精氨酸酶的定向位点聚乙二醇化及其作为抗癌和抗病毒试剂的用途

摘要

单聚乙二醇化精氨酸酶偶联物及其制备方法。所述单聚乙二醇化精氨酸酶在分子量上是均一的，并且显示出用于治疗癌症和病毒感染的治疗效果。制备所述精氨酸酶偶联物的方法包括遗传修饰编码精氨酸酶的基因使得PEG部分能够在预定的特异性目标位点结合到该酶上的主要步骤。这通过除去位于该酶的不期望的位点的PEG结合氨基酸残基同时在该酶的期望的位点保留(或增加，如果需要的话)PEG结合氨基酸残基来实现。如此制备的两种示例性的单聚乙二醇化精氨酸酶偶联物是人类精氨酸酶I(HAI)和热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)，在所述人类精氨酸酶I中，聚乙二醇(PEG)部分位点特异性地共价结合到该酶的Cys45；在所述热溶芽孢杆菌精氨酸酶中，聚乙二醇(PEG)部分位点特异性地共价结合到该酶的Cys161。

说明书

交叉引用

本申请要求在2009年3月26日提交的申请号为61/163,863的美国临 时专利申请的权益，在此通过参考方式整体引入该申请的内容。

技术领域

本发明涉及为增加精氨酸酶的血清或循环半衰期并提高其药代动力学 性质、体内生物学活性、稳定性并降低对该酶的体内免疫反应(免疫原性)的 目的而对该酶进行的修饰。更具体地说，本发明涉及通过遗传修饰编码精氨 酸酶的基因使单聚乙二醇(monopolyethylene glycol)与精氨酸酶发生的位 点特异性共价偶联，以生成单-和位点-特异性聚乙二醇化精氨酸酶，这成为 众多精氨酸依赖型疾病例如各种癌症和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的有效 措施。

背景技术

精氨酸酶

精氨酸酶是含有受金属激活的氢氧化物离子的锰金属酶，所述离子是催 化水解和水合反应的金属酶中的关键亲核物质。精氨酸酶将天然存在的精氨 酸转化为鸟氨酸和尿素。所述酶存在于包括细菌和人类在内的很多活体生物 中(Jenkinson等，1996，Comp Biochem Physiol B Biochem MoI Biol， 114：107-32)。

精氨酸酶的聚乙二醇化

精氨酸酶可以用作治疗剂并通过肠胃外施用于各种病状。然而，肠胃外 施用的精氨酸酶(其是一种蛋白)可能具有免疫原性并且具有短的药理学半 衰期。因此，在患者中难以实现该蛋白的治疗有用的血液水平。这些问题可 以通过将该蛋白与聚合物例如聚乙二醇(PEG)偶联来克服。

具有惰性的、非毒性的生物降解性聚合物PEG与分子的共价结合在生物 技术和医药中具有重要的应用。据报道，具有生物学和药学活性的蛋白的聚 乙二醇化提高了药代动力学，从而延长了持续时间、改善了安全性(例如更 低的毒性、免疫原性和抗原性)、增加了功效、降低了给药频率、提高了药 物溶解度和稳定性、降低了蛋白质水解性并促进了药物的可控释放(Roberts  等，2002，Adv Drug Deliv Rev，54：459-76；Harris & Chess，2003，Nat Rev Drug  Discov，2：214-221)。

通过本领域中的常规方法生成的PEG-蛋白偶联物含有不均一的物种， 各自结合有数量不定(从0至该蛋白具有的氨基数)的PEG分子。即使对于结 合有相同数目的PEG分子的物种，在该蛋白上的结合位点在这些物种之间 也是不同的。然而，这种非特异性的聚乙二醇化可能得到部分无活性或基本 无活性的偶联物。活性的降低可能是在PEG结合于不正确位点时遮蔽了该 蛋白的活性受体结合域而造成的。因此，明确需要生成能够保留亲本蛋白的 活性的均一(homogeneous)的聚乙二醇化蛋白分子并且使得临床用途所需 的正确和一致的剂量的施用成为可能的更好的方法。

通过氨基酸剥夺的癌症治疗

氨基酸剥夺疗法是用于一些癌症治疗的有效措施。虽然正常细胞不需要 精氨酸，但是很多癌细胞系就这种氨基酸而言是营养缺陷型的。很多证据表 明，体外精氨酸耗损(利用精氨酸降解酶或使用缺乏精氨酸的介质)导致大范 围的癌细胞的迅速破坏(Scott et al.，2000，Br J Cancer，83：800-10)。酶(其是一 种蛋白)的直接使用存在免疫原性、抗原性和短的循环半衰期的问题。

通过精氨酸剥夺对病毒进行的抑制

病毒感染是死亡的主要原因之一，每年数百万的死亡病例直接归因于若 干种病毒，包括肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)。然而，使用目前的抗 病毒疗法还存在若干问题。首先，有效的抗病毒药物相对较少。很多现有的 抗病毒物质导致不利的或不希望的副作用。大部分有效的疗法(例如接种疫 苗)只对单个病毒株具有高特异性。病毒经常发生突变，使得其对药物或疫 苗产生抗性。需要不具有与现有技术有关的所述问题的抑制病毒复制的方 法。

过去30年的研究表明，病毒的体外复制需要胞外精氨酸。过去这通过 如下方法来实现：使组织培养物培养基缺乏精氨酸，并对作为增补物使用的 血清进行透析以获得没有精氨酸的培养基。使用这种方法来实现精氨酸剥夺 导致很多不同的病毒家族的复制受到抑制，所述病毒家族包括腺病毒(Rouse 等，1963，Virology，20：357-365)和孢疹病毒(Tankersley，1964，J Bacteriol，87： 609-13)。

人类免疫缺陷病毒(HIV)

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是一种致命的疾病，据报道，该疾病的病 例在过去数年内急剧增加。AIDS病毒在1983年首次得到鉴定。该疾病具有 数个名称和首字母缩略名。它是第三个已知的T-嗜淋巴细胞病毒(HTLV-III)， 并且具有在免疫系统的细胞内复制的能力，导致深度的细胞破坏。AIDS病毒 式一种逆转录病毒(一种在复制期间使用逆转录酶的病毒)。目前已报道有两 种明显不同的HIV病毒家族，即HIV-1和HIV-2。本文中使用的首字母缩略 名“HIV”一般表示人类免疫缺陷病毒。HIV复制据信是精氨酸依赖型的，因 此精氨酸的消耗将抑制HIV复制。

发明内容

本发明的一个目的是提供新型的PEG-精氨酸酶偶联物，所述偶联物基 本上是均一的并且具有共价结合到精氨酸酶分子上的特异性位点的PEG部 分。本发明的两个优选的实施方式是Cys⁴⁵-人类精氨酸酶I(HAI)和Cys¹⁶¹- 热溶芽孢杆菌(Bacillus caldovelox)精氨酸酶(BCA)。

本发明的另一个目的是提供制备定向位点、单聚乙二醇化精氨酸酶偶联 物，所述偶联物具有强力的抗癌和抗病毒效果。本发明的一个特定的实施方 式包括三个基本步骤。第一步骤是用于编码精氨酸酶的基因的遗传修饰，使 所得到的精氨酸酶将在给定的位置上具有单个自由的半胱氨酸残基。第二步 骤是在选定的系统中表达经修饰的基因以生成所期望的精氨酸酶。表达系统 可以是人类细胞或组织或者其它的生物体，包括例如细菌细胞、真菌细胞、 植物细胞、动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或转基因动物。第三步骤是精氨 酸酶的所述自由的半胱氨酸残基与PEG化合物的马来酰亚胺基团(MAL)之间 的偶联，这导致所述PEG化合物与精氨酸酶的所述自由的半胱氨酸之间发生 共价结合。

本发明的另一个目的是提供了通过精氨酸消耗治疗病毒感染的方法。该 治疗方法采用均一的单聚乙二醇化精氨酸酶来抑制病毒的复制。

本发明的另一个目的是提供抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法。该方法 采用均一的单聚乙二醇化精氨酸酶来抑制HIV的复制。

本发明的另一个目的是提供通过用另外的氨基酸残基(例如脯氨酸)取 代热溶芽孢杆菌精氨酸酶位置20(或者HAI和其它精氨酸酶的对应位置)上 的缬氨酸来增强精氨酸酶的酶促活性的方法。

本发明的又一个目的是提供增强精氨酸酶的酶促活性的方法，所述方法 通过用钴取代天然金属辅因子锰来实现。

表征本发明的各种新颖性特征在所附的并构成本公开内容的一部分的 权利要求书中具体指出。为了更好地理解本发明、本发明的操作优点以及使 用本发明所实现的具体目标，应参考附图以及随后的其中展示并描述本发明 的优选实施方式的具体实施方式部分。

附图说明

图1显示了人类精氨酸酶I的核苷酸序列(a)(SEQ ID No：1)及其根据本 发明为定向位点聚乙二醇化所设计的突变核苷酸酶序列(b)(SEQ ID No：2)； 热溶芽孢杆菌精氨酸酶的核苷酸序列(c)(SEQ ID No：3)及其根据本发明为 定向位点聚乙二醇化所设计的突变核苷酸酶序列(d)(SEQ ID No：4)。

图2显示了人类精氨酸酶I的氨基酸序列(a)(SEQ ID No：5)及其根据本 发明为Cys⁴⁵定向位点聚乙二醇化所设计的经修饰的氨基酸酶序列(b)(SEQ  ID No：6)；热溶芽孢杆菌精氨酸酶的氨基酸序列(c)(SEQ ID No：7)及其根 据本发明为Cys¹⁶¹定向位点聚乙二醇化所设计的经修饰的氨基酸酶序列 (d)(SEQ ID No：8)。

图3显示了为Cys⁴⁵定向位点聚乙二醇化所设计的人类精氨酸酶I突变 体(C168S/C303S)的核苷酸序列和氨基酸序列(a)(SEQ ID No：9和SEQ ID  No：10)，为Cys⁴⁵定向位点聚乙二醇化所设计的带有6×His标签的人类精氨 酸酶I突变体(C168S/C303S)的核苷酸序列和氨基酸序列(b)(SEQ ID No：11 和SEQ ID No：12)的比对，为Cys¹⁶¹定向位点聚乙二醇化所设计的热溶芽孢 杆菌精氨酸酶突变体(S161C)的核苷酸序列和氨基酸序列(c)(SEQ ID No：13 和SEQ ID No：14)，为Cys¹⁶¹定向位点聚乙二醇化所设计的带有6×His标签 的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体(S161C)的核苷酸序列和氨基酸序列(d) (SEQ ID No：15和SEQ ID No：16)的比对。

图4显示了(a)野生型人类精氨酸酶I的晶体结构(使用Cn3D 4.1软件从 NCBI网站下载)，其中示出Cys⁴⁵远离活性位点；(b)野生型热溶芽孢杆菌精 氨酸酶的晶体结构，其中示出Ser¹⁶¹远离活性位点。

图5显示了用于具有单链mPEG-马来酰亚胺(20kDa)的带有6×His标签 的人类精氨酸酶I突变体的Cys⁴⁵-特异性单聚乙二醇化的偶联程序，其中示 出马来酰亚胺的双键与巯基发生烷基化反应而形成稳定的硫醚键，和(b)用于 带有6×His标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体的Cys¹⁶¹-特异性单聚乙二 醇化的对应程序。

图6显示了利用含有精氨酸酶基因的大肠杆菌(E.coli)BL21-DE3在2升 发酵罐中发酵的时间过程，其中示出分批发酵获得的结果(a1)和补料-分批发 酵获得的结果(a2)；分批发酵的时间关系曲线图(b1)和补料-分批发酵的时间 关系曲线图(b2)，其中示出诸如温度、搅拌速率、pH、溶解氧值等参数的变 化；来自螯合型FF sepharose(琼脂糖)柱的带有6×His标签的人类精氨酸酶 I突变体的洗脱曲线(c)，第一峰为蛋白杂质，第二峰为经纯化的人类精氨酸 酶I；和来自螯合型FF sepharose柱的带有6×His标签的热溶芽孢杆菌精氨 酸酶突变体的洗脱曲线(d)，第一峰为蛋白杂质，第二峰为经纯化的热溶芽 孢杆菌精氨酸酶。

图7显示了含有带6×His标签的人类精氨酸酶I突变体(a)和带6×His 标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体(b)的不同组分的SDS-PAGE分析。

图8显示了(a)没有聚乙二醇化的人类精氨酸酶I突变体和Cys⁴⁵聚乙二 醇化的人类精氨酸酶I突变体的SDS-PAGE分析(泳道1：蛋白分子量标记， 泳道2：没有聚乙二醇化的人类精氨酸酶I突变体，和泳道3：Cys⁴⁵聚乙二 醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20))；(b)没有聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌 精氨酸酶突变体和Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶的SDS-PAGE 分析(泳道1：蛋白分子量标记，泳道2：没有聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精 氨酸酶突变体，和泳道3：Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶 (BCA-PEG20))。

图9显示了(a)腹膜内注射到BALB/c小鼠中的单剂量非聚乙二醇化的和 Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)的药代动力学曲线，和(b)腹 膜内注射到BALB/c小鼠中的单剂量非聚乙二醇化的和Cys¹⁶¹聚乙二醇化的 热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20)的药代动力学曲线。

图10显示了腹膜内注射到BALB/c小鼠中长达14天的单剂量Cys⁴⁵聚 乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)的药效动力学曲线，和(b)腹膜内注 射到BALB/c小鼠中长达14天的单剂量Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精 氨酸酶(BCA-PEG20)的药效动力学曲线。

图11显示了在研究过程中用不同药物注射的异种移植有Hep3B人类肝 癌细胞的BALB/c裸小鼠(a)、用Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶 注射的异种移植有MCF-7人类乳癌细胞的BALB/c裸小鼠(b)、用不同药物 注射的异种移植有A549肺癌细胞的BALB/c裸小鼠(c)和用不同药物注射的 异种移植有HCT-15结肠直肠癌细胞的BALB/c裸小鼠(d)的平均体重(±标准 误差(s.e.m.))。

图12显示了(a)非聚乙二醇化的和Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶 I(HAI-PEG20)在皮下移植有Hep3B人类肝肿瘤细胞的BALB/c裸小鼠中的体 内活性(功效)；(b)Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20) 在皮下移植有MCF-7人类乳癌细胞的BALB/c裸小鼠中的体内活性； (c)Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶在皮下带有A549肺癌异种移 植物的BALB/c裸小鼠中的体内功效；(d)Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌 精氨酸酶在皮下带有A549肺癌异种移植物的BALB/c裸小鼠中的体内功效 (数据表示为肿瘤体积的增大倍数的平均数±s.e.m)；(e)Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热 溶芽孢杆菌精氨酸酶在皮下带有HCT-15结肠直肠癌异种移植物的BALB/c 裸小鼠中的体内功效；和(f)Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶在皮 下带有HCT-15结肠直肠癌异种移植物的BALB/c裸小鼠中的体内功效(数据 表示为肿瘤体积的增大倍数的平均数±s.e.m)。

图13显示了Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)的HIV抑 制测定。

图14显示了叠氮胸腺嘧啶脱氧核苷(azido-thymidine，AZT)的HIV抑制 测定。

图15显示了Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)的细胞毒 性。

图16显示了带有不同金属辅因子即Mn²⁺和Co²⁺的人类精氨酸酶I的稳 态动力学的比较。

图17显示了热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)的V20P突变体和由Mn²⁺(BCAWTMn²⁺)或Co²⁺取代的野生型BCA的稳态动力学的比较。

具体实施方式

人类精氨酸酶I基因(HAI)的克隆

人类精氨酸酶I的基因序列如图1a所示(SEQ ID No：1)。通过聚合酶链 式反应(PCR)由pAED4/HAI质粒产生带有6×His标签的人类精氨酸酶I的基 因(HAI)，其中使用如下寡聚核苷酸以在5′末端产生NdeI位点和在3′末端 产生BamHI位点：引物HuAr07-F：5′GAT.ATA.CAT.ATG.CAT.CAC.CAT.CAC  3′(SEQ ID NO：17)和引物HuAr08-R：5′ AGT.GCA.GGA.TCC.TTA.CTT.AGG.TGG.GTT.AAG.GTA.GTC 3′(SEQ ID  NO：18)。PCR产物用NdeI和BamHI切割并亚克隆到pET3a表达质粒载体 (Strategene)中。

pET3a大肠杆菌表达质粒载体含有T7启动子。所述T7启动子定位于基 因10前导序列片段的的上游。通过对人类精氨酸酶I的整个编码区进行DNA 测序来证实序列的正确性(图1a)。该质粒表示为pET3a/HAI。

热溶芽孢杆菌精氨酸酶基因(BCA)的克隆

热溶芽孢杆菌精氨酸酶的基因序列如图1c所示(SEQ ID No：3)。使用 NdeI和BamHI限制酶从质粒pUC57/BCA上切下带有6×His标签的热溶芽 孢杆菌精氨酸酶的基因(BCA)。将插入片段亚克隆到pET3a表达质粒载体 (Strategene)中。

通过对热溶芽孢杆菌精氨酸酶的整个编码区进行测序来证实序列的正 确性(图1c)。该质粒表示为pET3a/BCA。

HAI的诱变

使用质粒pET3a/HAI作为模板，根据QuikChange定向位点诱变试剂 盒(Strategene)进行定向位点诱变。使用如下诱变引物(分别为SEQ ID No：19、 20、21和22)将Cys¹⁶⁸和Cys³⁰³残基的密码子分别突变为Ser¹⁶⁸和Ser³⁰³的密 码子：

Cys¹⁶⁸密码子突变为Ser¹⁶⁸密码子：

引物HuAr01-F：5′GGG.TGA.CTC.CCT.CTA.TAT.CTG.CCA.AGG 3′

引物HuAr02-R：5′CCT.TGG.CAG.ATA.TAG.AGG.GAG.TCA.CCC 3′

Cys³⁰³密码子突变为Ser³⁰³密码子：

引物HuAr03-F：5′GCA.ATA.ACC.TTG.GCT.TCT.TTC.GGA.CTT.GC 3′

引物HuAr04-R：5′GCA.AGT.CCG.AAA.GAA.GCC.AAG.GTT.ATT.GC  3′。

首先将突变质粒转化到感受态大肠杆菌Top 10细胞。通过DNA测序证 实突变质粒的序列。为定向位点聚乙二醇化设计的HAI突变体的基因序列如 图1b所示(SEQ ID No：2)。然后将突变质粒转化到大肠杆菌BL21-DE3细胞 中进行蛋白表达。野生型HAI的氨基酸序列如图2a所示(SEQ ID No：5)。 C168S/C303S突变体的氨基酸序列如图2b(SEQ ID No：6)、图3a(SEQ ID No： 10)、图3b(SEQ ID No：12)所示。如图2b所示，人类精氨酸酶I中的两个半 胱氨酸残基被丝氨酸残基代替。这两个丝氨酸残基标有下划线。仅呈现的 Cys是Cys45。该突变体称为C168S/C303S，其只含有一个单独的Cys残基(也 标有下划线)。野生型HAI的晶体结构如图4a所示。根据该结构，进行用于 构建C168S/C303S突变体的推理蛋白质药物设计(rational protein drug  design)。在图2d中显示，热溶芽孢杆菌精氨酸酶中的一个丝氨酸残基被半 胱氨酸残基代替。该半胱氨酸残基标有下划线。6×His标签区域也标有下划 线并且定位在C末端。该突变体称为S161C。

带有6×His标签的精氨酸酶的表达和纯化

使带有含突变精氨酸酶基因的质粒的大肠杆菌BL21-DE3在37℃在LB 培养基中生长过夜，所述突变精氨酸酶基因编码带有6×His标签的人类精氨 酸酶I，所述LB培养基含有80μg/mL氨苄青霉素。将接种物按1∶25稀释并 使其在摇瓶中生长到OD₆₀₀为约0.8，或者按1∶10稀释并使其在发酵罐中生 长到OD₆₀₀为约15。然后用0.4mM IPTG对细胞进行4小时的诱导。细菌细 胞通过离心收集、重悬在50mM Tris、0.1M NaCl、10mM MnCl₂(pH 7.4) 中，并通过高压匀浆进行破碎。

通过经缓冲液A(0.02M磷酸钠，0.5M NaCl，pH 7.4)平衡的螯合型FF  sepharose(GE Healthcare)柱(5.0cm×9cm；床体积为176mL)纯化带有6×His 标签的人类精氨酸酶I。带有6×His标签的精氨酸酶用0.15至0.25M梯度的 咪唑进行洗脱(图6a和图6b)。流速为20mL/min(毫升/分钟)。收集含有经 纯化的精氨酸酶的组分(图7a和图7b)。经纯化的精氨酸酶的产率为约280 mg/L细胞培养物。

重复带有6×His标签的人类精氨酸酶I的上述提取程序以获得经纯化的 带有6×His标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶。

带有6×His标签的精氨酸酶的定向位点聚乙二醇化

图5显示了用于将带有6×His标签的人类精氨酸酶I突变体与单链 mPEG-马来酰亚胺(20kDa)偶联(称为HAI-PEG20)的Cys45-特异性单聚乙二 醇化的程序。马来酰亚胺的双键经历了与巯基的烷基化反应而形成稳定的硫 醚键。图5b显示了用于将带有6×His标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体 与单链mPEG-马来酰亚胺(20kDa)(称为BCA-PEG20)的Cys¹⁶¹-特异性单聚 乙二醇化的偶联程序。使用带有10K(截留值)膜(Millipore)的Millipore  Tangential Flow Filtration系统(500mL)，将1克带有6×His标签的精氨酸酶 在0.02M磷酸钠、0.5M NaCl，pH 7.4中进行渗滤。精氨酸酶的浓度最终稀 释到约2mg/mL。将10摩尔的摩尔超量的还原剂Tris(2-羧乙基)膦(TCEP) 添加到1摩尔的精氨酸酶中进行还原，并在室温下温和搅拌4小时。按20 摩尔的摩尔超量的mPEG-马来酰亚胺或mPEG-MAL(20kDa)(Sunbright)比 1摩尔的精氨酸酶将mPEG-马来酰亚胺添加到经还原的精氨酸酶中并在4℃ 搅拌过夜。

通过SDS-PAGE监测定向位点聚乙二醇化的进程(图8a和8b)。在上述 条件下，人类精氨酸酶I上的位置45处的半胱氨酸的自由巯基通过稳定的 硫醚键特异性地连接到mPEG-MAL(20kDa)的经激活的马来酰亚胺基团上。 最终偶联产物包含优势量的Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I、未偶联的人类 精氨酸酶I和m PEG-MAL(20kDa)。对于热溶芽孢杆菌精氨酸酶，类似地， 位置161处的半胱氨酸残基通过稳定的硫醚键特异性地连接到 mPEG-MAL(20kDa)的经激活的马来酰亚胺基团上。

mPEG-MAL(20kDa)聚乙二醇化精氨酸酶就更长的半衰期而言相对于 mPEG-MAL(5kDa)聚乙二醇化精氨酸酶是有利的，并且就更好的溶解性而 言相对于mPEG-MAL(40kDa)聚乙二醇化精氨酸酶是有利的。

在2升发酵罐中的分批发酵

将含有精氨酸酶基因的大肠杆菌BL21-DE3株保存在-80℃。为了制备 用于分批发酵和补料-分批发酵的种子接种物，将100μl上述菌株的冷冻储 存液转移到装有80mL发酵培养基的250mL培养瓶中。将细菌培养物在37 ℃和pH 7.0于以250rpm旋转的定轨摇床中培养。当在约8至10小时OD600 nm达到5.5至6.0时，终止培养。将12mL(1％)种子接种物导入到装有1200 mL经高压灭菌的滋养发酵培养基的2L发酵罐中。在37℃的温度进行分批 发酵。通过添加氢氧化钠和盐酸将pH保持在7.0。通过以1至4L/分钟导入 空气并将发酵罐的搅拌速度调节为300至1200rpm，将溶解氧水平控制为高 于30％空气饱和度。当OD600nm在5小时为约11.0时，将异丙基-β-D-硫 代半乳糖-P(IPTG)(100mM)(热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)的蛋白表达的诱 导剂)导入发酵液至0.5mM的终浓度。导入IPTG后，继续发酵到9小时(当 OD 600nm为约16.4时)。IPTG导入后4小时，收获发酵细胞用于BCA的 分离和纯化。前述菌株以约105mg/L的发酵培养基的量生成活性BCA。发 酵的时间过程作图于图6a1中。显示诸如温度、搅拌速率、pH、溶解氧值等 参数的变化的该分批发酵的时间关系曲线图在图6b1中示出。

在2升发酵罐中进行的补料-分批发酵

使用高细胞密度培养物在37℃、pH 7.0进行补料-分批发酵，并在整个 发酵过程中将溶解氧保持在高于30％空气饱和度。用于制备种子接种物的程 序与上述分批发酵的类似。发酵最初通过将5mL(1％)种子接种物导入装有 500mL经高压灭菌的滋养发酵培养基的2L发酵罐中而采用分批培养策略 开始。溶解氧在分批培养周期中的生长期逐渐降低到约30％空气饱和度。一 旦溶解氧水平增加到高于80％(表示碳源消耗)，则添加补充性滋养培养基开 始PO2 stat补料-分批策略。在该策略中，补料速度调整为将溶解氧水平保持 低于60％，这在发酵过程中提供了最小但是足够量的碳源。当在18小时 OD600nm为约100时，将异丙基-β-D-硫代半乳糖-P(IPTG)(100mM)向发酵 液中导入至0.5mM的终浓度。导入IPTG后，继续发酵到28小时(当OD 600 nm为约186.8时)。IPTG导入后10小时，收获发酵细胞用于BCA的分离和 纯化。前述菌株以约1489.6mg/L的发酵培养基的量生成活性BCA。这高于 所有其他所报道的不同类型精氨酸酶的产率。发酵的时间过程作图于图6a2 中。显示诸如温度、搅拌速率、pH、溶解氧值等参数的变化的该分批发酵的 时间关系曲线图在图6b2中示出。

分批发酵和补料-分批发酵的比较

下表1比较了分批发酵和补料-分批发酵的结果。该比较证明，就培养 物OD600、细胞干重和每升培养物的BCA产率而言，补料-分批发酵远远优 于分批发酵。

表1

定向位点聚乙二醇化精氨酸酶的纯化

使用亲和镍离子柱色谱层析法从如下所述的mPEG-MAL(20kDa)分离 出带有6×His标签的定向位点聚乙二醇化精氨酸酶。将偶联的最终产物装 载到经缓冲液A(0.02M磷酸钠，0.5M NaCl，pH 7.4)平衡的螯合型FF  sepharose(GE Healthcare)柱(5.0cm×9cm；床体积为176mL)。用5柱体积的 缓冲液A洗涤柱子以除去游离的mPEG-MAL(20kDa)。使用30％至100％盐 梯度的缓冲液B(0.02M磷酸钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH 7.4)(5柱体积) 洗脱聚乙二醇化精氨酸酶。在280nm波长处监测洗脱液的蛋白含量。以20 mL/分钟的流速洗脱柱子并收集聚乙二醇化精氨酸酶组分。所集中的组分渗 滤到PBS缓冲液(Gibco)中并浓缩至4至6mg/mL。在动物研究前，使用 Q-filter(过滤器)(Sartoris)除去蛋白质药物中的内毒素。

定向位点聚乙二醇化精氨酸酶的体外细胞毒性

通过在不同人类细胞(黑色素瘤、肝细胞癌、胃腺癌、结肠直肠腺癌， 胰癌(pancreatic carcinom)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma)和T细胞白血 病)中进行的标准MTT测定来研究Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I和Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶的体外细胞毒性。

在不同浓度的Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I和Cys¹⁶¹聚乙二醇化热 溶芽孢杆菌精氨酸酶存在的情况下，在5％CO₂培养箱中在37℃将数量已知 的细胞(5000)在96孔板的各个板孔中温育68小时。在药物温育68小时后， 将50μg的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴，四唑)溶液添 加到各个板孔中并再温育4小时。弃掉上清并将100μl的10％的SDS/0.01M  HCl添加到各个板孔中，然后温育过夜。通过微板读取器(microplate reader， Bio-Rad)在540nm处记录吸光度。针对不同的癌细胞系确定抑制50％细胞 生长(IC₅₀)所需的各种药物的浓度。实验按3次重复进行。

计算Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I和Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆 菌精氨酸酶针对不同细胞系的IC₅₀值，结果列在表2中。由于热溶芽孢杆菌 精氨酸酶的抗癌应答从未知道，因此这是首次证明了其抗癌性能和功效。在 各种黑色素瘤细胞系(SK-MEL-2、SK-MEL-28、A375)中，与Cys¹⁶¹聚乙二 醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶相比，Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I的IC₅₀值较低。在不同肝细胞癌细胞系(HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5)中，HepG2 细胞对Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I和Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌 精氨酸酶都是最敏感的。总之，所有受检的肝癌(HCC)和黑色素瘤细胞系均 受到BCA-PEG20和HAI-PEG20的有效抑制。

还针对其他5种癌细胞系(包括胃腺癌、结肠直肠腺癌，胰癌、胰腺癌 和T细胞白血病)检测了Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶。对于胃 腺癌细胞系，Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶针对MKN-45细胞 (0.798U/mL)的IC₅₀值类似于针对AGS细胞的IC₅₀值(0.662U/mL)。在不同 的结肠直肠腺癌细胞系(WiDr、HT-29、SW1116)中，WiDr细胞和HT-29细 胞对Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶都是敏感的。当将胰癌细胞系 (PANC-1)和胰腺癌细胞系(BxPC-3)比较时，Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌 精氨酸酶在PANC-1细胞中的IC₅₀值低4倍。对于T细胞白血病细胞系 (Jurkat、Clone E6-1)，Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶的IC₅₀值(0.41 U/mL)也比其他癌细胞的低。总之，所有受检的癌细胞系都对HAI-PEG20 和BCA-PEG20治疗敏感(并受到HAI-PEG20和BCA-PEG20治疗的抑制)。

表2

由定向位点聚乙二醇化精氨酸酶引起的精氨酸酶的消耗

使用BALB/c正常小鼠研究Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I和Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶的药效动力学。该研究与药代动力学(如 下所述)结合进行。因此，程序保持相同。还有，收集的血样立即在13,200rpm 离心5分钟，并收集血浆层供采用氨基酸分析仪(Biochrom 30，Biochrom Ltd.， England)进行的进一步分析使用。

如图10a所示，鸟氨酸水平在注射Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I后 开始增加，并且在高水平上(＞150μM)保持至第3天。从6小时(第0天)开始， 精氨酸被完全消耗，并且在精氨酸酶施用6.8±2.3天后开始出现。这表明 HAI-PEG20有效地消耗血液精氨酸。

对于Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20)，鸟氨酸水 平也开始增加并且保持高水平(＞170μM)至第3天(图10b)。从6小时(第0天) 开始精氨酸被完全消耗，并且在精氨酸酶施用6.7±2.1天后开始出现。这表 明BCA-PEG20有效地消耗血液精氨酸。

两种聚乙二醇化的精氨酸酶(Cys⁴⁵聚乙二醇化人类精氨酸酶I和Cys¹⁶¹聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精氨酸酶)均显示出类似的药效动力学曲线。

对肝癌的体内抗肿瘤功效

然后研究了非聚乙二醇化人类精氨酸酶I(HAI)和Cys⁴⁵聚乙二醇化人类 精氨酸酶I(HAI-PEG20)对肝癌的体内抗肿瘤功效。

很多BALB/c裸小鼠被腹膜内注射(i.p.)肝细胞癌Hep3B细胞并保持在体 内。然后用～1×10⁶的体内保持癌细胞皮下注射30只BALB/c裸小鼠中的每 一只的右腋窝。当形成5mm直径的可触摸的肿瘤时，将小鼠分为3个不同 组(见表3)。从第0天开始每周腹膜内施用药物或PBS缓冲液，施用8周。 测量体重和肿瘤尺寸(L：肿瘤的较长直径的长度，和W：肿瘤的较短直径的 长度)，每周两次。计算肿瘤体积(1/2×L×W²)并对时间作图。60天后或者当 肿瘤直径达到2.5cm时，对小鼠实施安乐死。在研究结束时记录小鼠的存活 率。

表3

如图11a所示，PBS对照组、Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I组和非 聚乙二醇化人类精氨酸酶I组的平均体重分别为25.9±0.2g、25.0±0.2g和 25.5±0.2g，每个组在整个实验过程中没有显著变化。

就肿瘤体积而言，Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)从第 47天开始显著地降低了肿瘤生长的速度(与PBS对照组相比(p＜0.01)；而非 聚乙二醇化人类精氨酸酶I(HAI)没有显示出任何显著的效果(p＞0.05)(图 12a)。

对乳癌的体内抗肿瘤功效

接着确定了Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20) 对乳癌的体内抗肿瘤功效。

将无胸腺裸BALB/c小鼠(6至8周龄)圈养在具有12小时光-暗周期的消 毒条件下，并让其自由食用经高压灭菌的食物。在实验开始前让小鼠适应至 少1周。每只裸小鼠在右腋窝皮下注射1×10⁶MCF-7人类乳癌细胞。当形 成5mm直径的可触摸的肿瘤时，将小鼠随机分为2个不同组(见表4)。从第 0天开始腹膜内注射药物或对照赋形剂(PBS)，每周一次。在每个星期一、星 期三和星期五，用游标卡尺测量肿瘤尺寸(L：最长直径，和W：其垂直的直 径)和体重。按公式(1/2×L×W²)计算肿瘤体积并以第0天作为参照计算肿瘤 体积的增大倍数。将结果对时间作图。在第18天或者当肿瘤直径达到2.5cm 时，对小鼠实施安乐死，并记录最后的肿瘤和体重。

表4

如图11b所示，在整个实验过程中，观察到对照组(18.76±0.50)和Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(19.76±0.66)没有显著差异(图11b)。 Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶显著地抑制了肿瘤生长并降低了 肿瘤增大倍数(与PBS对照组相比(双因素方差分析(2-way ANOVA)：p＜ 0.0001，图12b)。采用Bonferroni后检验(Bonferroni post-test)，从第15天开 始所述降低具有统计学显著性(p＜0.01)，其中所述降低超过2.8倍。

对肺癌的体内抗肿瘤功效

将无胸腺裸BALB/c小鼠(6至8周龄)圈养在具有12小时光-暗周期的消 毒条件下，并让其自由食用经高压灭菌的食物。在实验开始前让小鼠适应至 少1周。每只裸小鼠在右腋窝将5×10⁶A549人类肺癌细胞和matrigel生长 添加剂一起进行皮下注射。当形成5mm直径的可触摸的肿瘤时，将小鼠随 机分为3个不同组(见表5)。从第0天开始腹膜内注射药物或对照赋形剂 (PBS)，每周一次。在每个星期一、星期三和星期五，用游标卡尺测量肿瘤 尺寸(L：最长直径，和W：其垂直的直径)和体重。按公式(1/2×L×W²)计算 肿瘤体积并以第0天作为参照计算肿瘤体积的增大倍数(相对肿瘤体积)。

表5

在整个实验过程中观察到不同组之间的平均体重没有显著变化，实验结 束时的最后记录如下：对照组为23.98±2.68g，非聚乙二醇化的热溶芽孢杆 菌精氨酸酶为23.68±1.50g，Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶为 23.16±2.08g(图11c)。

然而，就肿瘤体积的进程变化(图12c)和肿瘤倍数(图12d)而言，Cys¹⁶¹ 聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20)统计学显著地抑制了肿 瘤的生长。双因素方差分析显示，两个参数的P值＜0.0001，而Bonferroni 后检验显示，肿瘤体积的差异从第28天(p＜0.05)开始至第35天(p＜0.001)， 而相对肿瘤体积的差异从第30天开始至第35天(所有点均为p＜0.01)。相 同剂量方案的未聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)也以类似的方式 显示出程度类似的抗肺癌效果，两个参数具有统计学显著性(双因素方差分 析，两者均为p＜0.0001)。

对结肠直肠癌的体内抗肿瘤功效

非聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)和Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热 溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20)对结肠直肠癌的体内抗肿瘤功效测定如 下。

将无胸腺裸BALB/c小鼠(6至8周龄)圈养在具有12小时光-暗周期的消 毒条件下，并让其自由食用经高压灭菌的食物。在实验开始前让小鼠适应至 少1周。每只裸小鼠在右腋窝皮下移植有～3mm³的体内保持HCT-15人类结 肠直肠癌细胞。当形成5mm直径的可触摸的肿瘤时，将小鼠随机分为5个 不同组(表6)。从第0天开始进行精氨酸酶药物或对照赋形剂(PBS)的腹膜内 施用(每周两次)和5-氟尿嘧啶的腹膜内施用(每周一次)。在每个星期一、星 期三和星期五，用游标卡尺测量肿瘤尺寸(L：最长直径，和W：其垂直的直 径)和体重。按公式(1/2×L×W²)计算肿瘤体积并以第0天作为参照计算肿瘤 体积的增大倍数(相对肿瘤体积)。将结果对时间作图。在实验结束时或者当 肿瘤的直径达到2.5cm时对小鼠实施安乐死。

表6

在整个实验过程中观察到不同组之间的平均体重没有显著变化，实验结 束时的最后记录如下：对照组为24,3±0.9g，未聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌 精氨酸酶组为22.1±1.0g，Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶组为 24.2±0.7g，Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶+5-氟尿嘧啶组为23.5 ±1.2g，5-氟尿嘧啶组为24.5±1.4g(图11d)。

在所有三个精氨酸酶药物治疗组中，Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌 精氨酸酶(BCA-PEG20)和非聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)都具 有统计学显著性地抑制了肿瘤生长(图12e和图12f)。对于药物组合组(Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶+5-氟尿嘧啶)，双因素方差分析显示， 肿瘤体积倍数和肿瘤体积具有显著性(两种情况中均为：p＜0.0001)。 Bonferroni后检验进一步确认，肿瘤体积倍数的显著差异出现在第36天至第 40天。对于Cys¹⁶¹聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶单独组，双因素方差 分析显示肿瘤体积倍数和肿瘤体积的显著性分别为：p＝0.0005和p＝ 0.0011。Bonferroni后检验表明，肿瘤体积倍数的差异出现在第38天至40 天，而肿瘤体积的差异出现在第40天。对于非聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌 精氨酸酶组，肿瘤体积倍数和肿瘤体积的p值分别为0.0202和＜0.0001。就 肿瘤体积倍数而言，5-氟尿嘧啶组没有显示出显著的肿瘤抑制作用(图12f)。 药物组合组导致统计学显著地降低了肿瘤体积和肿瘤体积倍数(与Cys¹⁶¹聚 乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶单独组(分别为：p＜0.0001和p＝0.0120) 和5-氟尿嘧啶单独组(分别为p＝0.0158和p＝0.0434)。结果表明，Cys¹⁶¹聚 乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶和5-氟尿嘧啶具有协同治疗效应。

对乳癌转移的体内抑制功效

将1×10⁵的小鼠转移人癌细胞系(4T1)细胞原位(orthotopically)注射到6 至8周龄的野生型BALB/c小鼠的4号腹股沟乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到平 均5mm时，将小鼠分为2个不同的治疗组(表7)。从第0天开始腹膜内注射 BCA-PFG20(250U/小鼠)或对照赋形剂(PBS)(每周两次)。每周测量体重。3 周后，处死小鼠并分析肺转移。用PBS冲洗后在解剖显微镜下对肺转移的数 量进行计数。

在整个实验过程中观察到不同组之间的平均体重没有显著差异。实验结 束时的最后记录为：对照组21.8g，BCA-PEG20组21.5。

结果表明，与PBS赋形剂组相比，BCA-PEG20降低了自然肺肿瘤节结 形成。在PBS组中，自然肺转移多得难以计数，而在BCA-PEG20组中发现 平均只有4个节结(表8)。结果表明，由BCA-PEG20造成的精氨酸消耗抑制 了乳腺肿瘤转移。

表7

对HIV(HAI-PEG20)的效果

测定Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)对人类免疫缺陷病 (HIV)的50％抑制浓度(IC₅₀)作为其对HIV的效果的量度。

使用用于病毒复制的细胞培养物模型可以评估抗病毒药物的功效。HIV 复制测定法采用H9细胞和HIV-1株RF。来自人类T淋巴细胞的H9细胞对 CXCR4-使用HIV-1分离物的感染高度易感，并且在注射后数天就显示出细 胞变性效果的明显症候。HIV-1株RF是能够在H9细胞内高水平复制的 CXCR4-使用B类型分离物。

按5×10⁴活细胞/mL将H9细胞接种到四个96孔板并将培养物于37℃ 温育。第二天，以0.005感染复数(50μL/孔)将HIV-1接种到两个96孔板中。

感染24小时后，用在组织培养基(10％RPMI)中稀释至1U/mL、10U/mL 和50U/mL终浓度的Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)处理 一个受感染的96孔板的各细胞。每种药物浓度检测8个重复，并且每孔添 加100μL。

该测定中使用叠氮胸腺嘧啶脱氧核苷(AZT)作为基准药物以确保获得剂 量应答。叠氮胸腺嘧啶脱氧核苷适当地稀释(0.01，0.1和1μg/mL)在 10％RPMI中并添加到另一个受感染的板中。每种药物浓度检测8个重复， 并且每孔添加100μL。

平行设置细胞毒性对照；该对照由用3种药物浓度(1U/mL、10U/mL 和50U/mL；每种药物浓度8个重复)处理的未感染细胞的一个96孔板组成。 这可以确定细胞毒性浓度(CC₅₀)

剩下的96孔板用单独的组织培养基接种以用作阴性对照。

注射后5天，检查培养板的细胞变性效果，并通过比较受药物治疗的细 胞和不受治疗细胞中的合胞体细胞数目来确定药物的IC₅₀。

结果显示，接种HIV株RF的H9细胞具有病毒感染，而单独用组织培 养基接种的H9细胞在整个研究过程中保持健康。在用HIV感染并用所有浓 度的Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)处理的H9细胞培养物 中观察到细胞变性效果。用终浓度为1U/mL的聚乙二醇化精氨酸酶处理的 8个受感染板孔中的8个板孔(8/8)展现出细胞变性效果。对于用终浓度为10 U/mL的酶处理的受感染板孔，6/8的板孔展现出细胞变性效果。当检测最高 终浓度(50U/mL)的药物时，3/8的板孔展现出细胞变性效果。这些结果显 示在表9和图13中。发现药物的IC₅₀为约37U/mL。

当以0.01μg/mL将基准药物AZT添加到受感染的板孔时，7/8的板孔展 现出细胞变性效果。对于用0.1μg/mL的AZT处理的受感染板孔，6/8的板 孔展现出细胞变性效果。在1μg/mL检测时，2/8的板孔展现出细胞变性效 果。这些结果在图14中展示。发现AZT的IC₅₀为0.58μg/mL。

表9

各个板孔以0.005感染复数接种50μL的HIV。

^*＝在各个板孔中观察到的细胞毒性，因此每个浓度进行1个板孔的存活 率计数。结果以比率的形式记录；例如，1/X，其中1是阳性板孔数目/接种 板孔数目。

表10提供了细胞毒性对照的存活率计数。在细胞毒性检测中，所有板 孔展示了细胞毒性症状，因此Cys⁴⁵聚乙二醇化的人类精氨酸酶I的每个浓 度都进行一个板孔的存活率计数。最高浓度得到的细胞存活率分别为：50 U/mL，30％；10U/mL，39％。对于1U/mL，细胞存活率为58％。基于此， 评测了所有8个板孔的细胞存活率，并且确定平均值为48.9％。根据细胞接 种在96孔板上时细胞的存活率(96.8％)，这大约为细胞存活率降低了50％。 这些结果展示在表10和图15中，其中清楚地证明了HAI-PEG20对HIV复 制具有抑制效果。

表10

N/A＝不适用

体内抗癌效果

针对各种不同的癌类型进行了不同精氨酸消耗性酶的抗癌功效的体内 癌细胞培养研究。

细胞增殖测定：对于每种癌细胞系，将在100μL培养物培养基中的细 胞(5×10³)接种到96孔板的板孔中并采用标准方法温育24小时。用含有不 同浓度的精氨酸酶或精氨酸脱亚胺酶(ADI)之一的培养基替换培养物培养 基。在37℃在95％空气/5％CO₂的氛围中将培养板再温育3天。通过MTT 测定法确定代谢性活细胞组分，进行该方法以估计培养物中的活细胞数量。 通过采用Prism 4.0(Graphpad Software)进行的非线性回归来拟合S形 (sigmoidal)剂量应答曲线，将实现50％的细胞生长抑制作用所需的每种精氨 酸降解酶的量(以U/mL或单位/ml或μg/mL表示)定义为IC₅₀。

RT-PCR研究：使用Qiagen RNeasy试剂盒从在培养物中生长的癌细胞 系中提取总RNA。对于逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，首先根据生产商 的说明书使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，CA)将RNA逆转录为 cDNA。简而言之，用5μg的总RNA在42℃进行30分钟的RT(逆转录)。 然后使用50μL含有0.5单位的iTaq DNA聚合酶(Bio-Rad，CA)的反应混合 物扩增部分cDNA(2μL)。在DNA热MyCycler(Bio-Rad，CA)中进行PCR。 使用以下侧翼引物：

(a)人类ASS(448bp产物)：

正义：5′-GGGGTCCCTGTGAAGGTGACC-3′；

反义：5′-CGTTCATGCTCACCAGCTC-3′

(b)人类ASL(218bp产物)：

正义：5′-CTCCTGATGACCCTCAAGGGA-3′；

反义：5′-CATCCCTTTGCGGACCAGGTA-3′

(c)人类OTC(221bp产物)：

正义：5′-GATTTGGACACCCTGGCTAA-3′；

反义：5′-GGAGTAGCTGCCTGAAGGTG-3′

(d)人类GAPDH(306bp产物)：

正义：5′-AGCCACATCGCTCAGACA-3′；

反义：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′

对反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。在电泳和用溴化乙锭染色后，通 过荧光成像仪(Lumi-Imager)(Boehringer Mannheim，IN)分析所有PCR产 物条带强度，并通过用看家基因GADPH进行的归一化来估计相对mRNA 表达水平。

如结果所示，精氨酸酶和ADI全部都是有效的精氨酸降解酶。令人预想 不到的是，本发明人发现在此受检的所有癌细胞系都对精氨酸酶敏感，但是 很多癌细胞实际上对ADI处理具有抗性。在本发明中发现，这种差异是由于 精氨酸酶事实上将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素，而ADI将精氨酸转化为瓜氨 酸和氨。如果癌细胞呈ASS阳性和ASL阳性，则瓜氨酸能够再循环回到精 氨酸，导致药物抗性。最令人惊讶的是，如果癌细胞呈OTC阴性，即使它 们呈ASS阳性和ASL阳性，它们也不能在细胞中将鸟氨酸循环回到精氨酸。 已发现本发明提供的这种指导方针与本发明人的所有数据以及来自其他研 究组的数据吻合。根据这种指导方针，例如，如果癌细胞呈ASS阴性和/或 ASL阴性，它们将具有精氨酸酶敏感性和ADI敏感性。另一方面，如果癌 细胞同时呈ASS阳性和ASL阳性但是呈OTC阴性，它们将具有精氨酸酶敏 感性且具有ADI抗性。因此据信精氨酸酶具有比ADI更广泛的抗癌用途。 而且，氨(来自ADI反应的产物)比尿素(来自精氨酸酶反应的产物)更具毒性。 因此，相信本发明的精氨酸酶抗癌试剂比ADI更安全。

体外抗癌功效结果总结在表11a至表11g中。如表11a所示，所有受检 的黑素瘤细胞系对精氨酸酶处理敏感。当向培养物培养基中添加精氨酸酶 时，精氨酸被转化为鸟氨酸和尿素。所有这些细胞都呈OTC阴性，并且根 据上述讨论的指导方针，这些细胞不能在细胞中将精氨酸酶反应产物鸟氨酸 再循环回到精氨酸，因此，所述细胞由于缺乏精氨酸而受到抑制。根据IC₅₀值，所有受检的精氨酸酶对癌细胞生长的抑制都非常有效。

尽管所有受检的黑素瘤细胞系都呈ASS阳性和ASL阳性，但是ASS的 表达水平低，这可以通过进行ASS活性测定证实。低ASS表达水平解释了 为什么这些细胞系都对ADI处理敏感。B16是小鼠黑素瘤细胞系，并且对精 氨酸酶和ADI也都是敏感的。因此据信ADI杀死黑素瘤细胞是因为ASS表 达水平低，而精氨酸酶杀死黑素瘤细胞是因为它们呈OTC阴性。

表11b显示，所有受检的白血病细胞系对精氨酸酶处理敏感。这些受检 的癌细胞中的一些细胞呈OTC阴性，并且根据上述讨论的指导方针，这些 细胞不能在细胞中将精氨酸酶反应产物鸟氨酸再循环回到精氨酸，因此所述 细胞由于缺乏精氨酸而受到抑制。根据IC₅₀值，所有受检的精氨酸酶对白血 病细胞生长的抑制都非常有效。对于ADI处理，除了RPMI8226之外，所有 受检的4种其它白血病细胞系都是敏感的，RPMI8226对ADI处理具有抗性， 很可能是因为它事实上都呈ASS阳性和ASL阳性。因此，对于抑制白血病 细胞，精氨酸酶比ADI有利。

表11c显示，所有受检的结肠直肠癌细胞系都对精氨酸酶处理敏感。所 有这些受检的癌细胞都呈OTC阴性。与上述讨论的指导方针吻合的是，这 些细胞不能在细胞中将精氨酸酶反应产物鸟氨酸再循环回到精氨酸，因此， 所述细胞由于缺乏精氨酸而受到抑制。根据IC₅₀值，所有受检的精氨酸酶对 结肠直肠癌细胞生长的抑制都非常有效。对于ADI处理，只有受检的两种结 肠直肠癌细胞系(WiDr和HT29)是敏感的，其他2种(SW1 116和HCT15)对 ADI处理具有抗性，很可能是因为它们事实上都呈ASS阳性和ASL阳性。 对于HT29，尽管根据RT-PCR数据，它是呈ASS阳性和ASL阳性，但是， 如进行ASS活性测定所证实的那样，ASS的表达水平低，这解释了为什么 这种细胞系对ADI处理敏感。

同样如表11c所示，更令人吃惊的是，所有受检的胰癌细胞系都对精氨 酸酶处理敏感。所有受检的这些癌细胞都呈OTC阴性。如上所述，这些细 胞不能在细胞中将精氨酸酶反应产物鸟氨酸再循环回到精氨酸，因此所述细 胞由于缺乏精氨酸而受到抑制。根据IC₅₀值，所有受检的精氨酸酶对胰癌细 胞生长的抑制都非常有效。对于ADI处理，只有受检的一种胰癌细胞系 (Panc1)是敏感的，而其他2种(BxPC3和HPAFII)对ADI处理具有抗性。显 然，对于抑制胰癌细胞系，精氨酸酶比ADI更好。

表11d显示，所有受检的胃癌细胞系都对精氨酸酶处理敏感。所有受检 的这些癌细胞都呈OTC阴性，因此，如上所述，这些细胞不能在细胞中将 精氨酸酶反应产物鸟氨酸再循环回到精氨酸，因此，所述细胞由于缺乏精氨 酸而受到抑制。如根据IC₅₀值所示，所有受检的精氨酸酶对胃癌细胞生长的 抑制都非常有效。明显不同的是，所有受检的胃癌细胞系都对ADI处理具有 抗性，很可能是因为它们事实上都呈ASS阳性和ASL阳性。在由受检的肝 癌(或HCC)细胞系中获得了这种类似的结果，如表11e所示。

表11e还显示，受检的眼癌细胞系Y79对精氨酸酶处理敏感，但是对 ADI处理具有抗性，很可能是因为它们都呈ASS阳性和ASL阳性。

表11f显示，受检的肺癌细胞系A549对精氨酸酶处理敏感。这些受检 的癌细胞呈OTC阴性，该细胞系对ADI处理也是敏感的，很可能是因为它 们事实上呈ASS阴性或ASL阴性。相反，表11f还显示，受检的所有子宫 颈癌细胞系都对精氨酸酶处理敏感(它们全都呈OTC阴性)，但是只有2种受 检的子宫颈癌细胞系(SiHa和C-33A)是敏感的，而其他3种(HeLa，ME180， CC3)对ADI处理具有抗性，很可能是因为它们事实上均呈ASS阳性和ASL 阳性。

乳癌细胞的结果显示在表11g中。如表中所示，所有受检的乳癌细胞系 都对精氨酸酶处理敏感(它们全都呈OTC阴性)。令人吃惊的是，只有1种受 检的乳癌细胞系(MDA-MB-231)是敏感的，而其他3种(MCF-7、ZR-75-1、 Hs578T)对ADI处理具有抗性。

表11g还显示了前列腺癌细胞系的结果，发现前列腺癌细胞系对精氨酸 酶处理和ADI处理都敏感。如上所述，这个结果可以由该细胞系均呈OTC 阴性和ASS阴性的事实所解释。

表11a

表11b

表11c

表11d

表11e

表11f

表11g

对于表11，“+”＝mRNA被RT-PCR检测到，表示相对应的基因得到表 达；“-”＝mRNA没有被RT-PCR检测到，表示该基因没有被表达；“′R” 表示细胞系具有ADI抗性并且IC₅₀值没有估算；而“L”表示细胞系具有相 对较低水平的ASS表达因此该细胞系仍然对ADI敏感。

尽管不希望受以下假说和工作模式的束缚，但是申请人相信以下假说和 工作模式与本发明的实验数据相吻合，并因此可以用于指导在此公开的本发 明的进一步利用(还参见图18)。

解释为什么OTC阴性癌细胞对精氨酸酶敏感却能够具有ADI抗性的假 说和工作模式。当将精氨酸酶添加到培养物培养基或者将聚乙二醇化精氨酸 酶注射到血液(体内)中时，精氨酸通过精氨酸酶酶促反应而被转化为鸟氨酸 和尿素。然后形成的鸟氨酸进入到癌细胞内。与正常细胞不一样的是，癌细 胞快速生长并需要比正常细胞多得多的精氨酸以用于蛋白质合成和其它细 胞过程。如果癌细胞是OTC阳性、ASS阳性和ASL阳性，则鸟氨酸能够被 再循环回到精氨酸。因此，癌细胞仍然具有精氨酸，并且它们没有缺乏精氨 酸，并且细胞生长没有受到抑制。另一方面，呈OTC阴性或ASS阴性或 ASL阴性或者这些缺陷的任意组合或者这些基因中任意基因的表达水平低 的癌细胞，从鸟氨酸到精氨酸的合成(或者再循环)途径被阻断，因此癌细胞 缺乏精氨酸，癌细胞生长因而受到抑制，并可能出现癌细胞死亡。

呈OTC阴性的肝癌细胞的假说和工作模式。模式相关尿素循环基因表 达和耐聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(ADI-PEG)和聚乙二醇化热溶芽孢杆菌精 氨酸酶(BCA-PEG)的抗性。肝癌细胞表达尿素循环酶精胺琥珀酸合成酶 (argininosuccinate synthetase，ASS)、精胺琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase， ASL)和精氨酸酶(arginase，ARG)，但是缺乏鸟氨酸氨基甲酰转移酶(ornithine  transcarbamylase，OTC)。血流中的BCA-PEG20消耗精氨酸并生成鸟氨酸， 鸟氨酸进入细胞但是由于缺乏OTC而不能通过尿素循环进行再循环。 ADI-PEG将精氨酸转化为瓜氨酸，瓜氨酸在吸收进入肝癌细胞后由ASS和 ASL容易地转化回到精氨酸。因此，在该模式中，肝癌细胞对BCA-PEG20 处理敏感(受BCA-PEG20抑制)而对ADI-PEG处理具有抗性。

呈OTC阴性的癌细胞的假说和工作模式。模式相关基因在癌细胞中的 表达和耐聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(ADI-PEG)和聚乙二醇化热溶芽孢杆菌 精氨酸酶(BCA-PEG20)的抗性。对于不能表达精氨酸酶(ARG)的癌细胞，癌 细胞表达精胺琥珀酸合成酶(ASS)、精胺琥珀酸裂解酶(ASL)，但是缺乏鸟氨 酸氨基甲酰转移酶(OTC)。血流中的BCA-PEG20消耗精氨酸并生成鸟氨酸， 鸟氨酸进入细胞但是由于缺乏OTC而不能进行再循环。ADI-PEG将精氨酸 转化为瓜氨酸，瓜氨酸在吸收进入癌细胞后由ASS和ASL容易地转化回到 精氨酸。因此，在该模式中，癌细胞对BCA-PEG20处理敏感(受BCA-PEG20 抑制)而对ADI-PEG处理具有抗性。这种模式通常能够应用于癌细胞。

通过使用钴作为金属辅因子进一步增强精氨酸酶活性的方法

精氨酸酶的天然金属辅因子是锰(Mn²⁺)。本发明令人惊讶地发现用钴代 替锰显著地增强了酶活性。如上所述表达热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)或人 类精氨酸酶I(HAI)。纯化方法与前述相似，不同之处在于将10mM金属离 子(CoSO₄或MnSO₄)添加到来自镍亲和层析的经纯化的蛋白质洗脱液中(而 不是在镍亲和层析之前添加)。将含有精氨酸酶的洗脱组分与10mM金属在 50℃至55℃温育15分钟，接着通过0.45μm注射过滤器过滤。然后通过超 滤将溶液与保存缓冲液进行交换。

使用二乙酰一肟(DAMO)测定法来确定带有不同金属辅因子的人类精氨 酸酶的动力学参数。所有酶促反应都在pH7.4进行。结果显示在图16中。 重组人类精氨酸酶I(HAI)或者取代有Mn²⁺或Co²⁺的huArg的稳态动力学在 磷酸钠缓冲液(pH7.4)中在25℃测量。带有Mn²⁺的HAI(HAI Mn²⁺)或huArg  Mn²⁺和带有Co²⁺的HAI(HAI Co²⁺)或huArg Co²⁺的Km分别为1.83mM和 0.19mM。由于在HAI Co²⁺和huArg Co²⁺中的Km值提高了约10倍，其活性 提高了约10倍，因此它是比HAI Mn²⁺或huArg Mn²⁺要有效得多的药物。

通过进一步调节基因修饰来增强精氨酸酶活性

本发明令人意外的发现，BCA的位置20可以被其他氨基酸取代以提高 酶活性。通过定向位点诱变(例如密码子GTT[缬氨酸]变为CCG[脯氨酸]) 用脯氨酸(或者任意其它氨基酸如丝氨酸或甘氨酸，其提高了BCA的特异性) 取代野生型序列中的第20位氨基酸残基。将突变基因进行克隆、表达和纯 化以用于具体研究。示例性的这种突变酶通过用脯氨酸代替缬氨酸来制备， 称为“BCA突变体V20P”或“bc Arg V20P突变体”。在磷酸钠缓冲液(pH 7.4) 在25℃测量带有Mn²⁺或Co²⁺的BCA突变体V20P和BCA的稳态动力学并 显示在图17中。带有Mn²⁺的BCA突变体V20P(BCA突变体V20P Mn²⁺)和 带有Co²⁺的BCA突变体V20P(BCA突变体V20P Co²⁺)的Km值分别为约 1.29mM和0.18mM。带有Mn²⁺的BCA(BCAWTMn²⁺)的Km值为约3.2mM。 因此，带有Co²⁺作为辅因子的BCA突变体V20P[Km＝0.18mM]是比BCA (BCAWTMn²⁺)[Km＝3.2mM]有效得多的消耗精氨酸的药物。

使用BCA突变体V20P进行的体外癌细胞系研究

细胞增殖测定如下进行。

将2.5×10³ Sk-mel-28(EMEM)、5×10³ HEK293(EMEM)、MCF-7 (EMEM)、HCT-15(RPMI)、Hep3B(DMEM)、PANC-1(DMEM)、HeIa(DMEM) 和A549(DMEM)细胞接种在96孔板的各个板孔的100μL培养物培养基中 并让其过夜粘附到培养板上。在第二天，用含有不同浓度的BCA和BCA突变体V20P蛋白质药物的培养基替换培养物培养基。在添加蛋白质药物的那 一天，将2×10⁴Jurkat(RPMI)悬浮细胞接种到96孔板的各个板孔的50μL 培养物培养基中，将在50μL中的不同浓度的蛋白质药物直接添加各个板孔 中。将细胞在37℃在95％空气/5％CO₂的气氛中再温育3天。然后进行MTT 细胞增殖测定(Invitrogen)以估计培养物中活细胞的数量。简而言之，将10μL 的5mg/mL的水溶性MTT试剂添加到100μL培养物培养基中，并在37℃ 温育4小时。MTT被细胞化学还原为紫色的甲(formazan)，然后甲被组 织培养物培养基中的酸化SDS(在10％SDS中的0.01N HCl)溶解。切割产 物甲的浓度用带有570nm滤镜的分光光度计读取其吸光度来测量。细胞 增殖数据表示为对照的百分数。使用Prism 4.0(Graphpad Software)通过非线 性回归来拟合S形剂量应答曲线，实现50％细胞生长抑制所需的蛋白质药物 的量定义为IC₅₀。结果显示在表12中。相应的酶促活性显示在表13中。

表12BCA和BCA突变体V20P在不同种类的癌细胞中的IC₅₀

表13蛋白的特异活性

结果显示，在体外药物功效研究中，BCA突变体V20P在杀死各种类型 癌细胞中要有效得多。

尽管已经如在本发明的优选实施方式中那样描述并指出本发明的新的 基本特征，但是应当理解的是，本领域技术人员可以按实施方式所述形式和 细节进行进行各种省略、代替和变动而没有脱离本发明的实质。本发明不受 仅以举例方式提供的上述实施方式的限制，并且可以在所附专利权利要求书 限定的保护范围之内进行各种形式的改变。