一种抑制水牛膜分化抗原14 基因表达的小核糖核酸分子

摘要

本发明的一种抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子，通过建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白的人胚肾293细胞系，合成不同小核糖核酸分子，并转染人胚肾293细胞系稳定细胞系；通过荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白表达的荧光强度，流式细胞术检测其蛋白表达水平，蛋白质印迹鉴定其干扰效果，筛选出能高效抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子。本发明为进一步应用核糖核酸干扰技术通过抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14的表达，增强水牛抵抗革兰氏阴性菌感染的能力奠定了重要基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的基因表达、核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)干扰和检测技术领域，具体涉及一种抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子，本发明还涉及该种抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子的生物学筛选方法。 

背景技术

白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen，CD14)是一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的分化抗原，为体内介导脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)生物效应的重要受体之一。白细胞分化抗原14(CD14)包括膜结合型白细胞分化抗原14(membrane bound CD14，mCD14)和可溶性白细胞分化抗原14(soluble CD14，sCD14)两种形式：膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)是分子量为55千道尔顿(KD)的糖蛋白，其C-末端借助糖基磷酯酰肌醇(glucose phosphatidylinositol，GPI)结构锚附于细胞膜表面；可溶性白细胞分化抗原14(sCD14)分子有49KD和55KD两种形式，缺乏糖基磷酯酰肌醇(GPI)锚。膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)是由含有白细胞分化抗原14(CD14)基因的单核细胞、巨噬细胞，自行转录、翻译蛋白质多肽链，在高尔基复合体内糖化后，其羧基端再与磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)结合，并由磷酯酰肌醇的磷脂部分与细胞膜连接。生理条件下，膜结合型白细胞分化抗原14(membrane bound cluster of differentiation antigen，mCD14)主要表达于成熟的单核巨噬细胞，微弱表达于中性粒细胞、肾小球膜细胞、乳房细胞和B细胞，介导脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)对这些细胞的激活作用。 

内毒素是革兰氏阴性菌细胞外膜的组成部分，其主要成分为脂多糖(LPS)，脂多糖一旦进入体内，将诱导机体产生多种炎症介质的反应，导致 机体的严重损伤。在革兰氏阴性细菌引起的炎症反应过程中，脂多糖受体起着关键作用，是脂多糖作用的重要门户。白细胞分化抗原14(CD14)被认为是脂多糖信号转导中最重要的脂多糖受体，白细胞分化抗原14在介导脂多糖激活靶细胞及炎症反应中起关键作用；研究表明，通过抑制白细胞分化抗原14破坏脂多糖所激活的靶细胞炎症反应是一个可行的治疗方法。 

核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)是指由特定双链核糖核酸(double stranded RNA，dsRNA)引发同源信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)降解的转录后基因静默机制。这类特定双链核糖核酸被裂解成小(干扰)核糖核酸分子(siRNAs)，并能导致同源信使核糖核酸(mRNA)在核糖核酸诱导的静默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)作用下降解。核糖核酸干扰(RNAi，Ribonucleic acid interference)RNA是目前简单而高效地阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法之一，可达到基因敲除效果，且安全性好。但对于核糖核酸干扰(RNAi)来说，并不是所有针对靶基因信使核糖核酸(mRNA)序列随机合成的小核糖核酸分子(siRNAs)都能引起有效的基因沉默，干扰靶序列的选择对干扰效率的影响是至关重要的。因此，对能有效抑制特异基因表达的小核糖核酸分子(siRNAs)的筛选是应用核糖核酸干扰(RNAi)技术进行基因功能、基因治疗等相关研究的重要基础。 

发明内容

本发明的目的是，提供一种抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子，通过抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的表达，增强水牛抵抗革兰氏阴性菌感染的能力。 

本发明的另一目的是，提供一种抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子的生物学筛选方法。 

本发明所采用的技术方案是，一种抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子，所述的小核糖核酸分子基因序列信息是： 

正义，CGAGGUAAAUGACC UGACUTT(5’-3’)； 

反义，AGUCAGGUCAUUUACCUCGTT(5’-3’))。 

本发明所采用的另一技术方案是，一种抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子的生物学筛选方法，该方法按照以下步骤实施： 

步骤1、重组表达质粒pEGFP-mCD14的构建，具体步骤如下： 

将pEGFP-C1表达载体转化DH5a感受态细胞，取50微升菌液涂布于Luria-Bertani固体培养基上，含卡那霉素，37℃倒置培养24小时，挑取单菌落接种于3毫升Luria-Bertani培养液中，含卡那霉素，37℃振荡24小时，12000转数/分钟离心2分钟，收集菌体，小量质粒提取试剂盒提取pEGFP-C1质粒；用EcoRI和Kpn1双酶切回收纯化的聚合酶链式反应产物和pEGFP-C1表达载体，在T4DNA连接酶的作用下，将酶切后的目的片段与真核表达载体pEGFP-C1进行连接，最终获得重组表达质粒pEGFP-mCD14； 

步骤2、稳定表达增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白的人胚肾293细胞系的构建，具体步骤如下： 

人胚肾293细胞在含10％体积分数胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培养基中，于37℃、5％体积分数二氧化碳的饱和湿度下培养；按照转染试剂操作说明书将重组质粒pEGFP-mCD14的转染入人胚肾293细胞内，简述如下： 

(1)在转染的前一天，计数人胚肾293细胞并铺于6孔板中，使转染时细胞密度达到60-80％； 

(2)在转染当天，用250微升无血清的优化改良伊格氏完全培养基I分别稀释2微克EGFP-mCD14质粒和6微升转染试剂，轻轻混匀； 

(3)孵育5分钟后，将稀释的质粒和转染试剂混合，轻微混匀后于室温孵育20分钟以利于形成脱氧核糖核酸DNA-转染试剂复合物； 

(4)将脱氧核糖核酸DNA-转染试剂复合物直接加入含细胞和无双抗培养基的6孔板中，十字形轻摇以混匀； 

转染24小时后，换完全培养基培养24小时，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1∶10-20的比例稀释传代，待细胞贴壁后，在含有氨基糖苷类抗生素 500微克/毫升的选择性培养基中加压筛选，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；采用极限稀释法将克隆稀释至96孔板进行单克隆筛选，再将筛选出的单克隆扩增培养从而获得稳定表达增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白的人胚肾293细胞，对稳定细胞系进行荧光显微镜检测和Western Blot鉴定， 

通过比较，稳定表达增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白的人胚肾293细胞正确表达增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白； 

步骤3、有效抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子siRNAs的合成与合成， 

根据水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因的序列，按照小核糖核酸分子siRNAs合成的基本原则，合成四对不同的针对膜结合型白细胞分化抗原14的小核糖核酸分子siRNAs； 

步骤4、按照高效转染试剂操作说明书的方法将四对小核糖核酸分子siRNAs转染人胚肾293细胞稳定细胞系，具体步骤如下： 

(1)用900微升完全培养基将5×105个细胞铺于12孔板内； 

(2)分别用100微升无血清的Opti-MEM I培养基稀释9微升浓度为20微摩尔浓度的小核糖核酸分子siRNAs和9微升高效转染试剂转染试剂，将两者混合，充分混匀，室温放置5-10分钟； 

(3)将形成的转染复合物滴入细胞培养孔内，与人胚肾293细胞稳定细胞系混合，十字形轻摇以混匀，放入二氧化碳培养箱培养； 

(4)37℃培养24小时后，更换新鲜的含10％胎牛血清的700微升杜比克改良伊格氏完全培养基； 

步骤5、分别检测各项指标 

5.1)转染48小时后，用倒置荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白表达的荧光强度，倒置荧光显微镜，检测增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合 蛋白的蛋白表达情况， 

通过比较，其中的siRNA4小核糖核酸分子能够明显抑制增强型绿色荧光蛋白EGFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白的表达； 

5.2)转染48小时后，流式细胞术检测增强型绿色荧光蛋白GFP-水牛膜结合型白细胞分化抗原14融合蛋白的蛋白表达水平，流式细胞仪采用激发波长408nm，发射波长507nm，检测表达EGFP的细胞数量和平均荧光强度， 

通过比较，其中的siRNA4小核糖核酸分子siRNAs能够明显抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14的表达； 

5.3)转染48小时后，吸出培养液，磷酸盐缓冲液洗涤细胞层1-2次，0.125％的胰酶常规消化，收集细胞。根据细胞沉淀的情况，加入细胞裂解液50毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH为8.0，150纳摩尔浓度氯化钠，1％毫摩尔浓度的聚乙二醇辛基苯基醚，0.2％毫摩尔浓度叠氮钠，0.5％毫摩尔浓度脱氧胆酸钠，10微克/毫升抑肽酶aprotinin，1微克/毫升苯甲基磺酰氟；利用二喹林甲酸蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将总蛋白等量上样，在12％的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 

电泳完毕后进行蛋白质印迹，通过比较，其中的siRNA4小核糖核酸分子siRNAs能够明显抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14的表达， 

综上所述，找出其中显著表现出能特异且高效抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14蛋白表达的一个小核糖核酸分子siRNA。 

本发明的有益效果是，建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚肾293细胞系(HEK293)，合成干扰水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)基因表达的不同小核糖核酸分子(short interfering RNAs，siRNAs)，并转染人胚肾293细胞系稳定细胞系。通过荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白表达的荧光强度，流式细胞术检测增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的蛋白表达水平，蛋白质印迹(western blot)鉴定其干扰效果，筛选 出能高效抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)基因表达的小核糖核酸分子(siRNA)。为后续研究水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)在免疫及炎症反应中作用的分子机制和进一步应用核糖核酸干扰(RNAi)技术通过抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的表达，增强水牛抵抗革兰氏阴性菌感染的能力奠定了重要基础。 

附图说明

图1是本发明方法中的重组表达质粒pEGFP-mCD14的鉴定图，图中，从左到右标示分别是：M是指(λHindIII)；序号1和序号2是指原质粒pEGFP-CD14；序号3是指pEGFP-CD14经EcoR I和Kpn1双酶切；序号4是指pEGFP-CD14经Kpn1单酶切；序号5是指pEGFP-CD14经EcoR I单酶切；序号6是指pEGFP-CD14经BamH1单酶切2h；序号7是指pEGFP-CD14经BamH1单酶切2.5h； 

图2是本发明方法中的稳定表达水牛膜结合型白细胞分化抗原14的人胚肾293细胞系的构建示意图，其中图a是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的HEK293细胞系的荧光显微镜观察照片；图b是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系的荧光显微镜观察照片；图c是对所建立的稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系的Western blot分析； 

图3是本发明方法中的荧光显微镜观察转染小核糖核酸分子(siRNAs)后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白表达的荧光强度图， 

其中， 

图a是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系的荧光显微镜观察照片； 

图b是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染无效siRNA(scramble  siRNA)后的荧光显微镜观察照片； 

图c是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染抑制增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的siRNA(siRNA EGFP)后的荧光显微镜观察照片； 

图d是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA195(siRNA1)后的荧光显微镜观察照片； 

图e是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA 664(siRNA2)后的荧光强度分析； 

图f是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA902(siRNA3)后的荧光强度分析； 

图g是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA949(siRNA4)后的荧光强度分析； 

图4流式细胞术检测转染小核糖核酸分子(siRNAs)后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的蛋白表达水平图，其中， 

图a是HEK293细胞系的荧光强度分析； 

图b是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系的荧光强度分析； 

图c是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染无效siRNA(Scramble siRNA)后的的荧光强度分析； 

图d是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染抑制增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)表达的siRNA(siRNA EGFP)后的荧光强度分析； 

图e是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA195(siRNA1)后的荧光强度分析； 

图f是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA664(siRNA2)后的荧光强度分析； 

图g是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA902(siRNA3)后的荧光强度分析； 

图h是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA944(siRNA4)后的荧光强度分析； 

图5是蛋白质印迹(western blot)分析转染小核糖核酸分子(siRNAs)稳定细胞系的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的表达水平的结果。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。 

本发明依据一种水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)互补脱氧核糖核酸分子(cDNA)序列，该互补核糖核酸分子的基因序列(简写形式)为： 

  1 atggtgtgcg tgccctacct gttgctgctg ctgctgccgc cactgctgcg tgtgtctgcg 

 61 gacacaacag aaccctgcga gctggacgac gacgatttcc gttgtgtctg caacttcacg 

121 gatccgaagc ctgactggtc tagcgccgtt cagtgtatgg ttgccgtaga ggtggagatc 

181 agtggcggcg gccgcagcct ggaacagttt ctcaagggag ccgacaccaa cccgaagcag 

241 tatgctgaca caatcaaggc tctgcgcgtt cggcgactca agctgggcgc tgcacaggtt 

301 cctgctcagc ttctggtcgc cgttctgcgc gcgctcgggt actctcgtct caaggaacta 

361 acgcttgagg acctggaagt aaccggccca atgcccccga agcctctgga agccactggg 

 421 cctgcgttca ccaccctcag tctccgtaac gtatcgtggg caacaggagg tgcctggctc 

 481 ggcgaactgc agcagtggct caagcctggg ctcagggtgc tgaacattgc ccaagcacac 

 541 tcgcttgccc ttccgtgcgc agggctctcc accttcgagg cgctcaccac cctagacctg 

 601 tctgacaatc ccagtctcgg cgacagcggg ctgatggcag ctctctgtcc gaacaagttc 

 661 ccggccctcc aatatctagc gctacgcaac gccgggatgg agacgctgag cggagtgtgc 

 721 gcggcgctgg cggcagcgag ggtgcagccc caaagcctgg acctcagcca caactcgctg 

 781 cgcgtcaccg ccctgggcgc tacccgatgt gtctggccca gtgcactaag ctctctgaat 

 841 ttgtcgttcg ctgggctgga gcaagtgcct aagggactgc cccccaagct cagcgtgctt 

 901 gatctcagct gcaacaagct aagcagggag ccgcggcgag acgagctgcc cgaggtaaat 

 961 gacctgactc tggatggaaa tccctttctg gaccctggag ccctccagca ccaaaatgac 

1021 ccgatgatct ccggcgtggt cccagcctgt gcgcgttctg ccttgaccat gggggtgtca 

1081 ggagccctgg cgctgcttca aggagcccga ggcttcgcgt aa 

                                。 

本发明的上述的能够抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子(siRNAs)，其生物学筛选原理是，先建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚肾293细胞系(HEK293)；然后根据水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)基因的序列，合成四对不同的针对膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的小核糖核酸分子(siRNAs)、应用高效转染试剂(HiPerFect Transfection Reagent)将该四对小核糖核酸分子(siRNAs)转染该稳定细胞系；再次，通过荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的表达，流式细胞术检测增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的蛋白表达水平，蛋白质印迹(western blot)鉴定其干扰效果，筛选出能高效抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)基因表达的小核糖核酸分子(siRNA)；最后，综合这些数据，比较发现其中的一条(即第4条949号)小核糖核酸分子(siRNAs)能够明显抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的表达。 

步骤1、重组表达质粒pEGFP-mCD14的构建，具体步骤如下： 

将pEGFP-C1表达载体转化DH5a感受态细胞，取50微升(μl)菌液涂布于Luria-Bertani固体培养基上(含卡那霉素)，37℃倒置培养24小时，挑取单菌落接种于3毫升(ml)Luria-Bertani培养液中(含卡那霉素)，37℃振荡24小时，12000转数/分钟(rpm)离心2分钟，收集菌体，小量质粒提取试剂盒提取pEGFP-C1质粒；用EcoRI和Kpn1双酶切回收纯化的聚合酶链式反应(PCR)产物和pEGFP-C1表达载体，在T4DNA连接酶的作用下，将酶切后的目的片段(mCD14插入片段)与真核表达载体pEGFP-C1进行连接，最终获得重组表达质粒pEGFP-mCD14，酶切鉴定见图1，图1中的分析情况表明，pEGFP-mCD14构建正确。 

步骤2、稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚肾293细胞系(HEK293)的构建，具体步骤如下： 

人胚肾293细胞(HEK293)在含10％(体积分数)胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)中，于37℃、5％(体积分数)二氧化碳(CO₂)的饱和湿度下培养；按照转染试剂(LipofectamineTM 2000，Invitrogen，USA)操作说明书将重组质粒pEGFP-mCD14的转染入人胚肾293细胞(HEK293)内，简述如下： 

(1)在转染的前一天，计数人胚肾293细胞(HEK293)并铺于6孔板中，使转染时细胞密度达到60-80％； 

(2)在转染当天，用250微升(μl)无血清的优化改良伊格氏完全培养基I(Opti-MEM I)分别稀释2微克(μg)EGFP-mCD14质粒和6微升(μl)转染试剂(LipofectamineTM 2000，Invitrogen，USA)，轻轻混匀； 

(3)孵育5分钟后，将稀释的质粒和转染试剂(LipofectamineTM2000，Invitrogen，USA)混合，轻微混匀后于室温孵育20分钟以利于形成脱氧核糖核酸(DNA)-转染试剂(LipofectamineTM 2000，Invitrogen，USA)复合物； 

(4)将脱氧核糖核酸(DNA)-转染试剂(LipofectamineTM 2000，Invitrogen，USA)复合物直接加入含细胞和无双抗培养基的6孔板中，十字形轻摇以混匀。 

转染24小时后，换完全培养基培养24小时，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1∶10-20的比例稀释传代，待细胞贴壁后，在含有氨基糖苷类抗生素(G418，500微克/毫升)的选择性培养基中加压筛选，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；采用极限稀释法将克隆稀释至96孔板进行单克隆筛选，再将筛选出的单克隆扩增培养从而获得稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚肾293细胞(HEK293)，对稳定细胞系进行荧光显微镜检测和Western Blot鉴定，结果见图2各个分图，图2中的分析情况表明，稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚肾293细胞(HEK293)正确表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白，而对照则否，说明稳定细胞系构建正确。 

图2中，图a是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的HEK293细胞系的荧光显微镜观察照片；图b是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系的荧光显微镜观察照片；图c是对所建立的稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系的Western blot分析。 

步骤3、有效抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)基因表达的小核糖核酸分子(siRNAs)的合成与合成， 

根据水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)基因的序列，按照以下基本原则合成小核糖核酸分子(siRNAs)： 

1)GC含量30％-52％； 

2)sense链的15-19碱基中至少含有3个A/U； 

3)不含有反向重复序列； 

4)sense链的第19碱基为A； 

5)sense链的第3碱基为A； 

6)sense链的第10碱基为U； 

7)sense链的第19碱基不是G/C； 

8)sense链的第13碱基不是G， 

根据上述原则，本发明实施例中，合成了四对不同的针对膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的小核糖核酸分子(siRNAs)，由上海吉玛制药技术有限公司合成，该小核糖核酸分子(siRNAs)的保藏条件是，置于焦碳酸二乙酯(DEPC，diethypyrocarbonate)DEPC水中，-20℃保存，表1是针对水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)合成的小核糖核酸分子(siRNAs)序列， 

表1本发明实施例合成的四对小核糖核酸分子(siRNAs)序列 

步骤4、按照高效转染试剂(HiPerfect Transfection Reagent)操作说明书的方法将四对小核糖核酸分子(siRNAs)转染人胚肾293细胞(HEK293)稳定细胞系，具体步骤如下： 

(1)用900微升(μl)完全培养基将5×105个细胞铺于12孔板内； 

(2)分别用100微升(μl)无血清的Opti-MEM I培养基稀释9微升(μl)浓度为20微摩尔浓度(μM)的小核糖核酸分子(siRNAs)和9微升(μl)高效转染试剂(HiPerfect)转染试剂，将两者混合，充分混匀，室温放置5-10分钟； 

(3)将形成的转染复合物滴入细胞培养孔内，与人胚肾293细胞(HEK293)稳定细胞系混合，十字形轻摇以混匀，放入二氧化碳培养箱培养； 

(4)37℃培养24小时后，更换新鲜的含10％胎牛血清的700微升(μl)杜比克改良伊格氏完全培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)； 

步骤5、分别检测各项指标 

5.1)转染48小时后，用倒置荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白表达的荧光强度，倒置荧光显微镜，型号为：Olympus X71，Japan，检测增强型绿色荧光蛋白(EGFP)水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的蛋白表达情况，结果见图3各个分图，荧光显微镜观察表明，转染第4条(949号)小核糖核酸分子(siRNAs)稳定细胞系的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的荧光强度受到抑制。 

图3中的各个分图的显示表明： 

图a是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系的荧光显微镜观察照片； 

图b是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染无效siRNA(scramble siRNA)后的荧光显微镜观察照片； 

图c是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染抑制增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的siRNA(siRNA EGFP)后的荧光显微镜观察照片； 

图d是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA195(siRNA1)后的荧光显微镜观察照片； 

图e是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA 664(siRNA2)后的荧光强度分析； 

图f是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA902(siRNA3)后的 荧光强度分析； 

图g是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA949(siRNA4)后的荧光强度分析。 

以上数据说明，siRNA949(siRNA4)小核糖核酸分子(siRNAs)能够明显抑制增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的表达。 

5.2)转染48小时后，流式细胞术检测增强型绿色荧光蛋白(GFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的蛋白表达水平。流式细胞仪采用激发波长408nm，发射波长507nm，检测表达EGFP的细胞数量和平均荧光强度。结果见图4各个分图，图4中的流式细胞术检测表明，转染第4条(949号)小核糖核酸分子(siRNAs)稳定细胞系的表达EGFP的细胞数量和平均荧光强度受到抑制。图4中的各个分图的显示分别是： 

图a是HEK293细胞系的荧光强度分析； 

图b是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系的荧光强度分析； 

图c是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染无效siRNA(Scramble siRNA)后的的荧光强度分析； 

图d是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染抑制增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的siRNA(siRNA EGFP)后的荧光强度分析； 

图e是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA195(siRNA1)后的荧光强度分析； 

图f是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA664(siRNA2)后的 荧光强度分析； 

图g是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA902(siRNA3)后的荧光强度分析； 

图h是稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系被转染siRNA944(siRNA4)后的荧光强度分析。 

以上数据说明，siRNA949(siRNA4)小核糖核酸分子(siRNAs)能够明显抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的表达。 

图4中的各图中：X轴为测量的荧光强度，Y轴为细胞数目， 

FL1，515-545nm范围内的绿色光强度； 

Counts，细胞数。 

5.3)转染48小时后，吸出培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞层1-2次，0.125％的胰酶常规消化，收集细胞。根据细胞沉淀的情况，加入细胞裂解液[50毫摩尔浓度(mM)三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL)(pH为8.0)，150纳摩尔浓度(nM)氯化钠(NaCl)，1％毫摩尔浓度聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，0.2％毫摩尔浓度叠氮钠(Sodium azide)，0.5％毫摩尔浓度脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate sodium deoxycholate)，10微克/毫升(μg/ml)抑肽酶aprotinin，1微克/毫升(μg/ml)苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride)。利用二喹林甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将总蛋白等量上样，在12％的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)， 

电泳完毕后进行蛋白质印迹(western blot)，主要的抗体，一抗为：兔抗膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)多克隆抗体(rabbit polyclonal anti-mCD14，1∶1000倍稀释)，兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单抗(GAPDH rabbit mAB，1∶1000倍稀释)；二抗为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(HR labeled goat anti-rabbit IgG，1∶6000倍稀释)。 结果见图5，图5中的蛋白质印迹(western blot)结果表明，转染第4条(949号)小核糖核酸分子(siRNAs)稳定细胞系的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(membrane bound cluster of differentiation antigen，mCD14)融合蛋白的表达水平受到抑制，图5中的内容说明，siRNA949(siRNA4)小核糖核酸分子(siRNAs)能够明显抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的表达。 

图5中的标示说明： 

pEGFP-CD14：稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系，未转染， 

scramble siRNA：稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系，转染无效siRNA， 

EGFP-siRNA：稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系，转染抑制增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的siRNA(siRNA EGFP)， 

CD14-siRNA1：稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系，转染siRNA195(siRNA1)， 

CD14-siRNA2：稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系，转染siRNA664(siRNA2)， 

CD14-siRNA3：稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系，转染siRNA902(siRNA3)， 

CD14-siRNA4：稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293细胞系，转染siRNA944(siRNA4)， 

HEK293：HEK293细胞系，未转染。 

EGFP-CD14：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白； 

GAPDH：兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达。 

综上所述，本发明方法建立了稳定表达水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的人胚肾293细胞系(HEK293)；将合成的四对针对水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)基因的小核糖核酸分子(siRNAs)，转染该稳定细胞系，从中筛选出显著能特异且高效抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)蛋白表达的第四对(949#)小核糖核酸分子(siRNAs)，其基因序列信息是： 

正义，CGAGGUAAAUGACC UGACUTT (5’-3’)； 

反义，AGUCAGGUCAUUUACCUCGTT(5’-3’))。 

采用本发明方法进行筛选小核糖核酸分子(siRNAs)，为后续研究结合型白细胞分化抗原14(mCD14)在免疫及炎症反应中作用的分子机制，和进一步应用核糖核酸干扰(RNAi)技术通过抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)的表达，增强水牛抵抗革兰氏阴性菌感染的能力奠定了重要基础。 

附录1，是本发明所依据的水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)互补脱氧核糖核酸分子(cDNA)序列信息计算机可读版本； 

附录2，是本发明的抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子序列信息计算机可读版本。 

附录1： 

本发明所依据的水牛膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)互补脱氧核糖核酸分子(cDNA)序列信息计算机可读版本是： 

<110>王凤阳 

<120>水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因CDS 

<160>1 

<210>1 

<211>1122 

<212>DNA 

<213>水牛 

<400>1 

atggtgtgcg tgccctacct gttgctgctg ctgctgccgc cactgctgcg tgtgtctgcg     60 

gacacaacag aaccctgcga gctggacgac gacgatttcc gttgtgtctg caacttcacg    120 

gatccgaagc ctgactggtc tagcgccgtt cagtgtatgg ttgccgtaga ggtggagatc    180 

agtggcggcg gccgcagcct ggaacagttt ctcaagggag ccgacaccaa cccgaagcag    240 

tatgctgaca caatcaaggc tctgcgcgtt cggcgactca agctgggcgc tgcacaggtt    300 

cctgctcagc ttctggtcgc cgttctgcgc gcgctcgggt actctcgtct caaggaacta    360 

acgcttgagg acctggaagt aaccggccca atgcccccga agcctctgga agccactggg    420 

cctgcgttca ccaccctcag tctccgtaac gtatcgtggg caacaggagg tgcctggctc    480 

ggcgaactgc agcagtggct caagcctggg ctcagggtgc tgaacattgc ccaagcacac    540 

tcgcttgccc ttccgtgcgc agggctctcc accttcgagg cgctcaccac cctagacctg    600 

tctgacaatc ccagtctcgg cgacagcggg ctgatggcag ctctctgtcc gaacaagttc    660 

ccggccctcc aatatctagc gctacgcaac gccgggatgg agacgctgag cggagtgtgc    720 

gcggcgctgg cggcagcgag ggtgcagccc caaagcctgg acctcagcca caactcgctg    780 

cgcgtcaccg ccctgggcgc tacccgatgt gtctggccca gtgcactaag ctctctgaat    840 

ttgtcgttcg ctgggctgga gcaagtgcct aagggactgc cccccaagct cagcgtgctt    900 

gatctcagct gcaacaagct aagcagggag ccgcggcgag acgagctgcc cgaggtaaat    960 

gacctgactc tggatggaaa tccctttctg gaccctggag ccctccagca ccaaaatgac   1020 

ccgatgatct ccggcgtggt cccagcctgt gcgcgttctg ccttgaccat gggggtgtca   1080 

ggagccctgg cgctgcttca aggagcccga ggcttcgcgt aa                      1122 

。 

附录2： 

本发明的抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子序列信息计算机可读版本是： 

<110>王凤阳 

<120>抑制水牛膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子 

<160>1 

<210>1 

<211>21 

<212>RNA 

<213>水牛 

<400>1 

cgagguaaau gaccugacut t  21