高产木质纤维素降解酶菌株的复筛方法

摘要

本发明公开了高产木质纤维素降解酶菌株的复筛方法，该复筛方法包括以下步骤：（1）基层培养基的制备；（2）在基层培养基上方的表层培养基的制备；（3）接种：将被筛选的菌株接种在步骤（2）的试管里的表层培养基的表面上，置于培养箱中培养；（4）筛选：以培养试管中形成的透明层长短作为判定高产的菌株的标准，挑选那些生长旺盛，形成或不形成孢子，在黑色或其他背景下观察透明层相对较长的作为相对高产菌株。本发明的复筛方法比传统的筛选方法简便易行，并且具有更强的工业化针对性，能更有效的筛选出适应于工业化培养基的高产菌株。

说明书

技术领域

本发明涉及菌株的筛选方法，具体涉及一种高产木质纤维素降解酶菌株的复筛方法。

背景技术

木质纤维素是世界上储量大并具备可再生能力的天然环保型资源，每年全世界木质纤维素的产量每年约有750亿吨。在环境污染和化石能源日渐枯竭的现代社会，利用木质纤维素资源替代化石能源成为目前亟待解决的问题。木质纤维素的降解是木质纤维素资源利用的最大困难。世界各国已投入巨大的人力财力进行木质纤维素降解的研究，通过微生物筛选，诱变，酶的纯化，基因克隆及表达，宏基因组学，宏蛋白质组学等方法，从理论研究到实际应用希望能找出解决木质纤维素降解这一难题的突破口。

为了有效的利用这样大量廉价环保的资源，我们首先要了解天然的木质纤维素的组成和结构。除棉花外，绝大多数天然的木质纤维素的实质就是大量的植物纤维细胞壁的集合，主要是由纤维素（cellulose），半纤维素(hemicellulose)，木质素(lignin)三类物质组成的，这三类物质在天然木质纤维素中的含量为纤维素40%-50%，半纤维素20-35%,木质素20%-30%。其中以纤维素为骨架物质，半纤维素和木质素为包裹组分和包埋组分，它们之间通过共价键和化学键紧密连结在一起。

天然木质纤维素的组成复杂，因此微生物降解天然木质纤维素也是分泌一系列针对不同组分的酶协同作用，共同降解木质纤维素，这些酶主要分为纤维素降解酶，半纤维素降解酶和木质素降解酶类。纤维素酶是一类能够作用于纤维素最终生成葡萄糖的酶的总称，一般纤维素酶有十几个到几十个组分，这些组分可分为三大类：葡聚糖内切酶(endo-glucanases,EG )，葡聚糖外切酶或纤维二糖水解酶(exo-glucanases or cellobiohydralases, CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)。半纤维素中最具代表性的一种就是木聚糖，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，因此对于木聚糖酶系的组成研究的比较清楚。木聚糖酶系包括：β-内切木聚糖酶（endo-beta-xylanase），β-木糖苷酶（beta-xylosidase），α-葡萄糖醛酸酶（alpha-glucuronidase），乙酰木聚糖酯酶（Acetylxylan esterase），阿魏酸酯酶（feruloyl esterase），α-阿拉伯呋喃糖酶（alpha-N-arabinofuranosidase），葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶（glucan 1,4-alpha-glucosidase）。木质素降解酶类主要有三种：木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，简称Lip）、锰过氧化物酶（Mn-dependent peroxidase，简称MnP）和漆酶，此外还有HRP、CDH 等酶类。自然界中能够降解木质纤维素的菌种类很多，目前已经分离筛选出的能够产生木质纤维素降解酶的细菌有梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、杆菌属(Bacillus)、拟杆菌(Bacteroides)、高温单胞菌属(Thermomonospora)、欧文氏菌属(Erwinia)、醋弧菌属(Acetovibrio)等。真菌主要有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、白腐真菌(P chrysosporium)、白绢菌(Sclerotium rolfsii)以及裂殖菌属(Schizophyllum)等。放线菌主要有链霉属、高温放线菌属(Thermoactinomyces)等。对这些微生物进行传统的育种改造，能够有效提高酶活，改善酶的特性，用于工业生产。

微生物降解纤维素的酶类基本都属于诱导型酶，根据目前的研究，不同的诱导物诱导产生的木质纤维素降解酶系种类及比例是不同的。目前的报道中，用可溶性的山梨糖（Sorbose），乳糖（Lactose）和槐糖（Sophorose），以及一些不溶性碳源如纯的微晶纤维素、木聚糖、预处理的木质纤维素、牛粪、玉米纤维，诱导促使微生物产酶，但在工业生产中，这些原料价格昂贵，并不经济实用，因此只有使用工业原料的诱导物来诱导产酶，才能在生产中更具有针对性。

一般筛选是通过微生物在以纤维素作为碳源的平板培养基形成的透明圈大小来判定其纤维素酶活或该微生物对纤维素的降解能力，该方法需要预先将色素与纤维素结合，或在微生物培养后进行染色脱色步骤，如果是在微生物培养后进行染色还需要将菌种备份，这样操作步骤非常繁琐。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种高产木质纤维素降解酶菌株的复筛方法，针对传统纤维素酶菌株筛选培养基在对工业化筛选中针对性不足等弊端， 采用粉碎后预处理后的木质纤维素和粉碎处理的滤纸作为主要的碳源和诱导因子前体进行筛选， 同时在结合真菌纤维素酶分泌和水解的特点的基础上，通过对高产纤维素酶微生物的生长形态以及对滤纸的利用情况进行评判，筛选出高产的纤维素酶菌株。

本发明的技术解决方案是该复筛方法包括以下步骤：

（1）制备基层培养基：依金属离子溶液的质量计，将含有其质量的0.1-5%的粉碎后的滤纸、0.5-3%琼脂、0.1- 1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05-0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.01-0.2%玉米浆置于容器中，在121℃-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90℃时，加入金属离子溶液，得基层培养基液；然后将基层培养基液用移液枪分装至灭过菌的试管内20-60mm，置于冷水中快速凝固，滤纸不发生沉降，表面无气泡，凝固后备用；

（2）制备表层培养基：依金属离子溶液的质量计，将含有其质量的0.1-5%的粉碎后干的50目以上的预处理木质纤维素、0-3%琼脂、0.1- 1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05-0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.01-0.2%玉米浆置于容器中，在121℃-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90℃时，加入金属离子溶液，得表层培养基液；然后将表层培养基液用移液枪加入步骤（1）的凝固的基层培养基的表面0.1-20mm高度，待凝固；

（3）接种：将被筛选的菌株接种在步骤（2）的试管里的表层培养基的表面上，置于培养箱中，30℃培养3-20天，定期观察记录生长状况及培养基的降解状况；

（4）筛选：以培养试管中形成的透明层长短作为判定高产的菌株的标准，挑选那些生长旺盛，形成或不形成孢子，在黑色或其他背景下观察透明层相对较长的作为相对高产菌株。

其中，金属离子液的制备方法如下：首先，制备高浓度金属离子液，高浓度金属离子液的浓度为金属离子液浓度的10-200倍，其中含硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰和氯化钴；其次，稀释高浓度金属离子液得金属离子液，并用质量浓度36%的HCl将金属离子液的pH调至1-3，金属离子液的添加量确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.05-1g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1-20mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.1-5mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 0.1-10mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 0.1-20mg/L。

其中，预处理的木质纤维素的处理方法是如下一种或者几种方法的组合：一是利用蒸汽或者超临界过热水在含有质量百分比0-2%的稀酸环境下进行蒸煮1-30分钟，酸是指盐酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、磷酸、碳酸中的一种或其组合；二是使用质量浓度0.2- 20%的碱液在温度60-160℃蒸煮1-600分钟，碱是指氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、氨水、生石灰、氢氧化钙中的一种或其组合。

其中，木质纤维素为农作物秸秆、草类、林木生物质中的一项或几项的组合；所述的农作物秸秆为稻草、麦草、棉花秆、油菜秆、玉米秆、玉米芯、大豆秆茎、花生秆茎、葵花秆、甘蔗渣中的一种或几种的组合；所述的草类为芒草、柳枝稷、芦苇中的一种或几种的组合；所述的林木生物质为软木、硬木、锯木屑中的一种或几种的组合。

其中，所述的粉碎处理的滤纸指各种不同品牌的定性滤纸、定量滤纸、定性层析滤纸、定量层析滤纸、滤速快、中、慢以及各种不同直径滤纸。

本发明的筛选方法是基于微生物产酶的特点：菌株产纤维素酶是在整体生长后期分泌出来的，分泌出来的纤维素酶能够在培养基中渗透，作用于预处理后的木质纤维素及滤纸，将其降解为葡萄糖等较小分子，菌体利用葡萄糖生长，分泌出的酶继续向下渗透，进一步降解更深层的培养基，形成较长的透明段；对于酶分泌能力差的菌株，由于无法分泌纤维素酶或者分泌纤维素酶较少，对于培养基中的纤维素降解能力差，无法更加深入的降解更深层的培养基，形成的透明段就相对较短。

本发明具有以下优点：1、提供了一种廉价、高效的对高产纤维素酶菌株进行复筛的固体培养基和筛选评判标准，这种复筛方法比传统的筛选方法简便易行，并且具有更强的工业化针对性，能更有效的筛选出适应于工业化培养基的高产菌株；2、在实验室及工厂产品的纤维素酶活评价系统中，以及对高产纤维素酶菌株筛选过程中，滤纸酶活是公认的具有权威性的对于纤维素酶系统的综合评价指标，因此使用滤纸作为复筛培养基的主要碳源，能够更加有针对性的筛选出纤维素酶高产菌株；3、将粉碎后预处理的天然木质纤维素及滤纸相结合是一种更能真实反映菌株在工业化培养基里面的酶分泌情况，并且基于整体酶活的筛选鉴别方法，该方法具有针对性更强，效率更高等特点；4、本发明的方法操作简便，易于观察记录，同时能够能获得纯的种系进行短期保藏。

具体实施方式

    下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术解决方案的限制。

实施例中的木质纤维素是采用稻草，湿度为20%左右，平均长度为2厘米左右；预处理条件是直接将2公斤稻草置于在50升的预处理压力容器中，在200摄氏度的湿热蒸汽下预处理10分钟；预处理后的秸秆烘干后进行粉碎，在通过200目的筛子获得粉碎后的预处理后的木质纤维素。

实施例中的滤纸采用18mm直径、双圈牌定性滤纸，用剪刀剪碎，在粉碎机中粉碎3次，每次2min，粉碎机功功率为1500W，转速为25000rpm，频率50-60Hz。

实施例中的菌种是采用里氏木霉的变体，通过紫外（UV）光照射和亚硝基胍(NTG)进行变异。

实施例1：依发下步骤复筛木质纤维素降解酶菌株

 （1）基层培养基：依金属离子溶液的质量计，将含有其质量的0.1%的粉碎后的滤纸、0.5%琼脂、0.1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05%磷酸二氢钾KH2PO4、0.01%玉米浆置于容器中，在121℃消毒灭菌30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60℃时，加入金属离子溶液，得基层培养基液；然后将基层培养基液用移液枪分装至灭过菌的试管内20mm，置于冷水中快速凝固，滤纸不发生沉降，表面无气泡，凝固后备用；其中，金属离子液的制备方法如下：首先，制备高浓度金属离子液，高浓度金属离子液的浓度为金属离子液浓度的10倍，其中含硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰和氯化钴；其次，稀释高浓度金属离子液得金属离子液，并用质量浓度36%的HCl将金属离子液的pH调至1，金属离子液的添加量确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.05g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.1mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 0.1mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 0.1mg/L；

（2）表层培养基：依金属离子溶液的质量计，将含有其质量的0.1%的粉碎后干的50目以上的预处理木质纤维素、0.1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05%磷酸二氢钾KH2PO4、0.01%玉米浆置于容器中，在121℃℃消毒灭菌30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60℃时，加入金属离子溶液，得表层培养基液；然后将表层培养基液用移液枪加入步骤（1）的凝固的基层培养基的表面0.1mm高度，待凝固；其中，金属离子液的制备方法如下：首先，制备高浓度金属离子液，高浓度金属离子液的浓度为金属离子液浓度的200倍，其中含硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰和氯化钴；其次，稀释高浓度金属离子液得金属离子液，并用质量浓度36%的HCl将金属离子液的pH调至1，金属离子液的添加量确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 1g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 20mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 5mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 10mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 20mg/L；

（3）接种：将被筛选的诱变菌种的孢子悬液20μl接种在步骤（2）的试管里的表层培养基的表面上，置于培养箱中，30℃培养3-20天，定期观察记录生长状况及培养基的降解状况；

（4）筛选：7天时菌已产生孢子，培养基表层呈绿色，表面均匀细腻，孢子量大，形成透明段5 mm，10天时形成透明段7mm，该菌种发酵滤纸酶活可达0.48U/ml。

实施例2：依发下步骤复筛木质纤维素降解酶菌株

 （1）基层培养基：依金属离子溶液的质量计，将含有其质量的2.55%的粉碎后的滤纸、1.75%琼脂、0.55%硫酸铵(NH4)2SO4、0.275%磷酸二氢钾KH2PO4、0.105%玉米浆置于容器中，在125℃消毒灭菌25分钟后取出摇匀，待温度冷却到75℃时，加入金属离子溶液，得基层培养基液；然后将基层培养基液用移液枪分装至灭过菌的试管内40mm，置于冷水中快速凝固，滤纸不发生沉降，表面无气泡，凝固后备用；其中，金属离子液的制备方法如下：首先，制备高浓度金属离子液，高浓度金属离子液的浓度为金属离子液浓度的105倍，其中含硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰和氯化钴；其次，稀释高浓度金属离子液得金属离子液，并用质量浓度36%的HCl将金属离子液的pH调至2，金属离子液的添加量确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.525g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 10.05mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 2.55mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 5.05mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 10.05mg/L；

（2）表层培养基：依金属离子溶液的质量计，将含有其质量的2.55%的粉碎后干的50目以上的预处理木质纤维素、1.5%琼脂、0.55%硫酸铵(NH4)2SO4、0.275%磷酸二氢钾KH2PO4、0.105%玉米浆置于容器中，在125℃消毒灭菌25分钟后取出摇匀，待温度冷却到75℃时，加入金属离子溶液，得表层培养基液；然后将表层培养基液用移液枪加入步骤（1）的凝固的基层培养基的表面10mm高度，待凝固；其中，金属离子液的制备方法如下：首先，制备高浓度金属离子液，高浓度金属离子液的浓度为金属离子液浓度的105倍，其中含硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰和氯化钴；其次，稀释高浓度金属离子液得金属离子液，并用质量浓度36%的HCl将金属离子液的pH调至2，金属离子液的添加量确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.525g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 10.05mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 2.55mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 5.05mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 10.05mg/L；

（3）接种：将被筛选的诱变菌种的孢子悬液20μl接种在步骤（2）的试管里的表层培养基的表面上，置于培养箱中，30℃培养3-20天，定期观察记录生长状况及培养基的降解状况；

（4）筛选： 7天时菌已产生孢子，培养基表层呈绿色，表面均匀细腻，孢子量大，形成透明段6 mm，10天时形成透明段8mm，该菌种发酵滤纸酶活可达0.55U/ml。

实施例3：依发下步骤复筛木质纤维素降解酶菌株

 （1）基层培养基：依金属离子溶液的质量计，将含有其质量的5%的粉碎后的滤纸、3%琼脂、1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.2%玉米浆置于容器中，在128℃消毒灭菌20分钟后取出摇匀，待温度冷却到90℃时，加入金属离子溶液，得基层培养基液；然后将基层培养基液用移液枪分装至灭过菌的试管内60mm，置于冷水中快速凝固，滤纸不发生沉降，表面无气泡，凝固后备用；其中，金属离子液的制备方法如下：首先，制备高浓度金属离子液，高浓度金属离子液的浓度为金属离子液浓度的200倍，其中含硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰和氯化钴；其次，稀释高浓度金属离子液得金属离子液，并用质量浓度36%的HCl将金属离子液的pH调至3，金属离子液的添加量确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 1g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 20mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 5mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 10mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 20mg/L；

（2）表层培养基：依金属离子溶液的质量计，将含有其质量的5%的粉碎后干的50目以上的预处理木质纤维素、3%琼脂、1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.2%玉米浆置于容器中，在128℃消毒灭菌20分钟后取出摇匀，待温度冷却到90℃时，加入金属离子溶液，得表层培养基液；然后将表层培养基液用移液枪加入步骤（1）的凝固的基层培养基的表面20mm高度，待凝固；其中，金属离子液的制备方法如下：首先，制备高浓度金属离子液，高浓度金属离子液的浓度为金属离子液浓度的200倍，其中含硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰和氯化钴；其次，稀释高浓度金属离子液得金属离子液，并用质量浓度36%的HCl将金属离子液的pH调至3，金属离子液的添加量确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.05g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.1mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 0.1mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 0.1mg/L；

（3）接种：将被筛选的诱变菌种的孢子悬液20μl接种在步骤（2）的试管里的表层培养基的表面上，置于培养箱中，30℃培养3-20天，定期观察记录生长状况及培养基的降解状况；

（4）筛选：7天时菌已产生孢子，培养基表层呈绿色，表面均匀细腻，孢子量大，形成透明段7 mm，10天时形成透明段9mm，该菌种发酵滤纸酶活可达0.63U/ml。