水牛CD14基因shRNA片段的筛选及其对相关基因表达的影响研究

摘要

本研究主要通过筛选对水牛CD14基因有抑制作用的shRSA片段，利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术，体外研究其对水牛外周血单核巨噬细胞CD14基因的抑制效果及在LPS刺激下对相关基因表达的影响，以便为进一步研究CD14基因在布菌所致炎症反应中的作用，寻求家畜布病防治新方法奠定基础。
　　 1.设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1041)及1条阴性对照序列(NC-1864)，构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。利用脂质体法将其分别与融合表达载体pDsRed-N1-buffalo CD14共转染HEK293细胞，72h后进行QRT-PCR和FACS检测，筛选具有抑制效果的shRSA片段。结果显示：与对照组相比，各干扰组中外源水牛CD14基因在mRNA和蛋白水平上的表达均有不同程度的降低，其中CD14 shRNA-1041靶点的抑制效率最高(P<0.01)。
　　 2.采用磷酸钙沉淀法将筛选出来的有效CD14 shRNA及无关序列NC-1864的慢病毒重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒包装和滴度测定；以慢病毒颗粒感染体外分离培养的水牛外周血单核巨噬细胞，7d后采用1ug/ml LPS刺激细胞3h，QRT-PCR检测各组细胞中CD14、TLR4、IL-6和TNF-α基因在mRNA水平上的表达。结果显示：具有最高抑制效果的CD14 shRNA-1041有效降低了内源性CD14基因的表达；与对照组相比，LPS刺激后，感染慢病毒的细胞CD14 mRSA表达明显受到抑制，TLR4、IL-6和TNF-α基因mRNA表达水平也显著降低。
　　 上述结果表明，筛选获得的水牛CD14基因319、421、755、970和1041五个shRNA序列位点均能有效抑制CD14基因的表达，其中1041位点的干扰效率最高；CD14 shRNA-1041慢病毒颗粒不仅可以成功抑制水牛外周血单核巨噬细胞CD14 mRNA的表达，还可以有效抑制LPS刺激下CD14、TLR4、IL-6和TNF-α基因的表达，降低TLR4对LPS的信号传导效能。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 文献综述

第一章 布氏杆菌病的研究概述

1 布氏杆菌病的病原生物学特征

2 布氏杆菌的致病机理

3 布氏杆菌的毒力因子

4 脂多糖LPS

5 布氏杆菌病的防治

第二章 CD14基因的研究进展

1 CD14的研究历史

2 CD14的结构与分布

3 CD14的生理功能与作用机制

4 CD14的研究意义

第三章 RNA干扰技术的研究进展

1 RNA干扰的概述

2 RNA干扰的作用机制

3 RNA干扰的特征

4 RNA干扰的应用前景

5 慢病毒介导的RNA干扰

第二部分 试验研究

第四章 水牛CD14基因shRNA片段的设计及筛选

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第五章 CD14 shRNA对LPS刺激下水牛外周血单核巨噬细胞CD14及相关基因mRNA表达影响的研究

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

全文小结

参考文献

缩略词(中英文对照表)

致谢

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