好的 稳定性，可作为饲料添加剂应用于水生动物的养殖，具有重大应用前景。

附图说明

图1为CTP溶液和NAG565蛋白液的SDS-PAGE分析，M：Marker；1：CTP溶液；2： NAG565蛋白液。

图2为NAG565蛋白的最适pH。

图3为NAG565蛋白的pH稳定性。

图4为NAG565蛋白的最适温度。

图5为NAG565蛋白的热稳定性。

图6为NAG565蛋白的蛋白酶抗性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。以下实施例中的定量试 验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明， 均为常规方法，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook 等人，Molecular Cloning，ALaboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene  Transfer and Expression ：A Laboratory Manual(1990)；和Curren t Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人编，1994)。实施例中检测蛋白浓度的方法为Bradford 法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到 的国产分析纯试剂。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞、大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)感受态细胞均购自北京全式金公司。连接酶购自NEB公司。胰蛋白酶(Trypsin)、 α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)、蛋白酶K(Proteinase K)、胶原蛋白酶(Collagenase) 为Sigma(USA)产品。胃蛋白酶(Pepsin)为Amano Enzyme Inc.(Japan)产品。IPTG为 Promega公司产品。Anti-His抗体、羊抗鼠IgG-HRP及Western Blot膜封闭液均购自北 京天根生化科技有限公司。

载体pET28a(+)：购自Invi trogen公司。

对硝基酚(4-Nitrophenol或pNP)：购自Sigma公司，产品目录号N7660。

pNP-GlcNAc(4-Nitrophenyl N-acetyl-α-D-glucosaminide)：购自Sigma公司， 产品目录号N8759。

pNP-(GlcNAc)₂(4-Nitrophenyl N，N’-Diacetylchitobiose)：购自Sigma公司， 产品目录号N6133。

pNP-(GlcNAc)₃(4-Nitrophenyl N，N’，N”-Triacetylchitotriose)：购自Sigma 公司，产品目录号N8638。

气单胞菌(Aeromonas sp.)B565，已于2010年12月03日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号)，保藏号为CGMCC No.4403。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为NAG565蛋白，由883个氨基酸残基组成，自 N末端第1至22位为信号肽。将NAG565蛋白的编码基因命名为NAG565基因，其开放阅 读框如序列表的序列2所示(2649bp)。

实施例1、NAG565蛋白的制备

一、重组质粒NAG565-pET28a(+)的构建

1、提取气单胞菌B565的基因组DNA。

2、以步骤1的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增 产物。

F1(序列表的序列3)：5’-CCCGAATTCGCCGATGCCGCCAAGCAGGC-3’；

R1(序列表的序列4)：5’-TATGCGGCCGCGACGCGGCTGGTGCGCT-3’。

3、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切载体pET28a(+)，回收载体骨架(约5300bp)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒NAG565-pET28a(+)。 根据测序结果，对重组质粒NAG565-pET28a(+)进行结构描述如下：在载体pET28a(+) 的EcoRI和NotI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第67至2649位核苷酸所示 的DNA片段。

二、重组菌和对照菌的构建

将重组质粒NAG565-pET28a(+)热激转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组 菌。将载体pET28a(+)热激转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到对照菌。

三、NAG565蛋白和对照蛋白的制备

1、将步骤二构建的重组菌接种于3mL液体LB培养基(含100μg/mL卡那霉素)，37℃ 振荡培养过夜，得到种子液。

2、将100μL种子液转接至10mL液体LB培养基(含100μg/mL卡那霉素)中，37℃振荡 培养约3h(OD₆₀₀＝0.6)，加入IPTG(使其初始浓度为1mol/L；IPTG为诱导剂)，18℃、180×g 振荡培养12h(从加入IPTG开始计时)。

3、将步骤2得到的培养液10,000×g离心5min，分别收集培养上清和细胞沉淀。

4、将步骤3得到的细胞沉淀用pH8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液重悬，超声破碎，然后 10,000×g离心10min，收集上清，即为含细胞总蛋白的溶液(简称CTP溶液)。

将步骤二构建的对照菌代替重组菌进行步骤1至4的操作，获得含细胞总蛋白的溶液 (简称对照溶液)。

四、CTP溶液和对照溶液的酶活测定(pNP-GlcNAc法)

酶活(U)单位定义：每分钟分解pNP-GlcNAc释放1μmol对硝基酚(pNP)所需的酶 量定义为一个酶活单位(1U)。单位体积内待测溶液的酶活除以单位体积内待测溶液的蛋 白含量，即为蛋白的比活力。

酶活测定方法：将pNP-GlcNAc溶于缓冲液中，使其终浓度为1mM，即为底物溶液。试 验管：将10μL待测溶液、240μL缓冲液和250μL底物溶液在试管中混合并摇匀，37℃ 温育5min，然后加入2mL 0.5M NaOH水溶液终止反应，在405nm处测OD值。对照管：在试 管中依次加入10μL待测溶液，240μL缓冲液、2mL 0.5M NaOH水溶液和250μL底物溶液， 在405nm处测OD值。将对硝基酚作为标准品制作标准曲线，标准曲线函数为： y＝(0.169x-0.0153)×100×N/5；y：酶活(U/mL)，x：OD值，100：将10μL待测溶液中 的酶活折算为1mL的酶活性，N：稀释倍数。

分别将步骤三的3得到的培养上清、步骤三的4得到的CTP溶液和步骤三得到的对照溶 液作进行酶活测定。酶活测定中采用的缓冲液为pH7.0、20mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲 液。对照溶液的酶活为0U/ml，CTP溶液的酶活为1562U/ml(比活力为1243U/mg)。结果 表明，NAG565蛋白主要在大肠杆菌胞内表达。

五、NAG565蛋白的纯化

将步骤四得到的CTP溶液进行His标签融合蛋白亲和层析纯化。

His标签融合蛋白亲和层析的填充物为Ni-NTA树脂，购自上海生工生物工程公司(产 品目录号BSP033)，装柱量为1mL。

洗脱过程中的各个缓冲液如下(pH均为7.6)：

NTA-0：含20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油，其它为水；

NTA-20：含20mmol/L Tris-HCl，20mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油， 其它为水；

NTA-40：含20mmol/L Tris-HCl，40mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油， 其它为水；

NTA-60：20mmol/L Tris-HCl，60mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油， 其它为水；

NTA-80：20mmol/L Tris-HCl，80mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油， 其它为水；

NTA-100：20mmol/L Tris-HCl，100mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油， 其它为水；

NTA-200：20mmol/L Tris-HCl，200mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油， 其它为水；

NTA-300：20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油， 其它为水。

洗脱过程(每次加5mL，完全流出柱子后再加5mL)：

(1)柱子用水平衡20mL；

(2)用NTA-0平衡20mL，上样5mLCTP溶液；

(3)用NTA-0洗脱25mL(去杂蛋白)，然后依次用NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、 NTA-100、NTA-200、NTA-300各5mL洗脱，并收集NTA40-80洗脱的过柱后溶液(NAG565蛋 白液)。

将步骤四制备的CTP溶液和步骤五制备的NAG565蛋白液进行SDS-PAGE电泳，见图1， 纯化后的蛋白显示95kDa的单一条带，与预期分子量相符。

六、NAG565蛋白的酶活测定

将步骤五得到的NAG565蛋白液作为待测溶液，其它完全同步骤四。NAG565蛋白液 的酶活力为2257U/mL，比活力为7328U/mg。

实施例2、NAG565蛋白的酶学性质

将实施例1的步骤五得到的NAG565蛋白液作为待测溶液，依次进行如下各个酶学性 质之间：

一、NAG565蛋白的最适pH

酶活测定方法同实施例1的步骤四。

酶活测定中分别采用如下缓冲液：pH3.0、0.1M的乙酸钠缓冲液，pH4.0、0.1M的乙 酸钠缓冲液，pH5.0、0.1M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0、0.1M的磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液，pH7.0、0.1M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH8.0、0.1M的Tris-HCl 缓冲液，pH9.0、0.1M的Tris-HCl缓冲液，pH10.0、0.1M的甘氨酸-NaOH缓冲液，pH11.0、 0.1M的甘氨酸-NaOH缓冲液。

NAG565蛋白在pH7.0的环境中酶活最高，比活力为7301U/mg。以该最高比活力为100％， 计算NAG565蛋白在其它pH环境中的相对酶活，见图2。NAG565蛋白在pH8.0的环境中，可 以保持80％以上的相对酶活。

二、NAG565蛋白的pH稳定性

酶活测定方法：

将pNP-GlcNAc溶于缓冲液中，使其终浓度为1mM，即为底物溶液。

试验管：将10μL待测溶液和240μL缓冲液在试管中混合并37℃温育12小时，然后加 入250μL底物溶液混合并37℃温育5min，然后加入2mL 0.5M NaOH水溶液终止反应，在 405nm处测OD值。

对照管：将10μL待测溶液和240μL缓冲液在试管中混合并37℃温育12小时，然后依 次加入2mL 0.5M NaOH水溶液和250μL底物溶液，在405nm处测OD值。

NAG565蛋白在pH7.0的环境中稳定性最高，37℃温育12小时后的比活力为6350U/mg。 以该最高比活力为100％，计算NAG565蛋白在其它pH环境中37℃温育12小时后的相对酶活， 见图3。NAG565蛋白在pH范围为5.0-9.0间都很稳定，保持70％以上的相对酶活。

三、NAG565蛋白的最适温度

酶活测定中除了温育温度，其它同实施例1的步骤四。酶活测定中分别采用如下温育 温度：0℃、20℃、30℃、37℃、50℃、60℃和70℃。酶活测定中采用pH7.0、0.1M的 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

NAG565蛋白在37℃的环境中酶活最高，比活力为7321U/mg。以该最高比活力为100％， 计算NAG565蛋白在其它温度环境中的相对酶活，见图4。NAG565蛋白在20℃的缓冲中，可 以保持40％左右的酶活。

四、NAG565蛋白的热稳定性

酶活测定方法：

将pNP-GlcNAc溶于缓冲液中，使其终浓度为1mM，即为底物溶液。

试验管：在试管中将10μL待测溶液不同温度(0℃、20℃、30℃、37℃、50℃、60 ℃或70℃)温育30min，然后加入240μL缓冲液和250μL底物溶液，混匀，37℃温育5min， 然后加入2mL 0.5M NaOH水溶液终止反应，在405nm处测OD值。

对照管：在试管中将10μL待测溶液不同温度温育30min，然后依次加入240μL缓冲 液、2mL 0.5M NaOH水溶液和250μL底物溶液，在405nm处测OD值。

酶活测定中采用pH7.0、0.1M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

NAG565蛋白在30℃的环境中稳定性最高，30℃温育30min后的比活力为6187U/mg。以 该最高比活力为100％，计算NAG565蛋白在其它温度环境中30℃温育30min后的相对酶活， 见图5。NAG565蛋白在70℃以上完全失去活性，在30-70℃之间，随着处理温度的升高， 酶活逐渐降低，30℃以下的处理对酶活性没有影响。

实施例3、NAG565蛋白的动力学常数

在37℃测定实施例1的步骤五得到的NAG565蛋白对不同浓度(1、2、5、10、50、100、 500、1000μmol/L)的底物的反应初速度(酶活检测方法同实施例1的步骤四)，经 Lineweaver-Burk绘图得出该酶对3种底物的K_m和V_max值。底物分别为pNP-GlcNAc、 pNP-(GlcNAc)₂和pNP-(GlcNAc)₃。

结果见表2。在3种底物中，pNP-GlcNAc的K_m值最小，V_max值最大。

表2NAG565蛋白对各种底物的动力学常数

实施例4、NAG565蛋白的底物特异性

一、NAG565蛋白对几丁寡糖的降解

1、将底物(几丁寡糖)以4mM的浓度溶解于pH7.0、10mM的磷酸缓冲液中，即为 底物溶液。几丁寡糖分别采用以下几种：几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖或 几丁六糖，均购自TRC公司。

2、取0.1mL步骤1的几丁寡糖底物溶液，加5μg实施例1的步骤五制备的NAG565 蛋白，即为初始体系(初始体系中含有0μg/mL的还原糖)；将初始体系37℃酶解6h， 得到终止体系；以0.1mLpH7.0、10mM的磷酸缓冲液作为几丁寡糖底物溶液的阴性对照。

3、根据DNS法测定产物中的还原糖含量(采用葡萄糖作为标准品制作标准曲线，标 准曲线方程如下：Y＝2521.1*ΔOD+20.41；Y代表与初始体系相比终止体系中还原糖的增 加量，单位为μg/mL，ΔOD为终止体系的OD值减去初始体系的OD值)，以此表征NAG565 蛋白作为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶降解几丁寡糖的能力。阴性对照组的还原糖增 加量为0μg/mL，几丁二糖组的还原糖增加量为1505.3μg/mL，几丁三糖组的还原 糖增加量为907.8μg/mL，几丁四糖组的还原糖增加量为796.9μg/mL，几丁五糖组 的还原糖增加量为708.7μg/mL，几丁六糖组的还原糖增加量为403.6μg/mL。可以 确定NAG565蛋白对几丁寡糖具有一定的降解作用。

二、NAG565蛋白对其它底物的识别

方法同步骤一，差异仅在于用如下底物代替几丁寡糖：

4-Methylumbelliferyl-N-Acetyl-α-D-Glucosaminide(Sigma)、

4-Methylumbelliferyl-α-D-Glucoside(Sigma)、

4-Methylumbelliferyl-α-D-Galactoside(Sigma)、

4-Methylumbelliferyl-α-D-Xyloside(Sigma)、

4-Methylumbel-Liferyl-α-D-Cellobiopyranoside(Sigma)、

Glycol-chi tosan(Sigma)、

羧甲基纤维素；

壳聚糖粉末。

NAG565蛋白对上述底物均没有降解能力。

结果表明，NAG565蛋白对β-N-乙酰氨基葡萄糖苷键具有专一性。

实施例5、NAG565蛋白对相关化学试剂的抗性

检测实施例1的步骤五得到的NAG565蛋白对不同金属离子或化学试剂的抗性。 酶活检测方法参见实施例1的步骤四，差别仅在于在反应体系中加入不同的金属离子或化 学试剂(K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Li⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Hg²⁺、 EDTA、SDS或β-巯基乙醇；终浓度均为5mM)，以未加金属离子和化学试剂的反应体系作 为对照。酶活测定中采用pH7.0、0.1M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

结果见表3。Na⁺、Mn²⁺对NAG565蛋白的酶活有促进作用。Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺等对NAG565 蛋白的酶活有不同程度的抑制作用，Ag⁺和Hg²⁺几乎完全抑制NAG565蛋白的酶活，而K⁺、Ca²⁺、 Mg²⁺等对NAG565蛋白的酶活的影响很小，可以忽略不计。NAG565蛋白对阴性表面活性剂 -SDS具有一定的抵抗能力。

表3金属离子及相关化学试剂对NAG565蛋白的影响

  化学试剂   剩余酶活(％)   金属离子或化学试剂   剩余酶活(％)   Na⁺  108.52   Mn²⁺  108.51

  K⁺  95.20   Zn²⁺  82.65   Ca²⁺  97.66   Pb²⁺  83.83   Li⁺  67.71   Fe³⁺  86.00   Co²⁺  43.40   Ag⁺  18.33   Cr³⁺  64.19   Hg²⁺  0   Ni⁺  86.91   SDS   64.71   Cu²⁺  77.79   beta-Met   74.01   Mg²⁺  91.94   EDTA   89.11

实施例6、NAG565蛋白对蛋白酶的抗性

将蛋白酶分别用下列溶液配制成1mg/mL的溶液：用pH2.0的0.1M甘氨酸-HCl将胃蛋 白酶配成1mg/mL的溶液；用pH7.0的0.1M Tris-HCl分别将胰蛋白酶和α-糜蛋白酶配 成1mg/mL的溶液；用pH7.5的0.1M Tris-HCl将蛋白酶K和胶原蛋白酶分别配成1mg/mL 的溶液。将实施例1的步骤五得到的NAG565蛋白与蛋白酶按10∶1(质量比)在该蛋白酶溶 液中处理30min或60min后，按标准方法检测处理酶的剩余酶活(参见实施例1的步骤四)。 以未加蛋白酶的反应体系作为对照(CK)。

结果见图6。用不同蛋白酶处理60min后，NAG565蛋白的剩余酶活分别为68.9％(胃蛋 白酶)，76.9％(胰蛋白酶)，89.1％(α-糜蛋白酶)，84.9％(蛋白酶K)，78.9％(胶原 蛋白酶)，由此可以看出NAG565蛋白对多种蛋白酶都具有较强的抗性。