牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，它采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据折光马尔太虫共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物。应用本发明的LAMP检测试剂盒，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎折光马尔太虫，解决了现有技术检测时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷，具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单，特别适于基层现场快速检测牡蛎折光马尔太虫的需要。

说明书

技术领域

本发明涉及牡蛎折光马尔太虫检测领域，尤其是一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试 剂盒。

背景技术

折光马尔太虫(Marteilia refringens)对牡蛎养殖的危害较大，可引起贝类消瘦、 消化道变色、停止生长并死亡，大洋洲和欧洲等国家其感染现象普遍存在。

折光马尔太虫的传统检测方法有电镜观察、组织细胞学检查、原位杂交等，这些方法 费时费力，缺乏专一性，在实际工作中具有一定的局限性。目前，虽已建立起折光马尔太 虫PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性也比较高，但是常规PCR需要使 用PCR仪和进行凝胶电泳，荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等，， 因而难以适应基层现场检测需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简 便且成本低的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测牡蛎折光马 尔太虫的需要。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：

反应液A：含有10×等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、10mM dNTPs、25mM硫 酸镁、20uM的内引物1、20uM的内引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的环 引物1、20uM的环引物2、5M甜菜碱、625μM钙黄绿素和12.5mM氯化锰；10×等温反应 缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸 铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

内引物1序列为CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA，

内引物2序列为AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT，

外引物1序列为GTCCGAGTGATCTTGTCAGC，

外引物2序列为CGAGTAAGTGCATGCACAAC，

环引物1序列为TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG，

环引物2序列为ACCCACAACTTCGATAGCCCC。

反应液A每管24μL，其组成为：2.5ul 10×等温反应缓存液、1.0ul Bst DNA聚合 酶8U/ul、3.5ul 10mM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、0.25ul 20uM的内引物1、0.25ul 20uM 的内引物2、2ul 20uM的外引物1、2ul 20uM的外引物2、1ul 20uM的环引物1、1ul 20uM 的环引物2，1ul 5M甜菜碱、1ul 625μM钙黄绿素和1ul 12.5mM氯化锰和2.5ul双蒸 水。

本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据折光马尔太虫共有的基因保守区(见 序列表SEQ.ID.No.1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物， 由此发明了用于快速检测牡蛎折光马尔太虫的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒。应用 本发明的LAMP检测试剂盒建立牡蛎折光马尔太虫检测方法，仅需通过对组织样品进行DNA 提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎折光马尔太虫。该法无需昂贵的PCR仪只需 普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而 快速，特别适用于基层现场检测。

另外，常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入SYBR Green I或Gene Finder 染料来显色，容易造成假阳性：一方面，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳 性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因 此，本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的SYBR Green I和Gene Finder染料， 即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入；而且，钙黄绿素 +氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色，避免了SYBR Green I和Gene Finder染料带 来的假阳性问题，所以具有更好的特异性。

附图说明

图1是应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。

图1中：1折光马尔太虫，2单孢子虫，3副溶血弧菌，4溶藻弧菌，5派琴虫，6河 弧菌，7贝类组织。

图2是应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。

图2中：1-8分别为以下不同浓度的牡蛎折光马尔太虫DNA 20ng/管，2ng/管，200pg/ 管，20pg/管，2pg/管，200fg/管，20fg/管，2fg/管。

图3是PCR方法检测牡蛎折光马尔太虫敏感性试验结果图。

图3中：M为100bp DNA ladder，1-8分别为以下不同浓度的牡蛎折光马尔太虫DNA 20ng/管，2ng/管，200pg/管，20pg/管，2pg/管，200fg/管，20fg/管，2fg/管。

具体实施方式

一、牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的配制

反应液A：每管24μL，其组成为：2.5ul 10×等温反应缓存液、1.0ul Bst DNA聚合 酶8U/ul、3.5ul 10mM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、0.25ul 20uM的内引物1、0.25ul 20uM 的内引物2、2ul 20uM的外引物1、2ul 20uM的外引物2、1ul 20uM的环引物1、1ul 20uM 的环引物2，1ul 5M甜菜碱、1ul 625μM钙黄绿素和1ul 12.5mM氯化锰和2.5ul双蒸 水。

其中，10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100。

内引物1序列为CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA(见序列表 SEQ.ID.No.2)，

内引物2序列为AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT(见序列表 SEQ.ID.No.3)，

外引物1序列为GTCCGAGTGATCTTGTCAGC(见序列表SEQ.ID.No.4)，

外引物2序列为CGAGTAAGTGCATGCACAAC(见序列表SEQ.ID.No.5)，

环引物1序列为TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG(见序列表SEQ.ID.No.6)，

环引物2序列为ACCCACAACTTCGATAGCCCC(见序列表SEQ.ID.No.7)。

二、应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒检测牡蛎折光马尔太虫的方法(以下 简称LAMP检测法)

1、组织样品中DNA的提取

使用北京天跟生物工程公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(商品名：海洋动 物组织基因组DNA提取试剂盒，型号：DP324-03)提取组织DNA，浓度能达到20ng/ul。

2、牡蛎折光马尔太虫LAMP反应

以提取的牡蛎折光马尔太虫DNA为模板，在装有24μL反应液A管中加入1μL待检 DNA构成25ul反应体系；LAMP反应程序如下：61℃60min，然后80℃5min。直接用肉眼 观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有牡蛎折光马尔太虫；如果颜色为黄色， 说明待检样品不含有牡蛎折光马尔太虫。

三、LAMP检测法的特异性和敏感性试验

1.特异性试验

分别以折光马尔太虫、单孢子虫、副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌和贝类组 织的核酸为模板，按照前述牡蛎折光马尔太虫LAMP反应体系和条件进行反应。

结果见图1，对牡蛎折光马尔太虫的检测为阳性结果(显示绿色)，而对单孢子虫、副 溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌和贝类组织的检测均为阴性(显示黄色)。

2.敏感性试验

将牡蛎折光马尔太虫DNA按10倍递增稀释成20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、 20fg、2fg。

牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法检出限与PCR对比

牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法反应体系和条件按前述进行。

牡蛎折光马尔太虫PCR反应组成如下：在25ul的反应体系中含10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μl，牡蛎样品模板DNA 1μL， 25μmol/L的上、下游引物(上游引物为Marteilia 1：5-TACGACCGTAGCCTTTCCAC-3；下游 引物为Marteilia 2：5-CGCCTCTACTCTTCTCCCAA-3)各0.5μl，ddH₂O补足25μL。扩增程 序为94℃变性5分钟，然后进入94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟的 循环，共进行35个循环，最后再经72℃延伸10分钟。

牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法通过肉眼直接观察结果，结果见图2。将PCR产物在 1％琼脂糖凝胶中进行电泳，然后进行溴化乙锭染色，结果见图3。牡蛎折光马尔太虫LAMP 检测方法的检测限为20fg，而常规PCR的检测限为2pg，LAMP方法敏感性比常规PCR高 100倍。