鉴别诊断尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的LAMP方法的建立与初步应用

摘要

羊泰勒虫病(ovine and caprine theileriosis)是中国西北地区广泛分布的一类血液原虫病，该病危害严重，给养羊业造成重大经济损失。我国的羊泰勒虫病主要由两种泰勒虫引起——吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）和尤氏泰勒虫（T.uilenbergi）（早期被认为是莱氏泰勒虫(T.lestoquardi)）。大多数羊泰勒虫病例是属于吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的混合感染，但是传统的方法很难区分开，因此找到快速准确的检测技术，用于鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的感染，成了现阶段的当务之急。
　　 本文主要是针对吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的18S rRNA基因序列高变区，分别设计4条特异地识别6个区域的LAMP引物。通过优化条件，扩增产物的序列测定，评价特异性和敏感性，同时经实验动物感染样品的评价，建立了一个可以鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的LAMP方法，并在小范围的流行病学调查中进行了初步的应用。研究结果表明:
　　 根据18S rRNA的基因序列设计的通用引物可以同时检测到吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫，并且与其他的梨形虫无交叉反应。根据18S rRNA的基因序列设计的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性引物TC1、TC2，与羊的其它梨形虫无交叉反应，敏感性分别可以达到2 pg/μL和2 pg/μL。
　　 扩增产物测序分析显示目的片段的测序结果与NCBI上已经提交的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫18S rRNA序列对比完全吻合。
　　 本研究所建立的LAMP方法可以在试验羊攻蜱后14d检测出吕氏泰勒虫，尤氏泰勒虫泰勒虫13d可以检测出，均早于传统镜检的方法，说明该方法可以用于早期诊断。
　　 在对野外样品的检测中，广西省没有发现羊泰勒虫的感染;广东省、贵州省、重庆市仅检测出吕氏泰勒虫;甘肃省既发现了吕氏泰勒虫也检测出了尤氏泰勒虫，在92份检测样品中有21份为共同感染。
　　 本研究通过对所建立的LAMP方法的敏感性与特异性、在感染羊泰勒虫的动物中最早能检测出的时间对比以及野外样品的检测，证实本实验建立的鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的LAMP方法可以用于早期诊断、鉴别诊断、以及两种泰勒虫流行病学调查，可以在基层兽医机构推广，对确定我国羊泰勒虫分布有着实际应用意义。