一种提高天然产溶剂梭菌发酵产物中总溶剂转化率的方法

摘要

本发明公开了一种提高天然产溶剂梭菌发酵产物中总溶剂的转化率的方法，通过化学诱变并抑制由丁酰辅酶A到丁酸的代谢途径来实现，具体的，通过对丙酮丁醇梭菌重组菌株进行诱变筛选并敲除丁酸激酶编码基因使该酶失活的方法减少酸的积累，从而有效提高发酵产物中总溶剂的转化率。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种提高天然产溶剂梭菌发酵产物 中总溶剂的转化率的方法。

背景技术

丁醇是具有多种用途的大宗基础原料，在染料、油漆、塑料、树脂、橡胶等化学化工 领域中，可用作多种有机化合物合成的前体；是抗生素及合成药生产过程中所必不可少的 溶媒；同时也是食品、香料工业的食品级抽提剂。更重要的是，丁醇还是一种辛烷值(motor octane number)高于乙醇的优质燃料和燃料添加剂。研究表明，丁醇的蒸汽压和蒸发热分 别为0.63psi和141.3kcal kg^-1，低于乙醇的2.25psi和204.1kcal kg^-1；其高沸点(118℃) 和低蒸汽压有助于汽车的冷启动；由于丁醇的疏水性比乙醇更强，因此更易于与汽、柴油 烃类燃料相混溶；而丁醇的完全燃烧性，可大大降低尾气的CO₂排放，且不发生残留烃污 染，对净化空气十分有利。显然，上述优点有可能使丁醇成为未来发动机新型绿色燃料， 替代矿化燃料的可持续发展的再生能源之一。

丁醇可通过化学法和生物法生产。经微生物厌氧发酵生产丁醇等溶剂的方法可追溯到 上世纪初的第一次世界大战期间。由于丙酮丁醇梭菌在发酵过程中产生三种溶剂丙酮、丁 醇和乙醇(Acetone-Butanol-Ethanol，ABE)，故产溶剂发酵亦称“ABE发酵”。其中，丁醇 和丙酮是主要发酵产物，其代谢网络如图1所示。

由于丙酮丁醇梭菌生产的溶剂除了60-70％为丁醇外，同时还会有20-30％的丙酮 和10％的乙醇这些低值副产物，因此提高丁醇比例以及转化率是提高生物丁醇经济性的 有效手段。第一种思路是通过在本身不产丁醇的宿主菌中构建异源丁醇产生途径，如表1 所示。

表1、正丁醇发酵基因工程菌

由表1可知，前四种基因工程的丁醇代谢工程均是在宿主菌中构建从乙酰辅酶A到丁 醇的异源代谢途径(即乙酰辅酶A→乙酰乙酰辅酶A→β-羟基丁酸辅酶A→巴豆酰辅酶A →丁酰辅酶A→丁醛→丁醇六步生物催化反应)；而最后一种基因工程大肠杆菌通过构建 以L-苏氨酸为起始底物的酮酸途径生产正丁醇。由于本身不产丁醇的菌株，如表1中所列 的宿主菌，对丁醇毒性的耐受能力非常有限，因此利用这些菌生产正丁醇的代谢工程任重 道远。

另一种思路是对天然产丁醇的丙酮丁醇梭菌进行改造，降低副产物丙酮比例以提高丁 醇比例，已报道的方法主要有以下几种：

(1)抑制或中断从乙酰乙酰辅酶A到丙酮代谢途径的辅酶A转移酶(Coenzyme A transferase，CoAT)或乙酰乙酸脱羧酶酶活

Tummala于2003年报道了利用反义RNA技术抑制丙酮丁醇梭菌中的乙酰乙酸脱羧酶 (acetoacetate decarboxylase，AADC)基因adc的转录，但丙酮产量并未减少；接着，Tummala 利用相同的方法抑制该菌中辅酶A转移酶(coenzyme A transferase，CoAT)基因ctfAB的 转录，虽然抑制了丙酮的产生，但由于该法不可避免同时抑制了丁醇和乙醇合成途径关键 酶基因adhE的转录，几乎无乙醇和丁醇的产生(Tummala，S.B.，Welker，N.E.，Papoutsakis， E.T.，Journal of bacteriology 2003 185：1923-1934)；因此在抑制ctfAB的转录基础上过 表达乙醇脱氢酶E(Alcohol dehydrogenase E，ADHE)，但只提高了乙醇的产量，丁醇的产 量只恢复到野生菌水平，丁醇比例反而下降(Tummala，S.B.，Junne，S.G.，Papoutsakis，E. T.，Journal of bacteriology 2003 185：3644-3653)。

可见，抑制辅酶A转移酶活性无法提高丁醇比例；而抑制乙酰乙酸脱羧酶的基因转录 不能彻底阻断丙酮合成。因此，要阻断丙酮的合成，提高丁醇比例，必须彻底抑制乙酰乙 酸脱羧酶活性。这可以通过对该基因进行敲除的手段实现。在丙酮丁醇梭菌进行基因敲除 的方法包括：1)非复制型整合载体的同源重组；2)复制型整合载体的同源重组；3)基 于原核生物二类内含子的Targetron基因敲除技术。第一种使用非复制型载体，已成功敲 除的有buk，pta，aad，及solR基因(Green，E.M.，and Bennett，G.N.Appl Biochem Biotechnol 1996.57-58：213-221；Green，E.M.，Boynton，Z.L.，Harris，L.M.，Rudolph，F.B.，Papoutsakis， E.T.，and Bennett，G.N.Microbiology 1996.142(Pt 8)：2079-2086；Nair，R.V.，Green，E.M.， Watson，D.E.，Bennett，G.N.，and Papoutsakis，E.T.Journal of bacteriology 1999 181： 319-330.)。第二种方法是采用可在丙酮丁醇梭菌中复制的穿梭质粒来构建敲除质粒，因为 具有可复制的起点，该方法增加了同源重组的机会。Harris通过该方法，成功敲除了spo0A (Harris，L.M.，Welker，N.E.，and Papoutsakis，E.T.Journal of bacteriology 2002.184： 3586-3597)。第三种方法是最近发展起来的不依赖于同源重组的新方法。已报道的利用 Targetron技术的敲除载体有pMAL007(Heap，J.T.，et al，J.Microbiol.Methods，2007， 70：452-464)，pSY6(Shao，L.，et al.，Cell Res.，2007，doi：10.1038/cr.2007.91)。

上海生物丁醇协作组蒋宇等通过敲除该菌丙酮合成途径关键酶(乙酰乙酸脱羧酶)的 基因，基本阻断了丙酮的产生，并经代谢流分析与发酵优化将丁醇的比例提高到80％以上 (Jiang et al，Metab Eng，2009.11(4-5)：284-91)。但是乙酸积累增加，溶剂转化率下降。

(2)传统诱变法

根据专利号ZL 95111733.5的中国发明专利，通过传统的分离诱变获得的突变菌株 Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061，其发酵液中丁醇的比例从原来的60％提高到 70％，丁醇∶丙酮∶乙醇为7∶2∶1，以8％玉米糊化液分批发酵时丁醇产量达到约14.5g/L。

综上所述，通过阻断丙酮等副产物的合成可以提高丁醇比例，如何进一步减少酸的积 累并提高溶剂的转化率和产率，对于降低丁醇的生产成本具有重要意义。

发明内容

本发明的目的就在于通过减少产溶剂梭菌酸的积累，提高产溶剂梭菌发酵产物中总溶 剂的转化率的方法。

本发明的提高梭菌发酵产物中总溶剂的转化率的方法，通过化学和基因工程手段构建 天然产溶剂梭菌变体，减少产溶剂梭菌酸的积累来实现，具体地，所述的化学诱变手段是 使用诱变剂亚硝基胍对菌株进行诱变筛选。所述的基因工程手段即指抑制由丁酰辅酶A到 丁酸的代谢途径，通过抑制磷酸丁酰转移酶(phosphotrans butyrylase，ptb)和/或丁酸激酶 (butyrate kinase，buk)的活性来实现。

更具体地，所述抑制丁酸激酶活性通过中断丁酸激酶编码基因(buk基因)来实现。

更具体地，所述中断丁酸激酶编码基因(buk基因)通过Targetron基因敲除技术实现。

根据本发明，所述天然产溶剂梭菌为C.acetobutilicum，C.beijerinckii，C. saccharobutylicum，C.saccharoperbutylacetonicum，C.aurantibutyricum，C.butyricum，C. casaveris，C.pasteurianum，C.pyniceum，C.sporogenes，C.tetanomorphum，C. thermosacharolyticum，或C.felsineum。优选的，所述产溶剂梭菌为Clostridium acetobutylicum ATCC 824。更优选的，所述C.acetobutilicum菌株为Clostridium acetobutylicum CCTCCM 94061。

另一方面，本发明提供了一种Clostridium acetobutylicum的变体，在C.acetobutylicum CCTCC M 94061重组菌株基础上经化学诱变，已于2010年12月17日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010355。

本发明还提供了另一种Clostridium acetobutylicum的变体，在Clostridium acetobutylicum CCTCC M 2010355基础上，基因组中丁酸激酶编码基因(buk基因)被敲 除。

本发明还提供了一种乙酰乙酸脱羧酶编码基因(adc)和丁酸激酶编码基因(buk)敲 除的产溶剂梭菌变体在生产正丁醇的应用。

附图说明

图1是丙酮丁醇梭菌的ABE代谢网络的示意图。

图2是Clostridium acetobutylicum adc中转化质粒pSY7，经过液体培养基传代9天， 涂布平板后的菌落的菌落PCR电泳图，其中，泳道M为DNA Marker，泳道1-14为14 个菌落，泳道+为阳性对照pSY6/7。上图是以Em-N和Em-C为引物扩增的结果，下图是 以引物Cm-N和Cm-C扩增的结果。

图3是将图2中的4，11，13，14号菌落为模板，以adc163-177和adc714-699为引 物扩增结果。+为阳性对照，以Clostridium acetobutylicum adc菌落为模板，-为阴性对照， 以Clostridium acetobutylicum菌落为模板。

图4是buk-targetron片段的PCR扩增产物电泳图，其中，泳道M为DNA Marker； 泳道1为buk-targetron。

图5是Clostridium acetobutylicum adc-M buk敲除转化子菌落PCR扩增产物电泳图， 其中，泳道7是以野生型Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061基因组为模板的扩增 产物的电泳结果，泳道1-6分别为以Clostridium acetobutylicum adc-M转化子1-6号为模板 的扩增产物的电泳结果，泳道M为1kb DNA ladder。

图6是Clostridium acetobutylicum adc-M的1-9号转化子的基因组PCR产物的电泳 图，其中，泳道10为以野生型Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061基因组为模板 的电泳结果；泳道1-9分别为以Clostridium acetobutylicum ATCC 824的1-9号转化子基因 组为模板的电泳结果，泳道M为1kb DNA ladder。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验 室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或生产 厂商推荐的条件进行。

本发明中提及的重组质粒载体pSY6-buk指的是用于敲除buk基因的重组质粒载体。

本发明中提及的buk-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后， 用于敲除buk基因的片段，属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原 核二类内含子，包括ltrA基因。

本发明使用的菌株和质粒分别为：质粒pSY6，序列如SEQ ID NO：1所示，为E.coli 和C.acetobutylicum的穿梭质粒，在C.acetobutylicum中表达红霉素(Ery)抗性基因；质 粒pSY7，序列如SEQ ID NO：2所示，是在pSY6基础上把其红霉素(Ery)抗性基因换 成甲砜霉素(Thia)抗性基因得到，在C.acetobutylicum中表达甲砜霉素(Thia)抗性基 因；质粒pANS，序列如SEQ ID NO：3所示，具有壮观霉素(Spc)抗性；菌株E.coli ER2275 购自NEB公司。

本发明中使用的PCR纯化、DNA胶回收纯化试剂盒和基因组抽提试剂盒均购自爱思 进(Axygen)生物技术有限公司，TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit购自 Sigma-Aldrich。

本发明使用的工具酶：KOD DNA聚合酶，限制性内切酶，Taq聚合酶购自Fermentas， T4连接酶和小牛碱性磷酸酶(CIAP)均购自TaKaRa公司。

本发明中使用的CGM液体培养基的配方均为：2g(NH₄)2SO₄，1g K₂HPO₄，0.5g KH₂PO₄，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.015g FeSO₄·7H₂O，0.01g CaCl₂，0.01g MnSO₄·H₂O， 0.002g CoCl₂，0.002g ZnSO₄，2g Tryptone，1g Yeast Extraction，50g Glucose，溶于1L水 中。CGM固体培养基配方为在相应液体培养基中加入1.5％(w/v)的琼脂粉。

ETM缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO4，4.4mM NaH₂PO₄，10mM MgCl₂。

ET缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄。

P2培养基配方如下：葡萄糖60g；K₂HPO₄ 0.5g；KH₂PO₄ 0.5g；CH₃COONH₄ 2.2g； MgSO₄·7H₂O 0.2g；MnSO₄·H₂O 0.01g；NaCl 0.01g；FeSO₄·7H₂O 0.01g；氨基苯酸(ρ -aminobenzoic acid)1mg；维生素B1(thiamine)1mg；生物素(biotin)0.01mg溶于1L 水中。

本发明中的Clostridium acetobutylicum adc指的是adc基因敲除的C.acetobutylicum CCTCC M 94061重组菌株(专利申请号：200810033954.7)。

本发明中的Clostridium acetobutylicum adc-M指的是在Clostridium acetobutylicum adc 的基础上通过传统诱变筛选得到的变体，已于2010年12月17日保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010355。

本发明中的Clostridium acetobutylicum adc-M-buk指的是在Clostridium acetobutylicum adc-M的基础上buk基因敲除的Clostridium acetobutylicum变体。

根据产溶剂梭菌的丙酮、丁醇、乙醇(ABE)代谢途径，本发明致力于通过抑制副产 物丙酮，乙酸，丁酸的合成或积累，从而提高发酵产物中总溶剂的转化率。为了减少 Clostridium acetobutylicum adc乙酸和丁酸的积累，本发明采用化学诱变的手段，进一步通 过抑制由丁酰辅酶A到丁酸的代谢途径，本发明设法失活该途径中的关键酶丁酸激酶，具 体地是通过中断丁酸激酶编码基因来失活丁酸激酶。更具体地是Targetron基因敲除技术 来中断丁酸激酶编码基因。

本发明通过利用本实验室构建的质粒pSY6/7(Shao L.，Hu S.，Yang Y.，Chen J.，Yang Y， Jiang W，Yang S，Cell research，2007，doi：10.1038/cr.2007.91)，在Clostridium acetobutylicum ATCC 824，Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061中进行基因敲除。

本发明通过PCR，扩增出buk的targetron片断，将其经XhoI及BsrG I双酶切后，与 经同样酶切的pSY6载体连接，得到敲除质粒pSY6-buk，电转Clostridium acetobutylicum ATCC 824或者Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061。由菌落PCR鉴定出内含子插 入的重组菌。经测序确定buk插入了L1.LtrB内含子片段。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。

实施例1、Clostridium acetobutylicum adc中敲除质粒pSY6-adc的丢失

通过向来源于Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061的重组菌Clostridium acetobutylicum adc CCTCC M 2010355中电转质粒pSY7的方法来消除Clostridium acetobutylicum adc中的targetron质粒pSY6-adc。

将pSY7质粒经E.coli ER2275/pANS在Cac8 I位点甲基化后，电转Clostridium acetobutylicum adc，复苏过夜后，取100μl细胞液涂布于34μg/ml Thia的选择性平板，厌 氧箱内于37℃培养48-96小时后，挑单菌，采用菌落PCR验证，然后在CGM(Thia 34mg/ml)培养基中传代。具体步骤如下：

1.1、pSY7质粒的甲基化

将pANS转化E.coli ER2275，获得E.coli ER2275/pANS。

制备E.coli ER2275/pANS的感受态细胞，然后将pSY7质粒转化E.coli ER2275/pANS， 由于pANS质粒具有Spc抗性，故在含有100μg/ml Amp，50μg/mlSpc的LB培养基平板上 过夜培养，然后挑单菌落至4ml加有100μg/ml Amp，50μg/mlSpc的LB培养基中，过夜 培养。然后，将获得的含pANS及pSY7的E.coli ER2275，用质粒抽提试剂盒抽提，从而 获得Cac824 I识别位点已甲基化的质粒pSY7。

1.2、电转pSY7质粒至Clostridium acetobutylicum adc

将Clostridium acetobutylicum adc在CGM平板上划线分离单菌，在厌氧箱内37℃培 养48-96小时，挑Clostridium acetobutylicum adc的单菌落至CGM培养液，37℃培养过夜； 然后，以1％比例转接至100ml CGM培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.7左右，取50ml 菌液，4000rpm，4℃离心10min，弃去上清；再以ETM缓冲液悬浮，4000rpm，4℃离 心10min，弃去上清；然后以1.0ml ET缓冲液悬浮；取100μl悬浮液，加入1-3μg pSY6-buk 质粒，混匀后，加入电转杯中(2mm)，使用MicroPulser^TM电转仪电转，电击条件为电压 2.0kV，其余参考使用手册。电击后，再加入CGM培养基1ml，37℃培养10h左右，取 200μl细胞液涂布于含Thia抗性(34μg/ml)的CGM平板，培养约2-3天，获得具有Thia 抗性的Clostridium acetobutylicum adc转化子。

1.3、验证引物合成及转化子验证：

甲砜霉素基因验证引物：

Cm-N：ATGTTACAGTAATATTGA

Cm-C：TTATAAAAGCCAGTCATT

红霉素基因验证引物：

Em-N：CCTACGCGTCTTATTTACTTCGTAATT

Em-C：GTAACGCGTGCGCAAAAGACATAATCG

adc基因敲除验证引物：

adc163-177：GAGCCCTTAGTCAGG

adc714-699：AACTTCAGCTCTAGGC

以Clostridium acetobutylicum adc转化子为模板，以Cm-N和Cm-C为引物，进行PCR 扩增。PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1m，30个循环；72℃ 2min。

取上述PCR产物，使用琼脂糖凝胶电泳检测，在0.7kb处有明显条带的转化子则为电 转进pSY7质粒的Clostridium acetobutylicum adc。

1.4、传代丢失pSY6-adc

把上面验证正确的转化子在接5ml CGM液体(含Thia 34mg/ml)中，给过24小时， 取200ul转接新的5mlCGM液体(含Thia 34mg/ml)。反复经过9天时间传代，取200μl 细胞液涂布于含Thia抗性(34μg/ml)的CGM平板。。以Em-N和Em-C为引物扩增红霉 素基因，以Cm-N和Cm-C为引物扩增氯霉素基因，采用实施例1.3相同的反应体系，进 行PCR扩增。

PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1m，30个循环；72℃ 2min。

取上述PCR产物，使用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。根据图2结果，其 中4，11，13，14号菌落无法扩增出红霉素基因，但可以扩增出氯霉素基因。取这4个菌 落为模板扩增用引物adc163-177和adc714-699扩增，结果如图3所示。根据图3结果，4 个菌落均显示内含子为插入状态，为发生环出。因此可以认为这4个菌的pSY6-adc已经 丢失。

实施例2、Clostridium acetobutylicum adc的诱变筛选

通过亚硝基胍来诱变Clostridium acetobutylicum adc，从中筛选溶剂转化率高的诱变 株。具体步骤如下：

2.1、Clostridium acetobutylicum adc的诱变筛选

将实施例1的已经丢失pSY6-adc的Clostridium acetobutylicum adc在CGM平板上划 线分离单菌，在厌氧箱内37℃培养48-96小时，挑Clostridium acetobutylicum adc的单菌 落至CGM培养液。

称取NTG溶于pH6-7.5的磷酸缓冲液中，使浓度为4毫克/毫升。在6毫升菌液中加 入NTG溶液2毫升，摇匀后37度保温半小时，稀释涂在加有丙烯醇的平板上，将平板置 于干燥器内，37度厌氧培养48-72小时，挑取平板上单菌进行发酵。

2.2、发酵

将单菌挑至5ml CGM培养基，37℃下厌氧培养过夜，将获得的培养液按5％接种量 转接至50ml CGM培养基，培养至对数生长中期，然后按10％的接种量转接至150ml浓 度分别为8％的玉米培养基中，添加1％克碳酸钙，于37℃厌氧培养48h。然后，利用气相 色谱测定溶剂产量。其中部分菌株发酵结果如表2所示。将诱变后菌命名为Clostridium acetobutylicum adc-M。

表2、诱变后发酵结果

实施例3、构建pSY6-buk质粒载体

通过PCR，扩增buk targetron片断，经XhoI及BsrG I双酶切，与同样酶切的pSY6 载体连接，得到敲除质粒pSY6-buk。其中，扩增buk targetron的模板及引物设计源于Sigma -Aldrich公司的Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)Kit。具体步骤如下：

3.1、引物设计

参考Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)Kit提供的方法，分别设计用于构 建pSY6-buk质粒载体的引物buk-IBS、buk-EBS1d和buk-EBS2，其序列分别为： buk-IBS：

5’-CCGCTCGAGATAATTATCCTTACAACTCAAATTGGTGCGCCCAGATAGGGTG-3’；

buk-EBS1d：

5’-CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCAAATTGGTTAACTTACCTTTCTT

TGT-3’；

buk-EBS2：

5’-TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTAGTTGTCGATAGAGGAAAGTGTCT-3’。

同时，还使用由TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit提供的通用引物 EBS。

其中buk-IBS2和通用引物EBS位于内含子内部，buk-IBS和buk-EBS1d位于内含子 上下游两侧。试剂盒预测的内含子理论插入位点是在基因组buk基因的第49和50个碱基 之间，正向插入。

3.2、buk-targetron片段制备

参考厂商提供的方法，使用其提供的模板，以buk-IBS，buk-EBS1d，buk-EBS2和 EBS为引物，使用Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)Kit进行PCR扩增，将 PCR产物进行凝胶电泳，结果如图4所示，根据图4的结果，在350bp处有条带，与预 期的结果一致，说明经PCR扩增得到buk-targetron片段。

然后，使用爱思进(Axygen)公司的胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，获得buk- targetron片段。

3.3、pSY6-buk重组质粒载体构建

将纯化的buk-targetron片段经XhoI和BsrGI酶切，与同样经XhoI及BsrGI酶切的 载体pSY6，使用T4连接酶连接，将获得的连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，并在 含氨卞青霉素Amp(100mg/L)的LB固体培养基中培养，筛选，获得有Amp抗性的转化 子。随机挑选3个转化子进行测序，测序结果显示，获得的转化子均含有如SEQ ID NO： 13所示的序列，即特异性识别buk基因插入位点的内含子序列，该结果显示所获得的质 粒在酶切位点XhoI和BsrGI之间已插入了含buk-targetron片段上下游引物buk-IBS和 buk-EBS1d的buk-targetron片段。

根据上述检测结果，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后获得的阳性转化子含有 重组质粒pSY6-buk。

实施例4、Clostridium acetobutylicum adc-M buk基因的敲除

将pSY6-buk质粒经E.coli ER2275/pANS在Cac8 I位点甲基化后，电转Clostridium acetobutylicum adc-M，复苏过夜后，取100μl细胞液涂布于40μg/ml Ery的选择性平板， 厌氧箱内于37℃培养48-96小时后，挑单菌，采用菌落PCR验证，具体步骤如下：

4.1、pSY6-buk质粒的甲基化

将pANS转化E.coli ER2275，获得E.coli ER2275/pANS。

制备E.coli ER2275/pANS的感受态细胞，然后将pSY6-buk质粒转化E.coli ER2275/pANS，由于pANS质粒具有Spc抗性，故在含有100μg/ml Amp，50μg/mlSpc的 LB培养基平板上过夜培养，然后挑单菌落至4ml加有100μg/ml Amp，50μg/mlSpc的LB 培养基中，过夜培养。然后，将获得的含pANS及pSY6-buk的E.coli ER2275，用质粒抽 提试剂盒抽提，从而获得Cac824 I识别位点已甲基化的质粒pSY6-buk。

4.2、电转pSY6-buk质粒至Clostridium acetobutylicum adc-M

将Clostridium acetobutylicum adc-M在CGM平板上划线分离单菌，在厌氧箱内37℃ 培养48-96小时，挑Clostridium acetobutylicum adc-M的单菌落至CGM培养液，37℃培养 过夜；然后，以1％比例转接至100ml CGM培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.7左右， 取50ml菌液，4000rpm，4℃离心10min，弃去上清；再以ETM缓冲液悬浮，4000rpm， 4℃离心10min，弃去上清；然后以1.0ml ET缓冲液悬浮；取100μl悬浮液，加入1-3μg pSY6-buk质粒，混匀后，加入电转杯中(2mm)，使用MicroPulser^TM电转仪电转，电击条 件为电压2.0kV，其余参考使用手册。电击后，再加入CGM培养基1ml，37℃培养10h 左右，取200μl细胞液涂布于含红霉素(40μg/ml)的CGM平板，培养约2-3天，获得 具有Ery抗性的Clostridium acetobutylicum adc-M转化子。

4.3、构建buk敲除的菌落PCR引物

设计一对引物C3075-for-s49/50和C3075-rev-s49/50，其序列如下所示：

C3075-for-s49/50：5’-TACTAATAATCAATCCTGGC-3’；

C3075-rev-s49/50：5’-AGTGTTATATTTTTCTATCTCTTC-3’。

由于buk-targetron引物设计时，预计在染色体adc基因内49-50nt之间正向插入内含 子，因而选取验证的引物为adc49/50nt侧翼序列，若基因内部有内含子的插入，则在菌落 PCR后电泳的对应泳道，能扩增到1.1kb左右的条带，如果是野生型，扩增条带大小为100bp 左右。

4.4、菌落PCR验证

以Clostridium acetobutylicum adc-M转化子为模板，以C3075-for-s49/50和 C3075-rev-s49/50为引物，采用实施例1相同的反应体系，进行PCR扩增。

PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃1.5m，30个循环；72℃2min。

取上述PCR产物，使用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。根据图5的结果， 在1.1kb处有明显条带的1-6号转化子在buk基因内部可能有内含子的插入。

4.5、buk敲除的其它验证

根据图5结果，将1.1kb处条带清晰的转化子接种至CGM培养基培养，抽取基因组 DNA。以抽提获得的基因组DNA为模板，以C3075-for-s49/50和C3075-rev-s49/50为引 物对，按实施例2.4的条件进行扩增，将PCR扩增产物进行电泳检测，检测结果如图6 所示，根据图6的结果，1-9号转化子的buk已插入intron。

实施例5、Clostridium acetobutylicum adc-M-buk的发酵

将buk基因敲除的重组菌Clostridium acetobutylicum adc-M-buk在不同浓度的玉米培 养基中进行发酵实验。具体过程如下：

将Clostridium acetobutylicum菌体在CGM平板上划线，37℃下厌氧培养，获得单菌。 然后将单菌挑至5ml CGM培养基，37℃下厌氧培养过夜，将获得的培养液按5％接种量 转接至50ml CGM培养基，培养至对数生长中期，然后按10％的接种量转接至150ml浓 度分别为8％的玉米培养基中，20小时添加1.5克碳酸钙，于37℃厌氧培养48h。然后， 利用气相色谱测定溶剂产量，结果如表3所示。转化率以总溶剂g/初始玉米g计算。

表3发酵结果

如以上实例及发酵结果所示，Clostridium acetobutylicum adc-M-buk变体丁醇比例能够 接近Clostridium acetobutylicum adc，达到近80％，乙酸积累较Clostridium acetobutylicum adc有所减少，其转化率较Clostridium acetobutylicum adc提高。

综上所述，本发明通过化学诱变并结合基因工程手段，成功减少了酸的合成，从而有 效提高发酵产物中总溶剂的转化率，因而对于单产丁醇代谢工程具有重要意义。

另外，虽然以上实施例仅以Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061为例进行了说 明，但是本领域的技术人员通过本发明的公开，很容易看出本发明的方法同样适用于其它 的产溶剂梭菌，这些菌株包括但不限于：C.acetobutilicum，C.beijerinckii，C. saccharobutylicum，C.saccharoperbutylacetonicum，C.aurantibutyricum，C.butyricum，C. casaveris，C.pasteurianum，C.puniceum，C.sporogenes，C.tetanomorphum，C. thermosaccharolyticum，C.felsineum。因此这些内容同样应当属于本发明的范围。