利用酪丁酸梭菌发酵甘蔗渣水解液生产丁酸的工艺

摘要

本发明公开的利用酪丁酸梭菌发酵甘蔗渣水解液生产丁酸的工艺，步骤包括：将酪丁酸梭菌接种于种子培养基中，得到一级种子；取一级种子接种于种子培养基，得到二级种子作为发酵母种；将发酵母种接种于预发酵罐中经扩大培养后，将培养液泵入纤维床生物反应器内，维持循环，当游离的菌体浓度降为1.0-3.0g/L，将培养液更换为甘蔗渣水解液发酵培养基进行批次发酵、补料发酵或反复批次发酵，得到丁酸；本发明工艺简单，以甘蔗渣水解液为碳源，利用纤维床生物反应器进行固定化发酵，可以资源化利用甘蔗渣等农业废弃物，降低发酵法生产丁酸的成本，提高丁酸发酵产率和得率，同时可省去反复接种，并连续长期稳定运行，易于进行工业放大。

说明书

技术领域

本发明涉及生产丁酸的工艺，尤其是利用酪丁酸梭菌发酵甘蔗渣水解液生产丁酸的工艺，属于有机酸发酵技术领域。 

背景技术

正丁酸（Butyric acid，以下简称丁酸），又名酪酸，分子中含有四个碳原子，是以直链型方式相连接的短链饱和脂肪酸，具有刺激性气味，极稀溶液也有汗臭味。丁酸常以酯的形式或游离状态存在于自然界中。丁酸是一种多用途的精细化学品，广泛应用于食品、化学和医药等行业。在食品工业中配制糖果、饮料调味剂，在香料工业中用于配制果子香精；丁酸纤维素在防老化、耐水性、收缩性等方面均优于醋酸纤维素；醋酸丁酸纤维素酯能溶于许多溶剂中，与树脂、塑料互混能力比单醋酸纤维素酯强，并具有良好的耐热、耐光和抗湿性；还能用于医药中间体的制备，如γ-氨基丁酸的抗缺氧能力显著，(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多种血管紧张素转化酶抑制剂的重要中间体，用于治疗高血压和充血性心力衰竭等心血管疾病；此外，丁酸钠盐还可作为替代抗生素的饲料添加剂饲喂家禽，以促进生长。 

目前，丁酸的生产工艺以化学合成法为主，包括正丁醛氧化法、丙烯羰基合成法、丁醇氧化法等，其中以间歇式丁醛氧化制备丁酸工艺在工业上的应用最为广泛，但工艺复杂操作条件苛刻，环境污染严重等传统化工普遍存在的问题没有得到有效解决。随着化石性资源日渐枯竭、传统化工造成环境的严重污染以及人们对生物基化学品和生物能源需求的快速增加，化学工业呈现出从石油基到生物基的转变趋势。在这一转变过程中，可再生生物质资源利用和生物加工是一个重大的研究方向，特别是非粮原料和废弃生物质已成为当前生物炼制工程的热点。另外，由于丁酸和下游衍生产品相当比例应用于食品、饲料和医药等行业，从生物质出发经过生物合成的丁酸（称为生物丁酸）更受欢迎。 

微生物发酵法利用的产丁酸菌多为专性厌氧菌，主要包括梭菌属（Clostridium）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、丁酸杆菌属（Butyribacterium）、八叠球菌属（Sarcina）、真杆菌属（Eubacterium）、梭杆菌属（Fusobacterium）和巨球形菌属（Megasphaera）等。其中，梭菌属细菌为革兰氏阳性的产芽孢杆菌，属化能异养型的专性厌氧菌，易从土壤、废水、动物消化系统、乳制品污染环境中分离得到，生长培养基配方简单，对环境的适应性强，已成为众多国内外学者研究微生物发酵生产丁酸的出发菌株。在众多产丁酸菌株中，酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）能代谢葡萄糖、木糖和果糖合成丁酸、乙酸、氢气和二氧化碳，相比于丙酮-丁醇菌株，其代谢途径简单，主产物丁酸产量稳定、得率高，副产物氢气产量高，亦能利用廉价的生物质资源作为原料，具有广阔的商业应用前景。但迄今为止，由于生物发酵法生产丁酸存在原料成本高（占产品成本的20-50%）、单位体积产量低（质量浓度小于100 g/L）、副产物乙酸含量高等缺点，使其始终无法替代化学合成法，因此，寻找廉价的基质原料，在此基础上探索高效稳定的发酵工艺以提高单位体积丁酸产量并降低副产物，对于生物法制备丁酸的工业化应用具有重要的现实意义。 

甘蔗渣主要由半纤维素和木聚糖构成，经水解可生成葡萄糖和木糖。而酪丁酸梭菌能够利用葡萄糖、木糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、甘油等生产丁酸，而且能够利用多种非粮作物（如木薯）及工农业废弃物（乳清、玉米皮酸水解物、甘蔗糖蜜、木薯渣水解液和玉米浆等）生产丁酸，表明丁酸发酵能够充分利用多种可再生资源转化的可发酵性糖，是生物炼制工程中最有前景的方向之一。 

运用传统发酵工艺生产丁酸往往出现生产效率低、细胞生长对丁酸的选择性低、终产物的抑制作用导致丁酸浓度和得率低等难题，这些也造成丁酸分离难度大和成本高。纤维床生物反应器（FBB）是由美国俄亥俄州立大学的杨尚天教授等人在改进传统的填充床反应器性能的基础上设计出的一种简单、高效的生物反应器，适用于厌氧微生物固定化发酵，并首先应用于丙酸发酵。纤维床生物反应器选择棉纤维织物等纤维材料作为固定细胞的载体，具有以下优点：①材料化学惰性，对细胞不具毒害作用，也不会被细胞降解，不影响微生物的生长代谢；②具有较高的孔隙率（>95%）和比表面积（>40 m²/m³），因此具有良好的传质性能；③具有较高的载体活性，即固定化细胞的活性回收率高；④单位体积固定的细胞数多（细胞密度最高可达70 g/L）；⑤容易获得，价格便宜，固定化成本低；⑥制备方法简单，固定化过程温和，适于大规模生产；⑦有较高的机械强度（以不锈钢丝支撑能进一步强化其机械强度），能较长时间使用；⑧生物、化学及热力学稳定，因此成为一种理想的细胞固定载体。 

发明内容

本发明目的是提供一种利用酪丁酸梭菌发酵甘蔗渣水解液生产丁酸的工艺。一方面，可以降低微生物发酵法生产丁酸的成本，提高丁酸发酵产率和得率，另一方面，可以资源化利用甘蔗渣等农业废弃物。 

本发明的利用纤维床固定化发酵甘蔗渣生产丁酸的工艺，包括以下步骤： 

1）用接种针蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸钠的强化培养基平板上划线后， 置37 ℃培养72 小时；酪丁酸梭菌（编号ATCC 25755）的分类命名：中文名为酪丁酸梭菌，拉丁文学名为 Clostridium tyrobutyricum，酪丁酸梭菌购自位于美国华盛顿的美国典型培养物保藏中心（(American Type Culture Collection)。

2）将步骤1）平板上的单菌落接种于含50 mL生长培养基的100 mL厌氧瓶中培养72 小时，得到一级种子； 

3）取1.5 mL一级种子接种于含50 mL生长培养基的100 mL厌氧瓶中培养72 小时，得到二级种子，作为发酵母种；

4）取3 mL发酵母种接种于含100 mL生长培养基的500 mL厌氧瓶中培养48 小时后， 接种于含2 L 生长培养基的5 L预发酵罐中进行24 小时的扩大培养，使菌体浓度达到6.0-10.0 g/L，利用蠕动泵以60-100 mL/min的速度将经扩大培养的培养液泵入纤维床生物反应器内，维持循环，当游离的菌体浓度降为1.0-3.0 g/L，将上述的培养液更换为甘蔗渣水解液发酵培养基进行批次发酵、补料发酵或反复批次发酵，得到丁酸；发酵过程中，搅拌转速控制在150 rpm，温度设定为37°С，用6 mol/L的NaOH维持pH在6.0；

上述的甘蔗渣水解液发酵培养基成分包括：总糖70 g/L、酵母抽提物 5 g/L、蛋白胨 5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 3 g/L 、K₂HPO₄ 1.5 g/L、MgSO₄7H₂O 0.6 g/L、FeSO₄7H₂O 0.03 g/L；所说的总糖为甘蔗渣水解液配制而成，其中甘蔗渣水解液制备方法如下：将烘干后的甘蔗渣与0.3mol/L硫酸以质量比1:10混合，于121℃水解30 min，过滤，离心取上清，将pH值调至6.0；

上述的生长培养基成分为：葡萄糖 30 g/L、酵母抽提物 5 g/L、蛋白胨 5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 3 g/L 、K₂HPO₄ 1.5 g/L、MgSO₄7H₂O 0.6 g/L、FeSO₄7H₂O 0.03 g/L；

上述的强化培养基是在生长培养基的基础上添加50 mg / mL丁酸钠，培养条件：37°С、pH 6.0、厌氧环境。

本发明以甘蔗渣水解液为碳源，利用纤维床生物反应器进行固定化发酵，若甘蔗渣水解液仅批次发酵得到的丁酸浓度较低，会给后续分离带来较大困难。为了进一步提高丁酸产量，在发酵过程中，当总糖浓度接近0时，可采用补充甘蔗渣水解液，形成以甘蔗渣水解液为碳源的固定化补料发酵生产丁酸工艺。为了反复利用纤维床生物反应器进行固定化发酵，也可以甘蔗渣水解液为碳源，反复进行批次发酵，形成以甘蔗渣水解液为碳源的固定化反复批次发酵工艺。实现固定化发酵生产丁酸的连续性，并降低生产成本。 

本发明的有益效果在于： 

从粮食安全和生产成本角度，研究利用非粮原料——甘蔗渣水解液发酵生产丁酸的生物炼制工艺。甘蔗渣水解液的预处理工序操作条件温和，设备简单，易于进行工业放大，对提高丁酸产量效果明显。发酵过程中，纤维床生物反应器能有效大量固定活力高、代谢能力强的菌体（50-70 g/l），有利于简化操作流程，省去反复接种、扩大培养以及清洗罐体等工序，延长工作周期（可连续操作1-3个月），提高运行过程的稳定性，反复批次发酵甘蔗渣水解液仍能维持较高的糖酸转化率（0.38-0.50 g/g发酵糖），具有广阔的工业化前景。

本发明工艺简单，以甘蔗渣水解液为碳源，利用纤维床生物反应器进行固定化发酵，可以资源化利用甘蔗渣等农业废弃物，降低发酵法生产丁酸的成本，提高丁酸发酵产率和得率，同时可省去反复接种，并连续长期稳定运行，易于进行工业放大。 

附图说明

图1是发酵丁酸的纤维床生物反应器系统示意图； 

图中：1. 搅拌式预发酵罐； 2. 双向蠕动泵； 3. 纤维床固定化装置； 4. pH电极；5. pH监测器；6. 尾气吸收装置；7. 储碱瓶；8. 氮气补入装置。

图2 是批次发酵丁酸的动力学图；图中： 

。

图3 是补料发酵丁酸的动力学图；图中： 

。

图4 是反复批次发酵丁酸的动力学图；图中： 

。

具体实施方式

实施例1 

本实施例给出的是以甘蔗渣水解液为碳源进行纤维床固定化酪丁酸梭菌批次发酵丁酸的工艺，步骤如下：

1)用接种针蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸钠的强化培养基平板上划线后， 37 ℃培养72 小时。酪丁酸梭菌（编号ATCC 25755）的分类命名：中文名为酪丁酸梭菌，拉丁文学名为 Clostridium tyrobutyricum，酪丁酸梭菌购自位于美国华盛顿的美国典型培养物保藏中心（(American Type Culture Collection)。

强化培养基成分包括：葡萄糖 30 g/l，酵母抽提物 5 g/l，蛋白胨 5 g/l，（NH₄）₂SO₄ 3 g/l，K₂HPO₄ 1.5 g/l，MgSO₄7H₂O ，0.6 g/l，FeSO₄7H₂O 0.03 g/l，50 mg/mL丁酸钠，培养条件：37°С、pH 6.0、厌氧环境。 

2)   将平板上的单菌落接种于含50 ml生长培养基的100 ml血清瓶中培养72 小时，得到一级种子。生长培养基成分为：葡萄糖 30 g/l、酵母抽提物 5 g/l、蛋白胨 5 g/l、（NH₄）₂SO₄ 3 g/l 、K₂HPO₄ 1.5 g/l、MgSO₄7H₂O 0.6 g/l、FeSO₄7H₂O 0.03 g/l； 

3）取1.5 ml一级种子接种于含50 ml生长培养基的100 ml厌氧瓶中培养72 小时，得到发酵母种；

4）取3 mL发酵母种接种于含100 mL生长培养基的500 mL厌氧瓶中培养48 小时后，接种于含2 L 生长培养基的5 L搅拌式预发酵罐中进行24 小时的扩大培养，使菌体浓度达到8.0 g/L，利用蠕动泵以80 mL/min的速度将经扩大培养的培养液泵入如图1所示的纤维床生物反应器内，进行循环，当大部分菌体固定在纤维床内，即游离的菌体浓度降为2.0 g/L时，将上述培养液更换为甘蔗渣水解液发酵培养基，继续发酵。搅拌转速控制在150 rpm，发酵温度为37°С，用6 mo/L NaOH维持pH在6.0；

图1中搅拌式预发酵罐通过管路连接右边带有恒温水夹套的玻璃柱材质纤维床固定化装置 (? 50 mm ×310 mm) 。其中185 mm ×300 mm棉布织物(厚5 mm ,空隙率90 %)用不锈钢丝网固定成螺旋状，置于反应器柱体内，底部填充25-38 mm高的玻璃弹簧以使流体分布均匀，其工作体积为480 ml。

上述的甘蔗渣水解液发酵培养基成分包括：总糖70 g/L、酵母抽提物 5 g/L、蛋白胨 5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 3 g/L 、K₂HPO₄ 1.5 g/L、MgSO₄7H₂O 0.6 g/L、FeSO₄7H₂O 0.03 g/L。总糖为甘蔗渣水解液配制而成，其中甘蔗渣水解液制备方法如下：将烘干后的甘蔗渣与0.3mol/L硫酸按质量比1:10混合，于121℃水解30 min，过滤，离心取上清，将pH值调至6.0； 

待发酵液中糖浓度接近0时即停止发酵，批次发酵丁酸的动力学如图2所示。

实施例2 

本实施例给出的是以甘蔗渣水解液为碳源纤维床固定化酪丁酸梭菌补料发酵丁酸的工艺，步骤如下：

1）同实施例1步骤1）；

2）同实施例1步骤2）；

3）同实施例1步骤3）；

4）操作步骤同实施例1步骤4），区别在于当发酵液中糖浓度接近0时，补加甘蔗渣水解液，共补加3批，直至发酵产物丁酸的终浓度不再增加。发酵186 小时后总糖浓度不再下降，气相色谱法测得丁酸终浓度为62.8 g/L。补料发酵丁酸的动力学如图3 所示。

实施例3 

本实施例给出的是以甘蔗渣水解液为碳源纤维床固定化酪丁酸梭菌反复批次发酵丁酸的工艺，步骤如下：

1）同实施例1步骤1）；

2）同实施例1步骤2）；

3）同实施例1步骤3）；

4）操作步骤同实施例1步骤4），区别在于发酵过程中当糖浓度接近0时更换新的甘蔗渣水解液发酵培养基，共更换5批，气相色谱法测得丁酸平均终浓度为22.9 g/L，反复批次发酵丁酸的动力学如图4所示。