一种香叶天竺葵多倍体的诱导方法

摘要

本发明是一种香叶天竺葵多倍体的诱导方法。将香叶天竺葵（Pelargoniumgraveolens）组培苗的茎尖接入含秋水仙素的培养基中培养后，转入不含秋水仙素的培养基中培养，由于秋水仙素的诱变作用，使茎尖生长点细胞染色体数目加倍，通过对变异单株的多代选择，得到稳定的香叶天竺葵多倍体。本发明的方法具有诱导定向性好、成本低、操作简单、效率高的特点，为香叶天竺葵多倍体育种提供一种可行高效的新方法，这对促进我国香叶天竺葵的育种进程具有重要意义。

说明书

技术领域

    本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是一种香叶天竺葵多倍体的诱导方法。 

背景技术

香叶天竺葵（Pelargonium graveolens）为牻牛儿苗科天竺葵属多年生亚灌木，原产南非，主产留尼汪岛、摩洛哥、阿尔及利亚、法国、埃及等国。我国现已成世界上主产国之一，主产云南，分布在滇西、滇中地区。其茎、叶经水汽蒸馏所得具玫瑰香气的香叶油，是一种用量很大的天然香料，广泛应用于香水、香皂、化妆品和食品。云南香叶油的年产量现约为100吨，约占全世界年产量的50%。由于香叶天竺葵为国外引进的杂种品种，杂种雄花不育，很难得到种子，生产上一直采用扦插繁殖，导致品种单一，单产低，阻碍了优势创汇产业的持续发展。多倍体植株普遍具有器官巨大性、抗性强、新奇变异等特征，且次生代谢物含量增加，是植物育种中重要的种质资源。

据国外文献报道，目前香叶天竺葵得到多倍体植株的方法是：在组织培养过程中，通过对香叶天竺葵叶柄、根、茎段等组织的培养，先诱导愈伤组织再分化出不定芽，从不定芽中筛选得到多倍体植株，但此法后代变异型多、操作过程复杂，需用多种培养基，成本较高。国内至今未见有关香叶天竺葵诱导多倍体的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香叶天竺葵多倍体的诱导方法，该方法使茎尖生长点细胞染色体数目加倍，通过对变异单株的多代选择，得到稳定的香叶天竺葵多倍体。 

本发明是将香叶天竺葵（Pelargonium graveolens）组培苗的茎尖接入含秋水仙素的培养基中培养后，转入不含秋水仙素的培养基中培养，由于秋水仙素的诱变作用，使茎尖生长点细胞染色体数目加倍，通过对变异单株的多代选择，得到稳定的香叶天竺葵多倍体。

具体方法如下：

1、取香叶天竺葵组培苗的茎尖作为多倍体诱导的基础材料；

2、香叶天竺葵多倍体的诱导：切取组培苗的茎尖（长度为0.5～0.8cm，下同），接入含秋水仙素为100～400mg/L的 MS+ NAA0.05～0.15mg/L培养基中常温、自然光下培养30～40天； 

3、香叶天竺葵多倍体的稳定及扩繁：上述培养后的茎尖切除茎尖基部枯的部分，转入不含秋水仙素的同一培养基（MS+NAA0.05～0.15mg/L）上，常温、自然光下培养，每30～35天为一个周期，切取其茎尖进行4～5代的继代培养，获得稳定的多倍体植株，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，对鉴定为多倍体的植株进行扩繁；

4、香叶天竺葵多倍体的生根培养：切取多倍体植株的顶芽接入同一培养基（MS+NAA0.05～0.15mg/L）中生根，在常温、自然光下，培养7～10天，待芽切口周围长满4-5mm放射状根后，进行移栽；

5、香叶天竺葵多倍体的过渡培养：将多倍体的生根苗移栽至下列土中：红土﹕沙 =1﹕1，控制遮荫度50%左右，注意通风保湿，4～5周后，移栽大田。

本发明的香叶天竺葵多倍体的诱导方法与现有技术相比较有以下特点：

1、本发明采用保持遗传稳定性的茎尖，在组织培养条件下，通过化学诱变剂秋水仙素处理后，通过多代单株选择得到目的性明确的多倍体植株。

2、本发明所用的培养基比较简单，从诱导、筛选、扩繁到生根整过程，只用一种培养基，且培养基中只加入NAA一种激素，范围在0.05～0.15mg/L,该培养基既能诱导茎尖基部生成发达根系，又能诱导茎尖上部长高成苗。 

3、本发明采用化学诱变剂秋水仙素诱导茎尖后，经多代单株继代培养后便可得到稳定的多倍体植株；

本发明的方法具有诱导定向性好、成本低、操作简单、效率高的特点，为香叶天竺葵多倍体育种提供一种可行高效的新方法，这对促进我国香叶天竺葵的育种进程具有重要意义。

具体实施方式

实施例1

按以下步骤进行：

1、取云南宾川地区大田中的香叶天竺葵（Pelargonium graveolens），经组织培养获得稳定的组培苗，以组培苗的茎尖作为多倍体诱导的基础材料；

2、香叶天竺葵多倍体的诱导：切取组培苗的茎尖（长度为0.5～0.8cm，下同），接入含秋水仙素为100mg/L的 MS+ NAA0.05mg/L培养基中常温、自然光下培养40天；

3、香叶天竺葵多倍体的稳定及扩繁：上述培养后的茎尖切除茎尖基部枯的部分，转入不含秋水仙素的同一培养基（MS+NAA0.05mg/L）上，常温、自然光下培养，每35天为一个周期，切取长高单株的茎尖进行4代的继代培养，获得稳定的多倍体植株，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，对鉴定为多倍体的植株进行扩繁；

4、香叶天竺葵多倍体的鉴定：

1）气孔鉴定：对形态上变异明显的植株，撕取叶片下表皮制片，然后于OLYMPUS显微镜下观察测量气孔大小，以气孔显著增大来作为变异的初步鉴定指标；

2）染色体鉴定：对气孔显著增大的变异株，取根尖，采用改良苯酚品红染色法制片（染色体制片按朱徽1996发表的方法进行），然后在显微镜下观察并摄像，根据染色体数判断其倍性， 

5、香叶天竺葵多倍体的生根培养：切取多倍体植株的顶芽接入MS+NAA0.05mg/L培养基中生根，在常温、自然光下，培养7～10天，待芽切口周围长满4-5mm放射状根后，进行移栽；

6、香叶天竺葵多倍体的过渡培养：将多倍体的生根苗移栽至下列土中：红土﹕沙 =1﹕1，控制遮荫度50%左右，注意通风保湿，4～5周后，移栽大田。

实施例2：

按以下步骤进行：

1、同实施例1；

2、香叶天竺葵多倍体的诱导：切取组培苗的茎尖，接入含秋水仙素为200mg/L的 MS+ NAA0.1mg/L培养基中常温、自然光下培养35天；

3、香叶天竺葵多倍体的稳定及扩繁：上述培养后的茎尖切除茎尖基部枯的部分，转入不含秋水仙素的同一培养基（MS+NAA0.1mg/L）上，常温、自然光下培养，每33天为一个周期，切取长高单株的茎尖进行4代的继代培养，获得稳定的多倍体植株，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，对鉴定为多倍体的植株进行扩繁；

4、同实施例1；

5、香叶天竺葵多倍体的生根培养：切取多倍体植株的顶芽接入MS+NAA0.1mg/L培养基中生根，在常温、自然光下，培养7～10天，待芽切口周围长满4-5mm放射状根后，进行移栽；

6、同实施例1。

实施例3：

按以下步骤进行：

1、同实施例1；

2、香叶天竺葵多倍体的诱导：切取组培苗的茎尖，接入含秋水仙素为400mg/L的 MS+ NAA0.15mg/L培养基中常温、自然光下培养30天；

3、香叶天竺葵多倍体的稳定及扩繁：上述培养后的茎尖切除茎尖基部枯的部分，转入不含秋水仙素的同一培养基（MS+NAA0.15mg/L）上，常温、自然光下培养，每30天为一个周期，切取长高单株的茎尖进行5代的继代培养，获得稳定的多倍体植株，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，对鉴定为多倍体的植株进行扩繁；

4、同实施例1；

5、香叶天竺葵多倍体的生根培养：切取多倍体植株的顶芽接入MS+NAA0.15mg/L培养基中生根，在常温、自然光下，培养7～10天，待芽切口周围长满4-5mm放射状根后，进行移栽；

6、同实施例1。