抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用

摘要

本发明公开了一种保藏号为CCTCC C201220的杂交瘤细胞株及其分泌的抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体。本发明还公开了检测鸭坦布苏病毒抗体的试剂盒和方法，以及上述单克隆抗体在制备诊断鸭坦布苏病毒病的产品中的应用。本发明利用抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体制备的检测鸭坦布苏病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，不仅特异性良好，而且敏感性明显高于琼脂扩散实验和病毒中和试验，可用于鸭坦布苏病毒抗体快速定性和定量，在鸭坦布苏病毒病的诊断及抗体检测方面具有非常好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株、以及应用该单克隆抗体检测鸭坦布苏病毒抗体的阻断ELISA试剂盒。 

背景技术

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是一种可引起鸭产蛋下降、生长迟缓和死亡的黄病毒。2010年春季以来，上海市、江苏省、浙江省、安徽省等地相继爆发一种导致蛋鸭减产、肉鸭生长迟缓和死亡的一种新发病，研究证明引起该病的病原为坦布苏病毒(Tembusu virus)。该病毒对蛋鸭和肉鸭均有致病力，病鸭主要表现为高热、运动障碍、食欲下降甚至废绝、产蛋下降甚至停止，严重可导致死亡，死亡率可达5％-10％。据报道鸭坦布苏病毒病造成的经济损失已超过50亿元。 

目前，针对鸭坦布苏病毒的分子诊断方法已经建立，但尚没有可靠的抗体检测方法。 

发明内容

本发明要解决目前没有可靠的针对鸭坦布苏病毒的抗体检测方法的技术问题，提供一种抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体可用于快速、灵敏地检测鸭坦布苏病毒。 

此外，还需要提供一种应用上述单克隆抗体检测鸭坦布苏病毒抗体的试剂盒和方法。 

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现： 

在本发明的一个方面，提供了一种分泌抗鸭坦布苏病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株为抗鸭坦布苏病毒E蛋白小鼠杂交瘤细胞株1F5，已于2012年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201220。 

在本发明的另一方面，还提供了一种由上述保藏号为CCTCC NO：C201220的杂交瘤细胞株分泌的抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体。 

在本发明的另一方面，还提供了一种检测鸭坦布苏病毒抗体的试剂盒，该试剂盒包含上述抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体。 

优选的，本发明试剂盒还包含ELISA酶标板、鸭坦布苏病毒抗原、抗原包被液、封闭液、抗体稀释液、酶标二抗、显色液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清、PBS-T洗涤液(10×)和试剂盒说明书。其中阳性对照血清为抗鸭坦布苏病毒的SPF鸭血清，阴性对照血清为正常的SPF鸭血清；酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗。 

在本发明的另一方面，还提供了一种检测鸭坦布苏病毒抗体的试剂盒，主要包括以下步骤： 

用纯化的鸭坦布苏病毒抗原包被ELISA酶标板； 

将待测血清与包被抗原作用后，依次加入上述抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体、酶标二抗和显色液； 

利用酶标仪读取吸光度值OD_450nm，并按公式：抑制率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％，计算待测血清的抑制率，得检测结果。 

所述检测结果的判定标准为：抑制率≥18％为阳性，13％＜抑制率＜18％为可疑，抑制率≤13％为阴性。 

优选的，所述抗原的最佳包被浓度为3μg/孔；所述待测血清的最佳稀释倍数为1∶10；所述单克隆抗体的最佳稀释倍数为1∶20；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗，其最佳稀释倍数为1∶5000。 

本发明利用抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体制备的检测鸭坦布苏病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，具有良好的特异性，而且敏感性明显高于琼脂扩散实验和病毒中和试验，可以对鸭坦布苏病毒抗体进行快速定性和定量，在鸭坦布苏病毒病的诊断及抗体检测方面具有很好的应用前景。 

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 

图1是本发明实施例1的1F5单抗与DTMUV感染DEF细胞发生特异性反应的免疫荧光图； 

图2是本发明实施例1的1F5单抗与PCAGGs-DTMUV-E转染293T细胞特异结合的免疫荧光图。 

本发明的抗鸭坦布苏病毒E蛋白小鼠杂交瘤细胞株1F5，已于2012年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C201220。 

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。 

为了建立针对鸭坦布苏病毒的抗体检测方法，本发明首先采用鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠，利用单克隆抗体制备技术，筛选获得了1株稳定分泌抗DTMUV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分泌的单克隆抗体可与DTMUV的E蛋白特异性结合，而且具有中和DTMUV活性，将该单克隆抗体命名为1F5。然后用纯化的DTMUV病毒包被ELISA板，将待测血清与包被抗原作用后，依次加入1F5单抗、酶标抗鼠二抗和显色液，利用酶标仪读取吸光度值OD_450nm，通过计算待测血清的抑制率，建立了检测DTMUV抗体的 阻断ELISA(Blockinge ELISA，B-ELISA)方法。进一步条件优化表明抗原的最佳包被浓度为3μg/孔，待测血清最佳稀释倍数为1∶10，单抗1F5最佳稀释倍数为1∶20，酶标抗鼠二抗最佳稀释倍数为1∶5000。本发明检测DTMUV抗体的B-ELISA方法，以其更高的敏感性和特异性在鸭坦布苏病毒病的诊断中表现出很好的应用前景。 

实施例1鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备及鉴定 

1.材料和方法 

1.1病毒、细胞与试验动物 

鸭坦布苏病毒(DTMUV)奉贤株(FX2010株)由本实验室分离并保存；鸭胚成纤维细胞(DEF细胞)和SP2/0细胞为本实验室提供；清洁级BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。PCAGGS-DTMUV-E重组真核表达质粒为本实验室构建并保存。 

1.2主要材料和试验用血清 

DMEM购自GBICO公司；8-氮鸟嘌呤、PEG1450、HAT、HT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和HRP标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司。DTMUV阳性和阴性血清、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、网状内皮增生病病毒(REV)、I型鸭肝炎病毒(DHV-1)、呼肠孤病毒(RV)和禽白血病病毒(ALV)阳性血清均为本实验室保存。 

1.3抗原的制备 

将种毒FX2010以10^4.5TCID50的剂量感染DEF细胞，72h收集出现70％以上CPE的细胞，并冻融3次后，3‰甲醛灭活24h，高速离心7500rpm 2h取上清，上清经超速离心30000rpm 5留沉淀，即得到纯化DTMUV，测定蛋白浓度，分装于-70℃保存，用作免疫抗原和包被抗原。 

1.4DTMUV单克隆抗体的制备及其鉴定 

1.4.1小鼠免疫 

用纯化的DTMUV抗原加入等量弗氏完全佐剂乳化后，经腹部和背部皮下注射6-8周龄雌性BAB/c小鼠，每只100μg；用纯化的DTMUV抗原加入等量弗氏不完全佐剂乳化后，每隔两周分别进行第二次和第三次免疫，剂量与首免相同；三免两周后进行加强免疫，三天后开始细胞融合。 

1.4.2阳性杂交瘤细胞株的建立 

按常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按10∶1的比例在融合剂PEG1450作用下融合，经间接ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，按有限稀释法进行克隆。 

结果：利用淋巴细胞杂交瘤技术，通过间接ELISA检测方法检测杂交瘤细胞上清，获得 了能够稳定分泌抗DTMUV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将该细胞株命名为1F5，该抗鸭坦布苏病毒E蛋白小鼠杂交瘤细胞株1F5已于2012年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC N0：C201220。 

1.4.3单克隆抗体腹水的制备 

将0.5mL灭菌的石蜡油注射小鼠腹腔，一周后再注入10⁶个杂交瘤细胞，7-10天后，小鼠腹部的腹水极度膨胀时抽取腹水，分装备用。 

1.4.4单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(IFA) 

制备鸭胚成纤维细胞(DEF细胞)，并培养于6孔培养板，待细胞长成单层后，用坦布苏病毒感染DEF细胞，同时设阴性对照孔。感染24h后，弃上清，细胞用4％的多聚甲醛固定，经PBST洗涤三次，加入杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗体，继续37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，最后在荧光下显微镜下观察，凡有绿色荧光者判为阳性；无荧光者判为阴性。 

结果：用DTMUV感染DEF细胞，并用1F5单抗进行间接免疫荧光试验，设未感染DEF细胞为空白对照(MOCK)。试验结果显示：1F5单抗可产生特异性的绿色荧光(见图1)，表明1F5单抗可以与DTMUV某些蛋白发生特异性结合。图1中，(A)：MAb 1F5；(B)：MOCK-1F5。 

1.4.5抗DTMUV E蛋白单克隆抗体的鉴定 

将293培养于6孔培养板，待细胞长成单层后，将重组真核表达质粒pCAGGS-DTMUV-E转染293细胞，同时设阴性对照孔。转染24h后，弃上清，细胞用4％的多聚甲醛固定，经PBST洗涤一次，加入杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗体，继续37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，最后在荧光显微镜下观察，凡有特异的绿色荧光者判为阳性；无荧光者判为阴性。 

结果：经PCAGGS-DTMUV-E真核质粒转染的293T细胞的IFA检测，对照转染空pCAGGS质粒的293T细胞没有特异的荧光，1F5出现特异的绿色荧光(见图2)，进而确认1F5单抗为抗DTMUV E蛋白的单抗。图2中，(A)：PCAGGS-DTMUV-E转染的293T细胞；(B)：pCAGGS转染的293T细胞。 

1.4.6单抗中和活性的测定 

用固定病毒稀释抗体的方法进行病毒中和试验，检测单抗的中和活性。将杂交瘤细胞培养上清液和腹水56℃灭活30min后做2倍比系列稀释，分别与含有100ELD₅₀的DTMUV(FXV2010株)等体积混合，置37℃感作1h接种7日龄SPF鸡胚；同时设DTMUV阳性血清、SP2/0细胞培养上清作为阳性和阴性对照。能够抑制50％病毒增殖的抗体最高稀释倍数定为抗体中和效价。 

中和试验结果表明，1F5单抗具有中和DTMUV的活性。1F5单抗细胞培养上清的中和抗体效 价达1∶64，腹水中和抗体效价达1∶512。 

实施例2检测DTMUV抗体阻断ELISA(Blockinge ELISA，B-ELISA)方法的建立 

1.阴性血清的制备 

取6周龄SPF鸭，心脏采血，分离血清，并分装于0.2mLEp管中，-20℃保存备用。 

2.阳性血清的制备 

取6周龄SPF鸭，用10^3.5ELD₅₀的鸭坦布苏病毒FX2010分离株经鼻腔感染。3周后待心脏采血，分离血清并分装0.2mLEp管中，-20℃备用。 

3.坦布苏病毒抗体阻断ELISA操作方法 

将纯化的鸭坦布苏病毒用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释成0.03mg/mL，包被96孔酶标反应板，每孔100μL，4℃包被过夜，用含5％脱脂奶粉的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶液37℃封闭1h，然后用含0.5mL/L的吐温20的PBS(PBST)洗涤3次；将用PBS稀释的坦布苏病毒阳性和阴性血清分别加入经过封闭的酶标反应板，用封口膜封闭，37℃感作1h，再用PBST洗3次；将1F5单抗1∶20稀释，每孔加入100μL，37℃感作1h；加入5000倍稀释的HRP-抗鼠IgG100μL；加入100μL的TMB显色液，避光显色10min，最后加入50μL终止液(2mol/L的H2SO4)终止反应，测定OD450nm值。 

4.临界值的确定 

对350份鸭的阴性血清进行B-ELISA检测，对所得的检测结果进行统计学分析，计算阴性样本的平均抑制率和标准偏差(SD)。根据公式：临界值＝阴性样本的平均抑制率+3×标准偏差(SD)，分别计算其临界值。 

结果：利用B-ELISA方法共检测350份阴性鸭血清的平均抑制率为0.95％，标准偏差为5.79％。根据公式：临界值＝阴性样本的平均抑制率+3×标准偏差，临界值为18％，即当抑制率≥18％时，该血清样品为坦布苏病毒抗体阳性；当13％＜抑制率＜18％时，该血清为可疑；抑制率≤13％的样品为坦布苏病毒抗体阴性。 

5.特异性试验 

用建立的B-ELISA分别检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、网状内皮增生病病毒(REV)、I型鸭肝炎病毒(DHV-1)、呼肠孤病毒(RV)和禽白血病病毒(ALV)阳性血清，验证本发明试剂盒对其它病毒的阳性血清的交叉反应性。 

结果显示：B-ELISA检测后，只有鸭坦布苏病毒(DTMUV)阳性血清呈阳性，抑制率为69.13％，大于18％；其它病毒阳性血清均为阴性(见表1)，说明本发明方法和试剂盒特异性良好。 

表1B-ELISA特异性试验 

6.敏感性试验 

对已知的DTMUV阳性血清分别用建立的B-ELISA方法与琼脂扩散试验(AGP)、血清中和试验(SNT)进行检测，以比较三者的敏感性差异。 

结果显示：本发明方法显著高于AGP和SNT方法(见表2)。 

表2B-ELISA与AGP、SNT方法的敏感性比较 

注：+表示该血清呈坦布苏病毒抗体阳性，±表示该血清呈坦布苏病毒抗体可疑，表示该血清呈坦布苏病毒抗体阴性。 

7.重复性试验 

(1)批内重复试验：用同一批次包被的酶标板检测不同的样本，一份阳性样本，一份阴性样本，每份样本重复6孔，进行B-ELISA检测，计算出同一样本抑制率的变异系数，以检验批内检测样品的重复性； 

(2)批间重复性试验：用不同批次包被的酶标板6块重复检测1份阳性样本和1份阴性样本，进行B-ELISA检测，计算同一份样本抑制率得变异系数，以检验批间检测样本的重复性。 

结果：对同一批次和不同批次的B-ELISA进行批内和批间重复试验，其抑制率经统计学分析，变异系数均小于10％，说明本发明试剂盒重复性良好(见表3和表4)。 

表3批内重复性试验 

表4批间重复性试验 

实施例3检测鸭坦布苏病毒抗体阻断ELISA(B-ELISA)试剂盒的组成和应用 

1、试剂盒的组成 

按表5所列的试剂盒内容，装配成试剂盒，组装后置于相应条件保存。 

表5鸭坦布苏病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒内容 

  编号   内容   数量   备注   1   待包被可拆卸酶标板   1块   8×12规格，4℃保存   2   包被抗原   一管   100μL/管，-20℃保存   3   包被缓冲液(1×)   一瓶   10mL/瓶，4℃保存   4   封闭液   一瓶   20mL/瓶，4℃保存   5   阳性对照血清   1管   50μL/管，-20℃保存   6   阴性对照血清   1管   50μL/管，-20℃保存   7   单克隆抗体   1管   100μL/管，-20℃保存   8   HRP-抗鼠IgG(5000×)   1管   5微升/管，-20℃保存   9   抗体稀释液(1×)   1瓶   10mL/管，4℃保存   10   TMB显色液   1瓶   10mL/瓶，4℃保存   11   终止液   1瓶   10mL/瓶，4℃保存   12   PBS-T洗涤液(10×)   1瓶   50mL/瓶，4℃保存   13   试剂盒说明书   1份  

2、本发明试剂盒的使用方法： 

1)使用步骤 

A包被：于检测前一天用包被抗原包被待包被可拆卸酶标板，即将上述试剂的包被抗原置于包被液中混匀，每孔100微升，4℃过夜，次日取出后，用1×PBS-T洗涤液三次，每次3min； 

B封闭：封闭液200微升/孔，37℃1h，1×洗涤液洗涤3次，每次3min； 

C将待测血清、阴性及阳性对照血清用抗体稀释液稀释10倍备用，每孔100微升加入酶标板中，37℃孵育1小时。1×洗涤液洗涤3次，每次3min，方法同上； 

D将单克隆抗体用抗体稀释液稀释20×，每孔100μL单抗，37℃孵育1h，洗涤3次； 

E每孔加入用抗体稀释液稀释到1×的HRP-抗鼠IgG 100μL，37℃1h，洗涤3次； 

F每孔加入TMB底物显色液100μL，室温避光显色10min； 

G每孔加入终止液50uL，酶标仪读取吸光度值OD_450nm，计算抑制率，抑制率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％。 

2)检测结果的判定及分析 

当阳性血清的抑制率大于50％，表明实验结果可信，根据以下标准判定： 

当血清样本的抑制率值大于等于18％时，该样本判定为鸭坦布苏抗体阳性； 

当血清样本的抑制率值小于等于13％时，该样本判定为鸭坦布苏抗体阴性； 

当血清样本的抑制率值介于二者之间时，判定可疑，重新检测可疑判为阴性。 

3、本发明试剂盒的应用 

用建立的B-ELISA方法测定来自不同鸭场现地血清130份，结果显示，130份鸭血清样品中，阳性样品32份，阴性样品98份，阳性率24.62％。 

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。