一种羌活种子和宽叶羌活种子的快速鉴别方法

摘要

本发明公开了一种羌活种子和宽叶羌活种子的快速鉴别方法，是运用高效液相色谱电喷雾质谱法结合聚类分析对羌活种子进行真实性鉴定的方法，包括以下步骤：选取来源确切的羌活种子和宽叶羌活种子标准样品；对标准样品以12种标准化合物为特征对照品，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行定性定量分析，建立标准样品的标准高效液相色谱电喷雾质谱图；对得到的标准高效液相色谱电喷雾质谱图用聚类分析法建立羌活种子和宽叶羌活种子的标准主成分分析模型；运用标准高效液相色谱电喷雾质谱图确定特征对照品，并结合标准主成分分析模型对通过高效液相色谱电喷雾质谱法对待测种子进行分析、鉴定；该方法可实现对羌活属种子真实性的快速鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及快速鉴定种子的方法，特别是对于羌活种子和宽叶羌活种子的快速鉴别方法。 

背景技术

羌活是我国传统中藏羌药中的常用药材，始载于《神农本草经》，有数千年的药用历史，味辛、性温，具解表散寒、祛风除湿、止痛之功效，主治风寒感冒，头痛项强，风湿痹痛、肩背酸痛发等症。《中华人民共和国药典》2010年版I部规定其基原为伞形科(Umbelliferae)羌活属(Notopterygium)植物羌活(Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang)和宽叶羌活(Notopterygium franchetii deBoiss.)的干燥根茎及根。主要化学成分为挥发油、香豆素和有机酚酸，除此之外还含有甾醇、糖类、氨基酸等成分。现代药理研究表明羌活具有抗炎、解热镇痛、抗心律失常、抗菌和抗氧化作用，改善血液循环及增强肌体免疫功能的作用，对心脑血管疾病也有确切疗效。目前入方成药达280余种，全国关联的制药企业超过七百家。羌活属为中国特有，本属的药用植物仅分布于我国青藏高原东缘的高寒生境，其中，羌活(Notopterygium incisum)主产四川甘孜、阿坝州、及相毗邻的青海南部、西藏东南部的高海拔山地，药材习称“川羌”，也是传统高等级商品药材蚕羌等的主要来源；宽叶羌活(Notopterygium franchetii)主产青海、甘肃及四川产区的较低海拔山地，药材习称“西羌”，质量及商品规格均较川羌低。两种植物来源的药材在商品规格和市场价值上存在较大差距。 

随着羌活药材需求量的持续增长，加上近年来高强度的掠夺性采挖，羌活的野生资源遭受严重破坏，恢复和更新受到严重制约。为了有效保护和可持续利用该特有的民族药用植物资源，其人工栽培日益受到关注。目前羌活种子发芽育苗技术已取得重大突破，为实现羌活人工种植的产业化提供了技术支撑，优质种子供应是羌活规模化种植必须解决的重要问题，而种子的真实性鉴别成为种子质量检验的基础和核心。目前，种子真实性的鉴定方法主要有种子形态法、快速测定法(借助荧光物质等特定化学试剂显色)、培养生长箱测定法(幼苗鉴定)；电泳法、分子标记技术鉴别。但一方面由于羌活、宽叶羌活及其伪劣种子在形态上无法区分，而采用其他生物技术手段尚未形成稳定而准确的鉴别方法；幼苗鉴定法虽能准确鉴定结果，但前后将耗时9个月以上，难以应用于生产，对羌活种子的真伪实现快速准确的鉴定成为羌活科研和生产实践面临的一个新的瓶颈问题。 

高效液相色谱电喷雾质谱联用法具有快速、准确、灵敏、经济等特点，能够从化学成分上评价中药材质量，做到安全、有效、可控，目前在中药材的鉴别和质量评价领域中已经广泛应用，有关化学计量学的主成分分析在药材的鉴定领域已有相关报道，因此，这里首次应用高效液相色谱电喷雾质谱联用法结合主成分分析鉴别羌活种子和宽叶羌活种子，效果显著，为羌活属种子的真实性检验提供一种强有力的分析手段。 

发明内容

本发明为解决羌活种子和宽叶羌活种子的鉴定问题，所以提出了采用高效液相色谱电喷雾质谱联用法结合主成分分析的方法来快速鉴定羌活种子和宽叶羌活种子，不仅可以快速鉴定，而且鉴定结果准确，几乎零误差。 

本发明的技术方案如下： 

一种羌活种子和宽叶羌活种子的快速鉴别方法，其特征在于：以至少包括异欧前胡素、珊瑚菜内酯、异戊烯基伞形花内酯、水合氧化前胡素、香叶木素、佛手柑内酯、(-)-氧化前胡素、紫花前胡苷、佛手酚-O-β-D-葡萄糖苷、伞形花内酯、阿拉善苷C和犬尿喹酸在内的12种化合物为特征对照品，采用高效液相色谱电喷雾质谱法对不同来源的羌活种子和宽叶种子样品进行定性定量分析，并与12种特征对照品进行比较，得出不同来源的羌活种子和宽叶羌活种子样品的共有成分及区别性成分，并运用聚类分析法建立羌活种子和宽叶羌活种子的标准主成分分析模型，通过标准主成份分析模型得到的结果实现对待测的羌活种子和宽叶羌活种子的快速鉴别。

所述方法的具体鉴别步骤如下： 

(1)选取至少30个来源确切的羌活种子和至少30个来源确切的宽叶羌活种子标准样品，羌活种子标准样品为伞形科羌活属植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang，宽叶羌活种子标准样品为宽叶羌活Notopterygium franchetii deBoiss.的种子；

(2)配制12种特征对照品溶液，建立该12种特征对照品的高效液相色谱电喷雾质谱图；12种特征对照品是我们从鉴定为羌活Notopterygium incisum种子和宽叶羌活Notopterygium franchetii种子的样品中分离得到，并经UV、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR等现代波谱解析技术进行结构确定，纯度≥98％；

(3)采用高效液相色谱电喷雾质谱法对已知的不同来源的羌活种子和宽叶种子样品进行定性定量分析，得到已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图；(4)将步骤(3)所得到的已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图与步骤(2)得到的12种特征对照品的高效液相色谱电喷雾质谱图进行比较，得出羌活种子 和宽叶羌活种子样品的共有成分及区别性成分； 

(5)对步骤(3)所得到的已知来源的羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图用聚类分析法建立羌活种子和宽叶羌活种子的标准主成分分析模型；

(6)采用高效液相色谱电喷雾质谱法对待测种子进行定性定量分析，将分析得到的结果与步骤(5)得到的标准主成分分析模型进行比对，快速鉴定待测种子的真实性。

建立步骤(2)中所述该12种特征对照品的高效液相色谱电喷雾质谱图过程如下：首先，配制特征对照品溶液：分别精密(用千分之一的分析天平)称取12种特征对照品适量，加入甲醇，分别配制成每1mL甲醇含1mg特征对照品的溶液； 

然后，分别精密吸取以上12种特征对照品溶液各20μL注入高效液相色谱电喷雾质谱联用仪，采用高效液相色谱电喷雾质谱法对12种特征对照品溶液进行测定，得到12种特征对照品的高效液相色谱电喷雾色谱图。

建立步骤(3)中所述已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图过程如下： 

首先，按照20目-90目粉碎，精密称取已知来源羌活种子和宽叶羌活种子适量，浸泡在浓度为50％-100％的甲醇中，得到每20mL甲醇含0.5g的供试样品溶液10ml-50ml，超声提取20min-60min，过滤得第一次滤渣，第一次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取20min-60min，过滤得第二次滤渣，第二次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取20min-60min，合并滤液，减压浓缩，定容到10ml-100ml容量瓶中，取2mL样品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，配制完成；

然后，精密吸取供试样品溶液10μL，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行测定，得到供试样品的高效液相色谱电喷雾质谱图。

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱为：TIANHE kromasil C18，5μm，250mm×4.6mm；或依利特Hypersil C18，5μm，250mm×4.6mm；或Agilent Zorbax SB-AqC18，5μm，150mm×3.0mm；或Inertsil ODS-3C18，5μm，250mm×4.6mm；或AichromBond-AQ C18，5μm，250mm×4.6mm；流动相条件：甲醇和0.1％的乙酸水溶液梯度洗脱，或者甲醇和0.2％的乙酸水溶液梯度洗脱，或者甲醇和0.3％的乙酸水溶液梯度洗脱；或者甲醇和0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，或者甲醇和0.2％甲酸水溶液梯度洗脱，或者甲醇和0.3％甲酸水溶液梯度洗脱；或者甲醇和0.1％磷酸水溶液梯度洗脱。 

所述梯度洗脱过程为：初始为0分钟时，甲醇比例为35％；经过10min后(即在0-10min内)，甲醇比例由35％升到40％；再经过10min后(即10-20min内)，甲醇比例由 40％升到55％；再经过25min后(即20-45min内)，甲醇比例由55％升到75％；甲醇比例为75％时，保持5min(即45-50min内)；再经过5min后(即50-55min内)，甲醇比例由75％升到87.5％；所述比例均为体积比。 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱柱温：20～35℃；检测波长：220～240nm和300～340nm；流速：0.7～1.0mL/min；进样量：20μL； 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的质谱ESI源电压：2.5～4kV；正、负离子检测；以氮气作为鞘气，流速：20～80au；辅助气为N₂，流速：10～40au；毛细管温度：280～320℃；毛细管电压：±3～±6V；扫描范围：m/z 50～2000。

所述已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图与特征对照品的高效液相色谱电喷雾质谱图进行比对后，其中：异欧前胡素、香叶木素、紫花前胡苷、佛手酚-O-β-D-葡萄糖苷、阿拉善苷C为羌活种子和宽叶羌活种子两者的共有成分，珊瑚菜内酯、异戊烯基伞形花内酯、佛手柑内酯、(-)-氧化前胡素和伞形花内酯在宽叶羌活种子样品中含量较大，而羌活种子中水合氧化前胡素和犬尿喹酸含量比宽叶羌活种子大。 

步骤(5)中所述用聚类分析法建立羌活种子和宽叶羌活种子的标准主成分分析模型，是采用SIMCA模式识别法(UMETRICS公司的SIMCA-P 12版本)对羌活种子和宽叶羌活种子高效液相色谱电喷雾质谱法获得的定性定量数据进行主成分分析，进一步确认羌活种子和宽叶羌活种子。 

本发明的有益效果如下： 

采用高效液相色谱电喷雾质谱法可以对羌活和宽叶羌活种子中主要化学成分进行定性定量分析，在此基础上结合主成分分析法可以实现对两者的快速鉴别；本方法具有快速、准确、稳定性和重复性良好等优点，为快速客观区分形态和解剖手段难以鉴别的种子来源及真伪提供了一种新的技术手段，适合特别近似或者容易混淆的种子样品的快速鉴别，有较高的可靠性和实际应用价值。

附图说明

图1为本发明在240nm下混标溶液、两种羌活种子样品(Ni101和Ni152)和两种宽叶羌活种子样品(Nf239-8mu和Nf228-A)的液相色谱图 

图2为本发明确定的12种特征对照品的结构图

图3为本发明对羌活种子和宽叶羌活种子样品进行主成分分析的SIMCA聚类分析二维图

图4为本发明对羌活种子和宽叶羌活种子样品进行主成分分析的SIMCA聚类分析三维图

其中，图3中的“▲”代表羌活种子样品(1-37)；“◆”代表宽叶羌活种子样品(38- 68)。

具体实施方式

高效液相色谱法作为一种分离分析的手段已经广泛应用在药物化学、食品安全、环境监测等领域，与质谱联用也越来越受到大家的青睐，不论是定性还是定量都达到了非常好的效果。为了从化学成分上对羌活种子和宽叶羌活种子进行区分，首先分别对两者进行了化学成分的分离和鉴定，结果显示主要还是以香豆素类、黄酮类为主，与根茎部位差异较大的是种子部分含有较多的生物碱类化合物。因此选取了异欧前胡素(1)、珊瑚菜内酯(2)、异戊烯基伞形花内酯(O-prenyl-umbelliferone)(3)、水合氧化前胡素(4)、香叶木素(5)、佛手柑内酯(6)、(-)-氧化前胡素(7)、紫花前胡苷(8)、佛手酚-O-β-D-葡萄糖苷(9)、伞形花内酯(10)、阿拉善苷C(alaschanioside C)(11)和犬尿喹酸(12)这12个含量较大并具有生物活性的化合物作为特征对照品，结构如图2所示，并测定了这12个化合物在68个羌活和宽叶羌活种子样品中的含量。 

通过分离得到这12个对照品，经4大光谱(UV、M S、¹H-NMR、¹³C-NMR)分析，与文献化学光谱数据查对确定结构。HPLC检测12个对照品质量分数为98％以上。 

利用本发明进行鉴别的具体过程如下： 

(1)选取不同来源的羌活和宽叶羌活种子共68份，见表1。其中1-37号为37份不同来源的羌活种子，37-68号为31份不同来源的宽叶羌活种子。取种子样品用毛刷刷净泥土，放入烘箱，40℃恒温烘干至恒重，去种皮，粉碎，过60目筛，将样品包装好后放于恒温烘箱或干燥器内保存，用于高效液相色谱电喷雾质谱联用仪测定。

表1两种羌活种子的种质来源、采收时间和目数大小 

(2)配制特征对照品溶液

用千分之一的分析天平分别精密称取12种特征对照品5mg，加入甲醇5ml，分别置于5mL容量瓶中，溶解并稀释至刻度，摇匀，分别配制成12种特征对照品的溶液；

然后，分别精密吸取以上12种特征对照品溶液各20μL注入高效液相色谱电喷雾质谱联用仪，采用高效液相色谱电喷雾质谱法对12种特征对照品溶液进行测定，得到12种特征对照品的高效液相色谱电喷雾色谱图。

(3)采用高效液相色谱电喷雾质谱法对已知的不同来源的羌活种子和宽叶种子样品进行定性定量分析，建立已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图，其建立具体过程可以采用以下多个实施方式实现，并不局限于以下几种方式。 

第一种： 

建立已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图，其建立具体过程如下：

首先，将已知来源羌活种子和宽叶羌活种子按照20目粉碎，精密称取适量，浸泡在浓度为50％的甲醇中，得到每20mL甲醇含0.5g的供试样品溶液10ml，超声提取20min，过滤得第一次滤渣，第一次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取20min，过滤得第二次 滤渣，第二次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取20min，合并滤液，减压浓缩，定容到10ml容量瓶中，取2mL样品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，配制完成；

然后，精密吸取供试样品溶液20μL，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行测定，得到供试样品的高效液相色谱电喷雾质谱图。

仪器及试剂： 

Finnigan LCQ^DECA型液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技有限公司)；分析天平MettlerAE240(梅特勒-托利多仪器公司)；KH3200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor R-114)；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q高纯水(Millipore Corp.)；冰醋酸为分析纯(四川德阳化学试剂厂)。

仪器条件： 

色谱柱：依利特Hypersil C18，5μm，250mm×4.6mm；流动相条件：甲醇和0.1％乙酸水溶液梯度洗脱。

梯度洗脱过程为： 

初始为0分钟时，甲醇比例为35％；经过10min后(即在0-10min内)，甲醇比例由35％升到40％；再经过10min后(即10-20min内)，甲醇比例由40％升到55％；再经过25min后(即20-45min内)，甲醇比例由55％升到75％；甲醇比例为75％时，保持5min(即45-50min内)；再经过5min后(即50-55min内)，甲醇比例由75％升到87.5％；所述比例均为体积比。

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱柱温：20℃；检测波长：220nm和300nm；流速：0.7mL/min；进样量：20μL； 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的质谱ESI源电压：2.5kV；正、负离子检测；以氮气作为鞘气，流速：20au；辅助气为N₂，流速：10au；毛细管温度：280℃；毛细管电压：±3V；扫描范围：m/z 50～2000。

第二种： 

建立已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图，其建立具体过程如下：

首先，将已知来源羌活种子和宽叶羌活种子按照40目粉碎，精密称取适量，浸泡在浓度为60％的甲醇中，得到每20mL甲醇含0.5g的供试样品溶液15ml，超声提取30min，过滤得第一次滤渣，第一次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取30min，过滤得第二次 滤渣，第二次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取30min，合并滤液，减压浓缩，定容到20mL容量瓶中，取2mL样品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，配制完成；

然后，精密吸取供试样品溶液20μL，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行测定，得到供试样品的高效液相色谱电喷雾质谱图。

仪器及试剂： 

Finnigan LCQ^DECA型液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技有限公司)；分析天平MettlerAE240(梅特勒-托利多仪器公司)；KH3200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor R-114)；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q高纯水(Millipore Corp.)；冰醋酸为分析纯(四川德阳化学试剂厂)。

仪器条件： 

色谱柱：Agilent Zorbax SB-Aq C18(5μm，150mm×3.0mm)；流动相条件：甲醇和0.2％乙酸水溶液梯度洗脱。

梯度洗脱过程为： 

初始为0分钟时，甲醇比例为30％；经过10min后(即在0-10min内)，甲醇比例由30％升到40％；再经过10min后(即10-20min内)，甲醇比例由40％升到60％；再经过25min后(即20-45min内)，甲醇比例由60％升到75％；甲醇比例为75％时，保持5min(即45-50min内)；再经过5min后(即50-55min内)，甲醇比例由75％升到90％；所述比例均为体积比。

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱柱温：30℃；检测波长：230nm和280nm；流速：0.8mL/min；进样量：20μL； 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的质谱ESI源电压：3.5kV；正、负离子检测；以氮气作为鞘气，流速：60au；辅助气为N₂，流速：25au；毛细管温度：300℃；毛细管电压：±4.5V；扫描范围：m/z 50～2000。

第三种： 

首先，将已知来源羌活种子和宽叶羌活种子按照60目粉碎，精密称取适量，浸泡在浓度为70％的甲醇中，得到每20mL甲醇含0.5g的供试样品溶液20ml，超声提取30min，过滤得第一次滤渣，第一次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取30min，过滤得第二次滤渣，第二次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取30min，合并滤液，减压浓缩，定容到25mL容量瓶中，取2mL样品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，配制完成； 

然后，精密吸取供试样品溶液20μL，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行测定，得到供试样品的高效液相色谱电喷雾质谱图。

仪器及试剂： 

Finnigan LCQ^DECA型液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技有限公司)；分析天平MettlerAE240(梅特勒-托利多仪器公司)；KH3200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor R-114)；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q高纯水(Millipore Corp.)；冰醋酸为分析纯(四川德阳化学试剂厂)。

仪器条件： 

色谱柱：TIANHE kromasil C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相条件：甲醇和0.1％乙酸水溶液梯度洗脱。

梯度洗脱过程为： 

初始为0分钟时，甲醇比例为35％；经过10min后(即在0-10min内)，甲醇比例由35％升到40％；再经过10min后(即10-20min内)，甲醇比例由40％升到55％；再经过25min后(即20-45min内)，甲醇比例由55％升到75％；甲醇比例为75％时，保持5min(即45-50min内)；再经过5min后(即50-55min内)，甲醇比例由75％升到87.5％；所述比例均为体积比。

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱柱温：35℃；检测波长：240nm和330nm；流速：0.7mL/min；进样量：20μL； 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的质谱ESI源电压：3.5kV；正、负离子检测；以氮气作为鞘气，流速：80au；辅助气为N₂，流速：15au；毛细管温度：300℃；毛细管电压：±5V；扫描范围：m/z 50～2000。

第四种： 

建立已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图，其建立具体过程如下：

首先，将已知来源羌活种子和宽叶羌活种子按照50目粉碎，精密称取适量，浸泡在浓度为65％的甲醇中，得到每20mL甲醇含0.5g的供试样品溶液50ml，超声提取40min，过滤得第一次滤渣，第一次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取40min，过滤得第二次滤渣，第二次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取40min，合并滤液，减压浓缩，定容到75mL容量瓶中，取2mL样品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，配制完成； 

然后，精密吸取供试样品溶液20μL，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行测定，得到供试样品的高效液相色谱电喷雾质谱图。

仪器及试剂： 

Finnigan LCQ^DECA型液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技有限公司)；分析天平MettlerAE240(梅特勒-托利多仪器公司)；KH3200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor R-114)；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q高纯水(Millipore Corp.)；冰醋酸为分析纯(四川德阳化学试剂厂)。

仪器条件： 

色谱柱：AichromBond-AQ C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相条件：甲醇和0.1％甲酸水溶液梯度洗脱。

梯度洗脱过程为： 

初始为0分钟时，甲醇比例为25％；经过10min后(即在0-10min内)，甲醇比例由25％升到35％；再经过10min后(即10-20min内)，甲醇比例由35％升到50％；再经过25min后(即20-45min内)，甲醇比例由50％升到70％；甲醇比例为70％时，保持5min(即45-50min内)；再经过5min后(即50-55min内)，甲醇比例由70％升到85％；所述比例均为体积比。

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱柱温：35℃；检测波长：240nm和340nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL； 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的质谱ESI源电压：4kV；正、负离子检测；以氮气作为鞘气，流速：60au；辅助气为N₂，流速：25au；毛细管温度：320℃)；毛细管电压：±6V；扫描范围：m/z 50～2000。

第五种： 

建立已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图，其建立具体过程如下：

首先，将已知来源羌活种子和宽叶羌活种子按照80目粉碎，精密称取适量，浸泡在浓度为85％的甲醇中，得到每20mL甲醇含0.5g的供试样品溶液20ml，超声提取60min，过滤得第一次滤渣，第一次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取60min，过滤得第二次滤渣，第二次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取60min，合并滤液，减压浓缩，定容到25mL容量瓶中，取2mL样品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，配制完成； 

然后，精密吸取供试样品溶液20μL，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行测定，得到供试样品的高效液相色谱电喷雾质谱图。

仪器及试剂： 

Finnigan LCQ^DECA型液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技有限公司)；分析天平MettlerAE240(梅特勒-托利多仪器公司)；KH3200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor R-114)；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q高纯水(Millipore Corp.)；冰醋酸为分析纯(四川德阳化学试剂厂)。

仪器条件： 

色谱柱：Inertsil ODS-3C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相条件：甲醇和0.2％甲酸水溶液梯度洗脱。

梯度洗脱过程为： 

初始为0分钟时，甲醇比例为30％；经过10min后(即在0-10min内)，甲醇比例由30％升到40％；再经过10min后(即10-20min内)，甲醇比例由40％升到60％；再经过20min后(即20-40min内)，甲醇比例由60％升到75％；甲醇比例为75％时，保持10min(即40-50min内)；再经过5min后(即50-55min内)，甲醇比例由75％升到90％；所述比例均为体积比。

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱柱温：30℃；检测波长：220nm和280nm；流速：0.9mL/min；进样量：20μL； 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的质谱ESI源电压：3kV；正、负离子检测；以氮气作为鞘气，流速：70au；辅助气为N₂，流速：35au；毛细管温度：310℃；毛细管电压：±3.5V；扫描范围：m/z 50～2000。

第六种： 

建立已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图，其建立具体过程如下：

首先，将已知来源羌活种子和宽叶羌活种子按照90目粉碎，精密称取适量，浸泡在浓度为100％)的甲醇中，得到每20mL甲醇含0.5g的供试样品溶液50ml，超声提取50min，过滤得第一次滤渣，第一次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取50min，过滤得第二次滤渣，第二次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取50min，合并滤液，减压浓缩，定容到100ml容量瓶中，取2mL样品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，配制完成； 

然后，精密吸取供试样品溶液20μL，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行测定，得到供试样品的高效液相色谱电喷雾质谱图。

仪器及试剂： 

Finnigan LCQ^DECA型液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技有限公司)；分析天平MettlerAE240(梅特勒-托利多仪器公司)；KH3200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor R-114)；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q高纯水(Millipore Corp.)；冰醋酸为分析纯(四川德阳化学试剂厂)。

仪器条件： 

色谱柱：AichromBond-AQ C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相条件：甲醇和0.3％乙酸水溶液梯度洗脱。

梯度洗脱过程为： 

初始为0分钟时，甲醇比例为30％；经过10min后(即在0-10min内)，甲醇比例由30％升到45％；再经过10min后(即10-20min内)，甲醇比例由45％升到60％；再经过25min后(即20-45min内)，甲醇比例由60％升到80％；甲醇比例为80％时，保持5min(即45-50min内)；再经过5min后(即50-55min内)，甲醇比例由80％升到90％；所述比例均为体积比。

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱柱温：30℃；检测波长：230nm和260nm；流速：0.8mL/min；进样量：20μL； 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的质谱ESI源电压：3.5kV；正、负离子检测；以氮气作为鞘气，流速：70au；辅助气为N₂，流速：35au；毛细管温度：320℃；毛细管电压：±5.5V；扫描范围：m/z 50～2000。

第七种： 

建立已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图，其建立具体过程如下：

首先，将已知来源羌活种子和宽叶羌活种子按照90目粉碎，精密称取适量，浸泡在浓度为65％的甲醇中，得到每20mL甲醇含0.5g的供试样品溶液25ml，超声提取35min，过滤得第一次滤渣，第一次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取35min，过滤得第二次滤渣，第二次滤渣继续加入同样体积同样浓度的甲醇，超声提取35min，合并滤液，减压浓缩，定容到30mL容量瓶中，取2mL样品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，配制完成； 

然后，精密吸取供试样品溶液20μL，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行测定，得到供试样品的高效液相色谱电喷雾质谱图。

仪器及试剂： 

Finnigan LCQ^DECA型液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技有限公司)；分析天平MettlerAE240(梅特勒-托利多仪器公司)；KH3200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Buchi Rotavapor R-114)；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q高纯水(Millipore Corp.)；冰醋酸为分析纯(四川德阳化学试剂厂)。

仪器条件： 

色谱柱：依利特Hypersil C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相条件：甲醇和0.1％磷酸水溶液梯度洗脱。

梯度洗脱过程为： 

初始为0分钟时，甲醇比例为30％；经过10min后(即在0-10min内)，甲醇比例由30％升到40％；再经过10min后(即10-20min内)，甲醇比例由40％升到55％；再经过25min后(即20-45min内)，甲醇比例由55％升到70％；甲醇比例为70％时，保持5min(即45-50min内)；再经过5min后(即50-55min内)，甲醇比例由70％升到85％；所述比例均为体积比。

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的色谱柱柱温：30℃；检测波长：230nm和320nm；流速：0.8mL/min；进样量：20μL； 

所述高效液相色谱电喷雾质谱法采用的质谱ESI源电压：3.5kV；正、负离子检测；以氮气作为鞘气，流速：60au；辅助气为N₂，流速：20au；毛细管温度：300℃；毛细管电压：±6V；扫描范围：m/z 50～2000。

当上述已知来源羌活种子和宽叶羌活种子的高效液相色谱电喷雾质谱图建立好以后，精密依次吸取混合对照品储备液8个不同质量浓度进行HPLC分析，在上述色谱条件下检测峰面积，同一质量浓度连续测定3次，12种成分均以质量浓度为横坐标(X)，平均峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，相关系数与线性范围见表2对照品储备液继续稀释，分别在信噪比为3和10时得到检测限(LOD)和定量限(LOQ)，相应的数据见表2。 

表2标准品1-12的标准曲线方程、相关系数、线性范围、最低检测限(LOD)和最低检测量(LOQ) 

精密度试验：

日内精密度试验：在上述色谱条件下，将样品Nf239-8mu的供试品溶液在一天内共测定6次，计算得各标准品的保留时间和峰面积的RSD分别在0.25-1.95％和1.01-2.85％范围内。

日间精密度试验：在上述色谱条件下，将样品Nf239-8mu的供试品溶液连续三天，每天进样两次，计算得各标准品的保留时间和峰面积的RSD分别在0.29-2.02％和1.58-2.87％范围内。 

重现性试验： 

精密称取样品Nf239-8mu粉末(60目)6份，各0.5g，按供试品操作方法平行制备，进样20μL，连续测2次，计算得各标准品的保留时间和峰面积的RSD分别在0.24-0.33％和1.15-2.41％范围内。 

稳定性试验： 

将样品Nf239-8mu的供试品溶液在室温下一天内分6个时间点：0h、2h、4h、8h、12h和24h分别进行测定，计算得各标准品的保留时间和峰面积的RSD分别在0.41-1.28％和1.54-2.98％范围内。

加样回收率试验 

精密称取样品Nf239-8mu粉末(60目)5份，各0.5g，分别加入一定量的对照品1～12，按上述提取方法和色谱条件平行提取和分析测定，被分析的对照品的总量由回归曲线求得，相应的数据见表3。加样回收率和平均标准方差由以下公式求得：

加样回收率(％)＝(对照品的总量-初始含量)/加入对照品的量*100％

相对标准偏差[RSD％]＝[标准方差(SD)/平均值(mean)]*100％

表3标准品1-12的精密度、重现性、稳定性、加样回收率实验

^*精密度、重现性、稳定性小括号中数据表示的是各对照品保留时间的RSD，

加样回收率小括号中数据表示的是各对照品峰面积的RSD。

样品测定 

精密称取不同来源的羌活种子和宽叶羌活种子粉末共68份，各0.5g，按上述供试品溶液制备，以20μL进样，测定色谱峰峰面积，根据标准曲线计算其质量分数。

(4)如图1所示，可以明显得看到12个对照品在前面所述液相色谱条件下得到了较好的分离，选取的羌活种子代表性样品(Ni101和Ni152)和宽叶羌活种子代表性样品 (Nf239-8mu和Nf228-A)也很好地说明了两者之间的差异。总体来讲，宽叶羌活种子样品含有的有效成分比羌活种子样品要多，含量要大。异欧前胡素(1)、香叶木素(5)、紫花前胡苷(8)、佛手酚-O-β-D-葡萄糖苷(9)、阿拉善苷C(alaschanioside C)(11)为两者共有成分，珊瑚菜内酯(2)、异戊烯基伞形花内酯(O-prenyl-umbelliferone)(3)、佛手柑内酯(6)、(-)-氧化前胡素(7)和伞形花内酯(10)在宽叶羌活种子样品中含量较大，而羌活种子中水合氧化前胡素(4)和犬尿喹酸(12)含量比宽叶羌活种子大。 

接下来采用上述的仪器方法和条件，分别对混标溶液、Ni152和Nf239-8mu进行高效液相色谱电喷雾质谱联用分析，质谱采用正负离子交替采集模式。通过正、负离子准分子离子峰的相互印证，确定其相应化合物的分子量，再根据我们实验室对这两种药材样品的分离鉴定结果并参考文献报道，从样品Ni152和Nf239-8mu分别鉴定了8和13个化合物，相应的结果见表4。 

表4在线HPLC-DAD-ESI-MS检测到的准分子离子峰 

(5)为了更加直观的区分两种羌活种子，采用SIMCA模式识别法(UMETRICS公司的SIMCA-P 11.5版本)对羌活种子和宽叶羌活种子进行主成分分析，以实现对两者的智能识 别。

先用已知的两种羌活种子样本作为训练集，在模型建立阶段对相关参数进行摸索调整，以达到样品之间的最佳分类效果，再用验证集对所建模型进行检验，如果所建模型对训练集和验证集均有较好的区分效果，则所建模型成功，可用于对未知样本进行分析和预测。我们把高效液相色谱电喷雾质谱定性定量数据导入SIMCA-P软件中，在Favorite下调用t[1]/t[2]Scatter Plot进行PCA分析，得到图3，接着在Plot/List菜单下调用Scatter 3DPlots，得到如图4所示的标准主成分分析模型。结果显示羌活和宽叶羌活种子样品的聚类结果比较理想，两者之间各自聚到一起，没有样品重叠，互不干扰、所建模型较好。 

标准主成分分析模型建好后，需要对其进行进一步的模型诊断，即求出每种羌活种子的识别率和拒绝率。所谓识别率就是考察某类样品有多少落在该类模型的范围中；而拒绝率就是考察某类样品模型对于不属于该类的其他样品的拒绝程度，即其他样品是否都落在该类模型的范围外。当这两个值都为100％时，表明这两类物质之间差异很大，可以完全分开。羌活种子和宽叶羌活种子各自识别率和拒绝率如表5所示，结果说明所建模型较为成功，误差率较小。 

表5两种羌活种子的拒绝率和识别率 

  Name(seeds)   Recognition rate％   Rejection rate％   N.incisum   100(0/37)   100(37/37)   N.franchetii   94(2/31)   100(31/31)

为了从化学成分上区别羌活和宽叶羌活种子，我们对两者进行了化学成分的分离和鉴定并建立了高效液相色谱电喷雾质谱联用分析方法对两者进行定性定量分析。通过主成分分析可以看出，两种羌活种子样品明显地聚成两类，其中羌活种子样品1-37聚为一类，宽叶羌活种子38-68聚为另一类，两者互不干扰。采用SIMCA模式识别法所建的模型对羌活和宽叶羌活种子的识别率分别达到了100％和94％，拒绝率均为100％。

选取6个待测样品(No.009、072、076、096、126和129)，采用高效液相色谱电喷雾质谱法进行定性定量分析，将分析得到的定性定量数据与标准主成分分析模型进行比对，结果显示：待测样品No.009、072、076和096归为羌活种子一组，No.126和129归为宽叶羌活种子一组。待测样品检验结果与样品幼苗鉴定法的结果(即真实品种)吻合，判别准确率为100％，说明该方法具有较好的实用价值，可用于未知样品的检测。