一种检测水产品中4-己基间苯二酚残留量的试剂盒及其检测方法

摘要

本发明提供了一种检测水产品中4-己基间苯二酚残留量的试剂盒，包括样品提取溶剂乙酸乙酯和净化溶剂甲醇-乙腈-水溶液和乙腈饱和正己烷溶液，甲醇、乙腈、水的体积比为1∶2∶1，甲醇-乙腈-水溶液与乙腈饱和正己烷溶液的使用体积比为1∶1。本发明还提供了一种检测4-己基间苯二酚残留量的方法：(1)样品提取；(2)净化；(3)液相色谱测定。本试剂盒采用乙酸乙酯作为样品提取溶剂，杂质峰少，更易蒸发浓缩；采用液液分配净化，具有较好的回收率及净化效果；采用液相色谱荧光检测器测定，外标法定量，达到高选择性、高灵敏度的效果，广泛应用于虾、鱼和蟹等水产品中4-己基间苯二酚残留量的测定。

说明书

技术领域

本发明涉及化学物质的理化分析领域，具体涉及一种检测水产品中4-己基间苯二酚残留 量的试剂盒及其检测方法。

背景技术

4-己基间苯二酚(4-Hexylresorcinol，4-HR)，别名2，4-二羟基己基苯、己雷锁辛、4-HR， CAS号位133-77-6，4-己基间苯二酚药物结构式如下所示：

4-己基间苯二酚为白色或黄白色针状结晶，有弱臭，强涩味；遇光、空气变淡棕或粉红 色，微溶于水、乙醇、甲醇、甘油、醚、氯仿、苯和植物油中。4-己基间苯二酚是一种能抑 制褐变的新型抗氧护色剂。用于保持虾、蟹等甲壳水产品在贮存过程中色泽良好不变黑(虾 类黑变主要是机体存在的多酚氧化酶催化反应所致)。实验表明4-己基间苯二酚可通过抑制 多分氧化酶活性控制褐变延长贮存期。

我国GB 2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》规定，4-己基间苯二酚的使用限量，可 按生产需要适量用于防止虾类褐变，但其最大残留限量MRL(maximum required limits)值应小 于1mg/kg。欧盟95/2/EC指令中规定在甲壳类中作为抗氧化剂使用，其MRL为2mg/kg。联 合国FAO/WHO所属JECFA于1995年第44次会议上，4-己基间苯二酚被批准使用，其规定 对甲壳类处理浓度可达50mg/L，食用部分的MRL为1mg/kg。

目前4-己基间苯二酚残留的检测方法主要有液相色谱法。但存在很多不足之处：比如： 4-己基间苯二酚易溶于乙醇、甲醇、甘油、醚、氯仿、苯和植物油中，采用甲醇、乙醇提取 的杂质太多，特别是极性强的杂质；选用甲醇作为提取溶剂后需经C₁₈柱净化；因此，为得到 较好的回收率，需要选择合适的提取溶剂。同时也需要选择合适的净化溶剂以达到理想的净 化效果。

为满足国内外对水产品中4-己基间苯二酚残留量测定的需求，需要对上述样品前处理条 件和色谱分析条件进行优化，建立一种高选择性、高灵敏度测定水产品中4-己基间苯二酚残 留量的液相色谱-荧光方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种检测水产品中4-己基间苯二酚残留 量的试剂盒，可达到高选择性、高灵敏度的效果，广泛应用于虾、鱼和蟹等进出口水产品中 4-己基间苯二酚残留量的测定。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明的一种检测水产品中4-己基间苯二酚残留量的试剂盒，包括样品提取溶剂和净化 溶剂，所述提取溶剂为乙酸乙酯，所述净化溶剂为甲醇-乙腈-水溶液和乙腈饱和正己烷溶液。

优选的，所述甲醇-乙腈-水溶液中的甲醇、乙腈、水的体积比为1∶2∶1。

所述甲醇-乙腈-水溶液与所述乙腈饱和正己烷溶液的使用体积比为1∶1。

本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒对水产品中4-己基间苯二酚残留量进行检测的 方法，具体步骤按如下进行：

(1)样品提取：称取样品于离心管中，加入提取溶剂乙酸乙酯和无水硫酸钠，匀质，离 心，上清液过无水硫酸钠转移到浓缩瓶中，另取一支离心管，加入提取溶剂乙酸乙酯15mL洗 涤匀质器刀头，洗涤液移入第一支离心管中，于涡旋振荡器振荡提取，离心，合并洗涤液于 100mL浓缩瓶中，38℃旋转蒸发浓缩至干，所述样品：提取溶剂：无水硫酸钠的质量体积质 量比为1∶10∶1.5；

(2)净化：步骤(1)中的残渣加入净化溶剂甲醇-乙腈-水溶液溶解，所述甲醇-乙腈- 水溶液中各组分体积比为1∶2∶1，超声波水浴，涡旋振荡，加入净化溶剂乙腈饱和正己烷脱 脂，涡旋，转移入离心管中，离心，弃正己烷层，重复操作一次，下层过滤膜，供高效液相 色谱测定，所述净化溶剂中甲醇-乙腈-水溶液、乙腈饱和正己烷的质量体积比为1∶1；

(3)液相色谱测定：色谱条件如下：

a)色谱柱：Agilent TC C₁₈ 250mm×4.6mm(i.d.)，5μm，或相当者；

b)流动相：乙腈-水溶液(75+25，V/V)；

c)流速：1.0mL/min；

d)检测波长：激发波长276nm；发射波长307nm；

e)柱温：30℃；

f)进样量：10μL；

(4)结果计算。

优选的，所述步骤(1)中的匀质时间为30s，离心条件为4000r/min，离心3min。

优选的，所述步骤(2)中的水浴时间为10s，涡旋30s，滤膜为0.20μm的滤膜。

所述步骤中的(4)结果计算可用数据处理软件或按下式计算试样中4-己基间苯二酚残留 量：

$X=\frac{A\times C\times V\times 1000}{\mathrm{As}\times m\times 1000}$

式中：

X——试样中待测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

A——样液中待测组分峰面积；

C——标准工作液中待测组分的浓度，单位为毫克每升(mg//L)；

V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

As——标准工作液中待测组分峰面积；

m——最终样液代表的试样质量，单位为克(g)。

注：计算结果需扣除空白值。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本水产品中4-己基间苯二酚残留量的测定试剂 盒采用乙酸乙酯作为样品提取溶剂，比甲醇、乙腈提取得杂质峰少，而且乙酸乙酯的沸点低， 更容易蒸发浓缩；采用甲醇-乙腈-水(1∶2∶1)与乙腈饱和正己烷溶液(1∶1)进行液液分配 净化，既有好的回收率，同时可以达到理想的净化效果。同时，检测仪器采用液相色谱荧光 检测器测定，外标法定量，达到高选择性、高灵敏度的效果，能广泛应用于虾、鱼和蟹等水 产品中4-己基间苯二酚残留量的测定。

附图说明

图1是虾样品乙腈提取的液相色谱图；

图2是虾样品甲醇提取的液相色谱图；

图3是虾样品乙酸乙酯提取的液相色谱图；

图4是4-己基间苯二酚标准物质的液相色谱图(0.1mg/L)；

图5是虾空白样品的液相色谱图；

图6是虾空白样品加标的液相色谱图(0.1mg/kg)；

图7是蟹空白样品的液相色谱图；

图8是蟹空白样品加标的液相色谱图(0.1mg/kg)；

图9是鱼空白样品的液相色谱图；

图10是鱼空白样品加标的液相色谱图(0.1mg/kg)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1：本发明的水产品中4-己基间苯二酚残留量的检测试剂盒

本发明的试剂盒的组成部分包括样品提取溶剂和净化溶剂，提取溶剂为乙酸乙酯，净化 溶剂为甲醇-乙腈-水溶液和乙腈饱和正己烷溶液。甲醇-乙腈-水溶液中的甲醇、乙腈、水的 体积比为1∶2∶1。使用该试剂盒进行4-己基间苯二酚残留量的检测时，甲醇-乙腈-水溶液的 使用体积与乙腈饱和正己烷溶液的使用体积比为1∶1。

实施例2：用本发明的试剂盒检测水产品中4-己基间苯二酚残留量的方法

用本发明的试剂盒检测水产品中4-己基间苯二酚残留量，按如下步骤进行：

(1)样品提取：称取试样2g(精确到0.01g)于50mL离心管中，加入提取溶剂乙酸乙酯 20mL和3g无水硫酸钠，匀质30s，4000r/min离心3min，上清液过无水硫酸钠转移到浓缩瓶 中，另取一支离心管，加入提取溶剂乙酸乙酯15mL洗涤匀质器刀头，洗涤液移入第一支离心 管中，于涡旋振荡器振荡提取1min，4000r/min离心3min，合并洗涤液于100mL浓缩瓶中， 38℃旋转蒸发浓缩至干。

(2)净化：上述残渣立即加入2.0mL净化溶剂一甲醇-乙腈-水溶液(1+2+1，V/V/V)溶解， 超声波水浴10s，涡旋振荡30s，加入2.0mL净化溶剂二乙腈饱和正己烷脱脂，涡旋30s，转 移入15mL离心管中，4000r/min离心3min，弃正己烷层，重复操作一次，下层过0.20μm滤 膜，供高效液相色谱测定。

(3)液相色谱测定：色谱条件如下：

a)色谱柱：250mm×4.6mm(i.d.)，5μm，或相当者；

b)流动相：乙腈-水溶液(75+25，V/V)；

c)流速：1.0mL/min；

d)检测波长：激发波长276nm；发射波长307nm；

e)柱温：30℃；

f)进样量：10μL。

色谱测定时，根据样液中待测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作溶液进行色谱 分析，标准工作溶液和待测样液中的响应值均应在仪器线性范围内。对标准工作溶液和样液 等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，4-己基间苯二酚的保留时间约为5.0min。

同时设置空白试验，即除不加试样外，均按上述测定步骤进行。

(4)结果计算和表述

用数据处理软件或按下式计算试样中4-己基间苯二酚残留量

$X=\frac{A\times C\times V\times 1000}{\mathrm{As}\times m\times 1000}$

式中：

X——试样中待测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

A——样液中待测组分峰面积；

C——标准工作液中待测组分的浓度，单位为毫克每升(mg//L)；

V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

As——标准工作液中待测组分峰面积；

m——最终样液代表的试样质量，单位为克(g)。

注：计算结果需扣除空白值。

实施例3：本试剂盒与其他试剂盒的比较实验

(1)样品提取液的选择实验

本实验采用甲醇、乙腈和乙酸乙酯提取，具体步骤按照实施例2中进行。实验表明三者 均有满意的回收率，但甲醇、乙腈提取得杂质峰较乙酸乙酯多，各溶剂提取虾样品的液相色 谱参见图1-3，图1是虾样品乙腈提取的液相色谱图，图2是虾样品甲醇提取的液相色谱图，图 3是虾样品乙酸乙酯提取的液相色谱图；各溶剂提取的回收率参见表1。乙酸乙酯的沸点低， 更容易蒸发浓缩，可以缩短实验时间，因此本实验选用乙酸乙酯作为提取溶剂，较其它方法 具有提取杂质少，样品处理时间短的优点。

(2)净化条件的选择

样品的乙酸乙酯萃取液中含有类脂物，需净化。实验不同的液液萃取回收率和净化效果。 具体步骤按照实施例3中进行。试验采用乙腈-正己烷(1+1)，80％乙腈水溶液-正己烷(1+1) 液液分配脱脂，试验表明4-己基间苯二酚的回收率理想，对于草虾、公蟹净化效果较理想， 对于色素高的膏蟹不太理想，经脱脂后，水相仍存在较深的颜色。为达到更好的净化效果， 考虑改变液液萃取水相的极性，采用极性较强的甲醇水溶液来脱脂，分别试验50％甲醇水溶 液-正己烷(1+1)，60％甲醇水溶液-正己烷(1+1)，70％甲醇水溶液-正己烷(1+1)液液分配 脱脂，试验表明在标准溶液的脱脂实验中4-己基间苯二酚回收率大于95％，但在样品基质的 回收率小于80％，可能是样品基质中含极性低油溶性物质，改变了4-己基间苯二酚在水油两 相的分配比例，导致回收率不太理想，但是采用甲醇-水体系脱脂，样品的净化后，下层水相 几乎澄清透明，表明样品基质中色素为弱极性的物质，溶于上层的正己烷层别除去。兼顾以 上试验，我们考虑调整液液萃取水相的极性，使水相极性介于乙腈-水和甲醇-水之间，那么 既有好的回收率，同时可以达到理想的净化效果，实验采用甲醇-乙腈-水体系脱脂，试验表 明甲醇-乙腈-水(1+2+1)、甲醇-乙腈-水(2+1+1)混合溶液和正己烷脱脂，均能达到理想的 净化效果和回收率高，反复试验表明甲醇-乙腈-水(1+2+1)的回收率高且稳定，所以本发明 的试剂盒最终采用甲醇-乙腈-水(1+2+1)与正己烷溶液(1∶1)进行液液分配净化。不同提 取净化条件的选择的实验结果见表1。

表1

实施例4：测定试剂盒的检测低限

用水配成0.10mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L的4-己基间苯二酚标准 工作液。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，峰面积法定量。在实施例2所述色谱 条件下，4-己基间苯二酚的保留时间约5.0min，标准物质的色谱图参见图4，图4是4-己基 间苯二酚(4-HR)标准的液相色谱图(0.1mg/L)，线性方程Y＝3.61E+06X+1.97E+04，相关系 数为0.999。

本试剂盒的4-己基间苯二酚的测定低限(LOQ)为0.10mg/kg。

实施例5：本试剂盒回收率的测定

按照实施例2所述方法，用不含4-己基间苯二酚的虾和蟹样品进行添加回收和精密度实 验，各基质空白和添加测定低限水平的液相色谱见图5～图10，图5是虾空白样品的液相色 谱图，图6是虾空白样品加标的液相色谱图(0.1mg/kg)，图7是蟹空白样品的液相色谱图， 图8是蟹样品加标的液相色谱图(0.1mg/kg)，图9是鱼空白样品的液相色谱图，图10是鱼 样品加标的液相色谱图(0.1mg/kg)。本试剂盒测定水产品中4-己基间苯二酚残留量室内的添 加回收率和精密度实验结果见表2。由表2可见，虾中4-己基间苯二酚在添加水平0.10～ 1.0mg/kg，其平均回收率在93.9～97.3％，相对标准偏差在2.61～4.35％之间；蟹中4-己基 间苯二酚在添加水平0.10～1.0mg/kg，其平均回收率在94.4～96.6％，相对标准偏差在2.39～ 4.75％之间；鱼中4-己基间苯二酚在添加水平0.10～1.0mg/kg，其平均回收率在93.2～95.3％， 相对标准偏差在3.56～6.74％之间；本试剂盒符合SN/T 0005-1996《出口商品中农药、兽药 残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》对回收率和精密度的要求。

表2

本试剂盒经深圳出入境检验检疫局、珠海出入境检验检疫局、广东省农业科学院植物保 护研究所、广东省疾病预防控制中心、广州市质量监督检测研究院等五个实验室验证进行室 间重复性验证。样品添加0.10～1.0mg/kg，测定结果见表3，表3为样品中4-己基间苯二酚室 间添加回收率和精密度实验结果。

表3

从表3中可见：虾中4-己基间苯二酚在添加水平0.10～1.0mg/kg，其平均回收率在89.6～ 93.1％，相对标准偏差在5.25～7.25％之间；蟹中4-己基间苯二酚在添加水平0.10～1.0mg/kg， 其平均回收率在88.8～93.2％，相对标准偏差在4.15～5.80％之间。本标准经五家实验室验证， 方法的回收率、精密度均符合SN/T 0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检 验方法标准编写的基本规定》技术要求。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式中的一种，本领域的技术人员在 本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。