一种基于可逆反应的组合络合分离蚕蛹油中不饱和脂肪酸的方法

摘要

一种基于可逆反应的组合络合分离蚕蛹油中不饱和脂肪酸的方法，采用基于可逆络合反应的脲素包结法和β-环糊精包合法组合分离，蚕蛹油中α-亚麻酸、油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的总纯度和得率可提高至86.5％和911％，分离过程操作简便，成本低廉，为今后规模化制备蚕蛹油不饱和脂肪酸及其产品提供理论基础和技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种基于可逆反应的组合络合分离方法，用于 从蚕蛹油中制备高纯度的不饱和脂肪酸(α-亚麻酸、亚油酸和油酸)。

背景技术

我国是蚕业大国，蚕蛹作为缫丝副产品，每年可产近20万吨干蛹，是一种重要的生物质 油脂资源。以蚕蛹油为例，脂肪占蚕蛹鲜物的9％～10％，或占干物28％～30％。其中，饱和脂 肪酸约占20％，磷脂、甾醇等约占4％，不饱和脂肪酸约占75％。蚕蛹油不饱和脂肪酸主要由α- 亚麻酸(约占30％)、亚油酸和油酸组成，具有降低血浆胆固醇、改善肝脏功能等诸多生理学 功能，如：α-亚麻酸具有增长智力、保护视力降低血脂胆固醇、延缓衰老、抗过敏、降血压 及抑制癌症的发生和转移等功效；油酸和亚油酸除了具有生物学功能之外，还可以用作精细 化工、材料化工及生物化工原料。因此，蚕蛹油中的不饱和脂肪酸一直是蚕蛹资源高值化利 用的重点成分。

目前，用于分离生物质中不饱和脂肪酸的方法主要有：(1)根据脂肪酸的不饱和度，即 双键的多少，有脲素包结法、银离子络合法；(2)根据脂肪酸分子量的大小，即碳链的长短， 有分子蒸馏法、超临界流体萃取法；(3)根据脂肪酸在有机溶剂中的溶解度的差异，有低温 结晶法；(4)根据脂肪酸极性的差异以及和不同介质吸引力的大小，有柱色谱法、吸附分离 法、高效液相色谱法等；(5)根据脂肪酶的水解和酯化的选择性催化，分离或富集不饱和脂 肪酸。

按以上分类方法，分析蚕蛹油中不饱和脂肪酸的制备过程研究现状如下：(1)专利CN 101278743公开了采用微波萃取技术与尿素包结相结合的方法从蚕蛹油中制备不饱和脂肪酸 的工艺；(2)专利CN 101624345通过银离子络合吸附剂从蚕蛹混合脂肪酸中一步实现高纯度 α-亚麻酸乙酯的分离；(3)专利ZL 200510095805.X、CN 101100627和CN 1807566公开了以蚕 蛹为原料采用超临界CO2萃取技术制备不饱和脂肪酸含量高的蛹油产品工艺；(4)专利CN 101892119A公开了一种蚕蛹油多不饱和脂肪酸的梯度冷冻结晶分离方法，由蚕蛹预处理、超 声波提取蚕蛹油、制备蚕蛹油混合脂肪酸、配制尿素乙醇溶液、尿素包合处理、梯度冷冻结 晶步骤组成。综上，目前蚕蛹油中不饱和脂肪的制备方法只采用单一的络合分离技术，未见 报道有将络合分离技术偶联的组合络合分离方法用于蚕蛹油中不饱和脂肪酸的制备。

本发明所采用的基于可逆络合反应的复合分离方法具有高效性、高选择性和低能耗等特 点，而且操作简便、成本低廉，可明显提高蚕蛹油中α-亚麻酸等不饱和脂肪酸的纯度和回收 率，为今后规模化制备蚕蛹油中α-亚麻酸、油酸和亚油酸提供理论基础和技术支撑，同时开 拓了一条大规模制备不饱和脂肪酸的新思路和新方法，对于我国传统蚕桑产业提高资源利用 度、延伸产业链具有积极的现实指导意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种基于可逆络合反应的组合络合分离方法，用 于蚕蛹油中高纯度不饱和脂肪酸(α-亚麻酸、亚油酸和油酸)的制备。

技术方案：一种基于可逆反应的组合络合分离蚕蛹油中不饱和脂肪酸的方法，包括制备 蚕蛹油中的混合脂肪酸步骤，组合络合分离蚕蛹油中不饱和脂肪酸的技术模块为如下三个模 块：

(A)脲素包结法：脲素包合物的制备，其中蚕蛹混合脂肪酸与脲素饱和溶液的体积比 范围为1∶1～1∶10，包合时间范围为1～24h，包合温度范围为0～20℃；

(B)β-环糊精包合法：将混合脂肪酸溶于溶剂配置饱和溶液，再与饱和β-环糊精水溶液 搅拌混合，水浴加热振荡获得包合物，低温冷冻，过滤，干燥得β-环糊精包合物；蚕蛹混合 脂肪酸与β-环糊精饱和溶液的体积比范围为1∶5～1∶15，水浴加热温度范围为30～80℃，水浴加 热包合时间范围为0.1～24h；蚕蛹混合脂肪酸与β-环糊精的包合物冷冻温度范围为-20～10℃， 冷冻时间范围为0.1～24h；

(C)包合物加入溶剂，60～90℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.001～0.098Mpa减压抽 滤，真空度0.001～0.098Mpa、温度60～90℃回收溶剂，即得富含α-亚麻酸、油酸和亚油酸的不 饱和脂肪酸，经过衍生化处理后，RP-HPLC检测不饱和脂肪酸的收率和纯度；

具体步骤为：

A+B+C：将混合脂肪酸采用脲素包结法偶联β-环糊精包合法后，解络回收产物，或

B+A+C：将混合脂肪酸采用β-环糊精包合法偶联脲素包结法后，解络回收产物。

溶剂类型为甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、正己烷、环己烷、石油醚、汽油、乙酸乙酯或 乙酸丁酯。

有益效果：本发明采用基于可逆反应的组合络合分离方法，具有高效性、高选择性和低 能耗等特点，操作简便，成本低廉，可明显提高蚕蛹油中α-亚麻酸、油酸和亚油酸等不饱和 脂肪酸的纯度和回收率，为今后规模化制备蚕蛹油系列不饱和脂肪酸产品提供理论基础和技 术支撑，同时开拓了简单、高效大规模制备生物质中不饱和脂肪酸的新思路和新方法，对于 实现我国油脂资源中不饱和脂肪酸产业高值化具有重要的指导意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

制备蚕蛹油中的混合脂肪酸、脲素包合物的制备均参照申请人专利CN 101691519A；

本发明所述实施例中涉及到的混合脂肪酸得率、不饱和脂肪酸及生物柴油的定性定量分 析方法参照专利公开文献CN 101691519A，如下：

(1)蚕蛹油制备的混合脂肪酸得率的计算公式为：

混合脂肪酸得率(％)＝(混合脂肪酸质量/蚕蛹油质量)×100。

(2)α-亚麻酸、亚油酸和油酸等蚕蛹不饱和脂肪酸采用高效液相色谱法定量分析：

色谱条件：HC-C₈色谱柱，柱温30℃，流动相为乙腈∶水＝87∶13(v/v)，流速1.0mL/min， 检测波长242nm。

样品衍生化反应条件：取脂肪酸溶液100μL，加入20g/Lω-溴苯乙酮的丙酮溶液和25g/L 三乙胺的丙酮溶液各50μL，试管加塞密封，混合摇匀，于100℃水浴加热15min，冷却至室 温后，加入乙酸溶液70μL，于100℃水浴加热5min，取出试管，吹干，加入甲醇500μL，0.45μm 微孔滤膜过滤后进样分析。

实施例1：

将蚕蛹混合脂肪酸与脲素的甲醇饱和溶液按体积比1∶1搅拌混合，在0℃包合24h，包 合物冷却结晶，过滤，所得滤液用石油醚萃取，60℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.001Mpa 减压抽滤，真空度0.001Mpa、温度90℃回收溶剂，即得不饱和脂肪酸粗品。将不饱和脂肪 酸粗品溶于乙酸乙酯配置饱和溶液，再与饱和β-环糊精水溶液按体积比1∶5搅拌混合，在30℃ 水浴加热0.1h，振荡获得包合物，在-20℃低温冷冻0.1h，过滤，干燥得β-环糊精包合物。所 得包合物用石油醚萃取，60℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.001Mpa减压抽滤，真空度 0.001Mpa、温度90℃回收溶剂，获得不饱和脂肪酸产品。经HPLC检测，该组合络合分离技 术制备蚕蛹油中不饱和脂肪酸的总纯度和得率分别为32.4％和42.6％，其中α-亚麻酸、亚油 酸和油酸的纯度分别为23.6％、3.5％和5.3％，得率分别为17.8％、14.2％和10.6％。

实施例2：

将蚕蛹混合脂肪酸与脲素的正丁醇饱和溶液按体积比1∶10搅拌混合，在20℃包合1h， 包合物冷却结晶，过滤，所得滤液用正己烷萃取，70℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.098 Mpa减压抽滤，真空度0.098Mpa、温度60℃回收溶剂，即得不饱和脂肪酸粗品。将不饱和 脂肪酸粗品溶于丙酮配置饱和溶液，再与饱和β-环糊精水溶液按体积比1∶15搅拌混合，在80℃ 水浴加热24h，振荡获得包合物，在10℃低温冷冻24h，过滤，干燥得β-环糊精包合物。所 得包合物用石油醚萃取，90℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.098Mpa减压抽滤，真空度 0.098Mpa、温度75℃回收溶剂，获得不饱和脂肪酸产品。经HPLC检测，该组合络合分离技 术制备蚕蛹油中不饱和脂肪酸的总纯度和得率分别为47.2％和54.3％，其中α-亚麻酸、亚油 酸和油酸的纯度分别为31.6％、5.2％和10.4％，得率分别为23.0％、18.9％和12.4％。

实施例3：

将蚕蛹混合脂肪酸与脲素的乙醇饱和溶液按体积比1∶2搅拌混合，在4℃包合2h，包合 物冷却结晶，过滤，所得滤液用石油醚萃取，90℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.090Mpa 减压抽滤，真空度0.090Mpa、温度75℃回收溶剂，即得不饱和脂肪酸粗品。将不饱和脂肪 酸粗品溶于乙醇配置饱和溶液，再与饱和β-环糊精水溶液按体积比1∶9搅拌混合，在60℃水 浴加热1.5h，振荡获得包合物，在-10℃低温冷冻15h，过滤，干燥得β-环糊精包合物。所得 包合物用石油醚萃取，90℃加热回流，水洗并干燥萃取液，真空度0.090Mpa减压抽滤，真 空度0.090Mpa、温度75℃回收溶剂，即得不饱和脂肪酸产品。经HPLC检测，该组合络合 分离技术制备蚕蛹油中不饱和脂肪酸的总纯度和得率分别为86.5％和91.1％，其中α-亚麻酸、 亚油酸和油酸的纯度分别为67.4％、7.8％和12.3％，得率分别为34.8％、40.5％和16.8％。

实施例4：

将蚕蛹混合脂肪酸溶于乙酸丁酯配置饱和溶液，再与饱和β-环糊精水溶液按体积比1∶5 搅拌混合，在30℃水浴加热0.1h，振荡获得包合物，在-20℃低温冷冻0.1h，过滤，干燥得β- 环糊精包合物。所得包合物用石油醚萃取，70℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.001Mpa 减压抽滤，真空度0.001Mpa、温度90℃回收溶剂，即得不饱和脂肪酸粗品。将不饱和脂肪 酸粗品与脲素的甲醇饱和溶液按体积比1∶1搅拌混合，在0℃包合24h，包合物冷却结晶， 过滤，所得滤液用环己烷萃取，60℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.090Mpa减压抽滤， 真空度0.090Mpa、温度60℃回收溶剂，获得不饱和脂肪酸产品。经HPLC检测，该组合络 合分离技术制备蚕蛹油中不饱和脂肪酸的总纯度和得率分别为15.7％和12.4％，其中α-亚麻 酸、亚油酸和油酸的纯度分别为10.1％、1.3％和4.3％，得率分别为6.1％、3.7％和2.6％。

实施例5：

将蚕蛹混合脂肪酸溶于丙酮配置饱和溶液，再与饱和β-环糊精水溶液按体积比1∶15搅拌 混合，在80℃水浴加热24h，振荡获得包合物，在10℃低温冷冻24h，过滤，干燥得β-环糊 精包合物。所得包合物用汽油萃取，80℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.098Mpa减压抽 滤，真空度0.098Mpa、温度60℃回收溶剂，即得不饱和脂肪酸粗品。将不饱和脂肪酸粗品 与脲素的正丁醇饱和溶液按体积比1∶10搅拌混合，在20℃包合1h，包合物冷却结晶，过滤， 所得滤液用正己烷萃取，60℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.001Mpa减压抽滤，真空度 0.001Mpa、温度90℃回收溶剂，获得不饱和脂肪酸产品。经HPLC检测，该组合络合分离技 术制备蚕蛹油中不饱和脂肪酸的总纯度和得率分别为32.4％和36.2％，其中α-亚麻酸、亚油 酸和油酸的纯度分别为18.6％、3.6％和10.2％，得率分别为9.7％、17.5％和9.0％。

实施例6：

将蚕蛹混合脂肪酸溶于乙醇配置饱和溶液，再与饱和β-环糊精水溶液按体积比1∶9搅拌 混合，在60℃水浴加热1.5h，振荡获得包合物，在-10℃低温冷冻15h，过滤，干燥得β-环糊 精包合物。所得包合物用石油醚萃取，70℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.090Mpa减压 抽滤，真空度0.090Mpa、温度75℃回收溶剂，即得不饱和脂肪酸粗品。将不饱和脂肪酸粗 品与脲素的乙醇饱和溶液按体积比1∶2搅拌混合，在4℃包合2h，包合物冷却结晶，过滤， 所得滤液用石油醚萃取，70℃加热回流，水洗萃取液，真空度0.090Mpa减压抽滤，真空度 0.090Mpa、温度75℃回收溶剂，即得不饱和脂肪酸产品。经HPLC检测，该组合络合分离技 术制备蚕蛹油中不饱和脂肪酸的总纯度和得率分别为76.8％和72.5％，其中α-亚麻酸、亚油 酸和油酸的纯度分别为56.8％、6.4％和13.6％，得率分别为18.2％、34.4％和19.9％。