基于瓜环主-客体作用的改性壳聚糖温敏超分子凝胶及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一种

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于瓜环主-客体作用的改性壳聚糖温敏超分子凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

超分子凝胶是指凝胶因子通过非共价键互相作用，自组装形成三维网络结构的物理凝胶体系。基于主客体相互作用的超分子凝胶是其中一个重要分支，这类超分子凝胶借助主体与客体间的包合作用，构筑形成大分子组装交联，从而形成纤维网络结构。具可逆的组装-去组装性能、对外界刺激响应性、无化学交联剂毒性的特点，在生物医用、物质分离、生物传感器构建、聚合物超分子组装及药物缓控释载体等方面表现出巨大的应用潜力^[1]。其中与环糊精相关的超分子凝胶已经有较多文献报道^[2-5]。近年，有关瓜环的超分子凝胶的文献也有报道，Kim等^[6]报道了基于瓜环体系的水凝胶因子，研究发现通过改变体系pH或加入客体分子可引发凝胶化。Yang等^[7]以六元瓜环为主体，通过六元瓜环与对甲苯磺酸丁基胺盐的主客体相互作用，在水溶液中得到一种温敏型超分子水凝胶。Oren等^[8]研究了以八元瓜环为主体的超分子水凝胶，将甲基紫精和萘连接到聚合物上，并将得到的两类聚合物水溶液混合，向混合溶液中加入八元瓜环后，三者交联形成纤维网络结构，表现为多重刺激响应型超分子水凝胶。

壳聚糖(Chitosan，CS)是自然界大量存在的天然氨基碱性多糖。壳聚糖-甘油磷酸盐体系具有热固温敏凝胶特点^[9]。壳聚糖及其衍生物具有良好的生物相容性和可降解性，在医药、生物材料等领域有广泛应用^[10,11]。基于瓜环主-客体作用的改性壳聚糖温敏超分子凝胶未见报道，该温敏超分子凝胶体系在生物医用、物质分离、生物传感器构建、聚合物超分子组装，药物缓控释载体等具有重大应用价值。

参考文献：

[1] Sangeetha N M and Maitra U．Supramoleeular gels：Functions and Uses[J]．Chemical Society Reviews，2005，34：821-836。

[2] 严军林,刘静,陈希,房喻.基于主客体作用的多重刺激响应型超分子水凝胶的制备及性能[J].高等学校化学学报,2008,29(1):124-129。

[3] Charlot A and Rachel A V. Synthesis of novel supramolecular assemblies based on hyaluronic acid derivatives bearing bivalent β-cyclodextrin and adamantane moieties[J]. Macromolecules,2007,40:1147-1158。

[4] Rachel A V and Marguerite R. New supramolecular assemblies of a cyclodextrin-

grafted chitosan through specific complexation[J].  Macromolecular,2002,35:

7955-7962。

[5] Manakker F,Vermonden T,Morabit N,et al. Rheological behavior of assembling PEG-β-cyclodextrin/PEG-cholesterol hydrogels[J]. Langmuir,2008,24:12559-12567。

[6] Hwang I,Jeon W S,Kim H J,et al. Cucurbit[7]uril: A simple macrocyclic,pH-

triggered hydrogelator exhibiting guest-induced stimuli-responsive behavior [J]. Angew.Chem.Int.Ed. 2007,46:210-213。

[7] Yang H,Tang Y B,Wang Y X. Fabrication and properties of cucurbit[6]uril induced thermo-responsive supramolecular hydrogels [J]. Soft Matter. 2009,5:3511-3216。

[8] Eric A.Appel,Frank Biedermann,Urs Rauwald,et al. Supramolecular cross-linked networks via host-guest complexation with cucurbit[8]uril [J]. J.Am.Chem.Soc. 2010,132:14251-14260。

[9] Chenite A, Chaput C, Wang D, et al. Novel injectable neutral solutions of chitosan form 

biodegradable gels in situ[J]. Biomaterials, 2000, 21: 2155-2161。

[10] Wu J,Wei W,Wang LY,et al.A thermosensitive hydrogel based on quaternized chitosan and poly(ethylene glycol)for nasal drug delivery system[J].

Biomaterials,2007,28(13):2220-2232。

[11] Zhao X L,Li K X,Zhao X F,et al．Study on colon-specific 5-Fu pH-enzyme Di-dependent chitosan microspheres[J].Chem Pharm Bull(Tokyo),2008,56(7):963-

968。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于瓜环主-客体作用的改性壳聚糖温敏超分子凝胶及其制备方法和应用。

本发明的目的是这样实现的，所述的基于瓜环主-客体作用的改性壳聚糖温敏超分子凝胶，其特征在于是由壳聚糖侧链改性后得到的改性壳聚糖及其氮原子质子化后得到的盐，其结构式如下：

                                                       

其中X=20~1200，y=5~1200。

所述的壳聚糖是指分子量范围0.3万~20万，脱乙酰度60%~100%的壳聚糖。

所述的瓜环为下式结构式中的一种或多种混合物：

本发明所述的基于瓜环主-客体作用的改性壳聚糖温敏超分子凝胶的制备方法，包括如下步骤：1）配制体积分数为0.1%~2%的壳聚糖溶液，室温下充分溶胀12h~48h，搅拌下向壳聚糖溶液中滴加溶有芳香醛或取代芳香醛的乙醇或甲醇溶液，0.5 h~1h内滴加完毕，继续在50℃~70℃条件下搅拌反应3h~5h；冷却至室温，缓慢加入还原剂NaBH₄或LiAlH₄中的一种，于室温下搅拌反应3h~5h；反应结束后，向反应液中加入5~10倍壳聚糖溶液重量的丙酮，析出絮状沉淀，过滤，产物用丙酮多次洗涤，干燥，得改性壳聚糖；2）将步骤1）获得的改性壳聚糖配制成体积分数为0.1%~10%的溶液，再加入相当于改性壳聚糖质量1wt%~50wt%的瓜环，充分搅拌均匀，于4℃~30℃条件下静置0.5h~12h得到凝胶，凝胶态在40℃~70℃下受热1~30min转化为溶胶态，溶胶态在4℃~30℃条件下静置0.5h~12h又得到凝胶态。 

所述的改性壳聚糖溶液是指在pH为1~7范围内配制的体积分数为0.1%~10%的水溶液。

所述的溶有芳香醛或取代芳香醛的乙醇或甲醇溶液的百分比浓度为1%~100%。

本发明所述的基于瓜环主-客体作用的改性壳聚糖温敏超分子凝胶在聚合物超分子组装，制备药物缓控释载体中的应用。

本发明的优点：本发明通过侧链修饰反应制得多种改性壳聚糖。通过瓜环与改性壳聚糖侧链客体之间的超分子组装交联，制得超分子凝胶。在受热（40℃~70℃）状态下，因为超分子作用的去组装转为溶胶态，凝胶具有可逆的温度敏感性特点。该凝胶在生物医用、物质分离、生物传感器构建、聚合物超分子组装，药物缓控释载体等领域具有应用价值。

附图说明

图1是本发明的CS与G1的红外光谱图。

图2是本发明的CS与G2的红外光谱图。

图3是本发明的CS与G3的红外光谱图。

图4是本发明的壳聚糖及其三种衍生物的紫外吸收谱图。

图5是本发明的Q[8]-G1凝胶体系示意图。

图6是本发明的Q[8]-G2凝胶体系示意图。

图7是本发明的Q[8]-G3凝胶体系示意图。

图8是本发明的Q[8]-G1凝胶体系网络结构电镜扫描图。

图9是本发明的Q[8]-G2凝胶体系网络结构电镜扫描图。

图10是本发明的Q[8]-G3凝胶体系网络结构电镜扫描图。

图11是本发明的Q[8]-G1载药凝胶的累积释放曲线图。

图12是本发明的Q[8]-G2载药凝胶的累积释放曲线图。

图13是本发明的Q[8]-G3载药凝胶的累积释放曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明：

一、实验步骤

1．壳聚糖改性：配制体积分数为0.1%~2%的壳聚糖（简称CS）溶液，室温下充分溶胀12h~48h，搅拌下向壳聚糖溶液中滴加溶有（取代）芳香醛的乙醇（或甲醇）溶液（百分比浓度为1%~100%），0.5 h~1h内滴加完毕，继续在50℃~70℃条件下搅拌反应3h~5h。冷却至室温，缓慢加入还原剂（NaBH₄，LiAlH₄中的一种），于室温下搅拌反应3h~5h。反应结束后，向反应液中加入5~10倍壳聚糖溶液重量的丙酮，析出絮状沉淀，过滤，产物用丙酮多次洗涤，干燥，得改性壳聚糖。

改性壳聚糖经红外光谱（IR）、紫外可见吸收光谱（UV）表征。

2.凝胶制备：改性壳聚糖配制成体积分数为0.1%~10%的溶液（溶液pH为1~7），再加入相当于改性壳聚糖质量1%~50%的瓜环（简称Q[n]，n=6,7,8,10），充分搅拌均匀，于4℃~30℃条件下静置0.5h~12h得到凝胶。凝胶态在40℃~70℃下受热1min~30min可转化为溶胶态，4℃~30℃条件下静置0.5h~12h又得到凝胶态。

凝胶网状结构经扫描电镜（SEM）表征。

二、具体实例

1.改性壳聚糖的合成实例：

合成路线如下：

    其中X=20~1200，y=5~1200。

（1） N-(4-吡咯烷基苯甲基)壳聚糖(以下简称G1)的合成：

称取0.8g壳聚糖，溶于80mL体积分数为2%的醋酸溶液中，室温下充分溶胀；向壳聚糖溶液中滴加溶有0.9g 4-（1-吡咯烷)苯甲醛的20 mL乙醇溶液（即20 mL乙醇中含有0.9g  4-（1-吡咯烷)苯甲醛），30 min内滴加完毕。50℃条件下加热搅拌反应5h后，冷却至室温，缓慢滴加溶有1g NaBH₄的10 mL水溶液，于室温下搅拌反应5h。反应结束后，向反应液中加入500 mL丙酮，析出絮状沉淀，过滤，产物用丙酮多次洗涤，干燥得棕色固体。

（2） N-(4-二乙氨基苯甲基)壳聚糖(以下简称G2) 的合成：

称取0.8g壳聚糖，室温下溶于80mL体积分数为2%的醋酸溶液中，充分溶胀；向壳聚糖溶液中滴加溶有0.9g  4-二乙氨基苯甲醛的20 mL乙醇溶液（即20 mL乙醇中含有0.9g  4-二乙氨基苯甲醛），30 min内滴加完毕。50℃条件下加热搅拌反应5h后，冷却至室温，缓慢滴加溶有1g NaBH₄的10 mL水溶液，于室温下搅拌反应5h。反应结束后，反应液中加入500 mL丙酮，析出絮状产物，过滤，产物用丙酮多次洗涤，干燥得土黄色固体。

（3） N-(4-二甲氨基苯甲基)壳聚糖(以下简称G3) 的合成：

将0.8g壳聚糖溶于80 mL体积分数为2%的醋酸溶液中，室温下充分溶胀；向壳聚糖溶液中滴加溶有0.75g 4-二甲氨基苯甲醛的20 mL乙醇溶液（即20 mL乙醇中含有0.9g  4-二甲氨基苯甲醛）。50℃条件下加热搅拌反应5h后，冷却至室温，缓慢滴加含有1g NaBH₄的10 mL水溶液，于室温搅拌反应5h。反应完毕后向反应液中加入500 mL丙酮，析出絮状沉淀，静置后过滤，产物用丙酮多次洗涤，干燥收集得黄色固体。

2.改性壳聚糖/八元瓜环凝胶的制备实例：

称取0.2g 项目（1）中制备的G1置于小试剂瓶中，加入2mL 浓度为1mol/L的盐酸溶液，搅拌充分溶解，再加入0.05g八元瓜环（以下简称Q[8]），继续搅拌均匀，然后于4℃条件下，静置10h得到凝胶（Q[8]-G1凝胶体系）。

按同法、同样反应条件、同剂量的反应物，只是把G1替换为G2制备Q[8]-G2凝胶体系，同理把G1替换为G3制备Q[8]-G3凝胶体系。

3.改性壳聚糖-八元瓜环凝胶的载药凝胶制备实例：

称取0.2g 项目（1）中制备的G1置于小试剂瓶中，加入2mL 浓度为1mol/L的盐酸溶液，加入5mg 5-氟尿嘧啶（以下简称5-Fu），搅拌充分溶解，再加入0.05g八元瓜环（以下简称Q[8]），继续充分搅拌均匀，然后于4℃条件下，静置10h得到凝胶（Q[8]-G1载药凝胶）。

按同法、同样反应条件、同剂量的反应物，只是把G1替换为G2制备Q[8]-G2载药凝胶，同理把G1替换为G3制备Q[8]-G3载药凝胶。

三、结果

1.改性壳聚糖红外光谱图，图1为壳聚糖（CS）及N-(4-吡咯烷基苯甲基)壳聚糖(G1)的红外光谱图。与CS比较，G1的IR图中在1370cm^-1附近出现了强吸收峰，为C-N振动的特征吸收峰，表明在壳聚糖中C2位氨基上发生取代，生成了N-(4-吡咯烷基苯甲基)壳聚糖。另外在740 cm^-1 ~661 cm^-1处为多取代苯环的C-H面外弯曲振动特征吸收峰，1602 cm^-1和1522 cm^-1为苯环C-C骨架振动的特征吸收峰，说明有苯环的存在。

G2、G3红外光谱图分别如图2、图3。同理，表明在壳聚糖中C2位氨基上发生取代，生成了N-(4-吡咯烷基苯甲基)壳聚糖，说明有苯环的存在。附表1为三种改性壳聚糖红外谱图常数。  

 表1 三种改性壳聚糖红外谱图常数

2.改性壳聚糖紫外吸收谱图，称取壳聚糖（CS）及其衍生物，均用0.1mol/L盐酸溶解，制备浓度均为0.5g/L的CS、G1、G2、G3溶液，扫描四种物质的紫外吸收光谱。

根据图4可知，CS无明显的紫外吸收峰；与CS比较，G1的紫外光谱中出现了苯环的特征吸收谱带，λmax=204nm为苯环的π-π^*跃迁所致E2带吸收，而λmax=256nm的吸收峰为带有吡咯烷基的苯环π-π^*跃迁(B带)的特征吸收峰，证明在CS的侧链上引入了苯环，而在418nm附近有最大吸收峰，判断可能为连接在苯环上的吡咯烷基的紫外吸收。

G2、G3也出现苯环E2带吸收，分别在207.5nm、209.5nm有最大吸收峰，二者在249nm、256nm处有苯环的π-π^*跃迁所致B带吸收峰。

3.温敏凝胶示意图，图5为Q[8]与G1作用所形成的凝胶照片，该凝胶呈紫色不透明状。实验发现，G1溶液为红棕色液体，而加入Q[8]后，颜色变为紫色，并呈现凝胶态。该凝胶在55℃条件下加热，可使体系从凝胶态转变为紫红色溶液，冷却后体系又可恢复为凝胶态。此过程可重复多次，表明实验所制备的凝胶具有一定的热可逆性。

图6为Q[8]-G2凝胶体系的照片，G2溶液为淡黄色透明液体，加入Q[8]之后，形成黄色不透明状凝胶态。该凝胶在50℃条件下加热，使体系转变为溶液态，且溶液呈淡黄色不透明稠状液，冷却后又可恢复凝胶态，故该体系凝胶具有热可逆性。

图7为Q[8]-G3凝胶示意图，G3溶液呈亮黄色透明液体，加入Q[8]后呈黄色凝胶。而且Q[8]-G3凝胶体系亦具有热可逆性，将此凝胶加热（50℃）也可使其转变为溶液态，且溶液呈棕黄色稠状液，冷却后又可恢复凝胶态。

4.凝胶网络结构电镜扫描（SEM）表征图：图8、图9、图10的Q[8]-G凝胶体系网络结构电镜扫描图均显示凝胶具有明显的网状交联结构特征。

四、结论

壳聚糖侧链改性，引入适当的客体结构单元，侧链客体与瓜环之间主-客体超分子组装而发生凝胶化，该凝胶具有可逆的温度敏感性特点。

五、具体应用实例：

    以5-Fu为模型药物，载药凝胶体外药物缓释的应用实例：

采用恒温振荡法测定含5-Fu的G1-Q[8]载药凝胶体外释药行为。将5mg 5-Fu、项目二（2）中制得的G1-Q[8]空白凝胶、以及项目二（3）中制得的G1-Q[8]载药凝胶样品3份（每份凝胶高5mm×宽10mm，均含5-Fu 5mg）分别置于透析袋内，扎紧袋口后置于盛有50mL人工胃液（pH1.2的盐酸溶液）或人工肠液（pH6.86磷酸盐缓冲溶液）的恒温振荡器中，在温度为（37±0.5）℃，转速为100r/ min条件下振荡，分别于5，15，25，45，70，100，130，180，280，400 min后的时间点每次取样1ml（同时补充同体积的新鲜释放介质），稀释25倍，取上清液于265nm波长处测定吸光度A，根据标准曲线方程计算药物浓度和累积释放度（取3份样品的平均值），以药物累积释放度对时间作图，绘制5-Fu的累积释药曲线。得到G1-Q[8]载药凝胶体外释药曲线（见图11）。

按同法、同样条件、同剂量的药物5-Fu，只是把G1-Q[8]载药凝胶替换为G2-Q[8]载药凝胶测定G2-Q[8]载药凝胶的体外释药曲线（见图12），同理把G1-Q[8]载药凝胶替换为G3-Q[8]载药凝胶测定G3-Q[8]载药凝胶的体外释药曲线（见图13）。

图11显示，5-Fu原药的释放受介质pH值变化影响不大，且其释放十分快速，70min时在人工肠液（pH6.86）和人工胃液（pH1.2）中的累积释放度分别达到94.57%和95.36%。G1-Q[8]载药凝胶在人工肠液中70min的累积释放度为82.99%，之后药物基本不再释放，而在人工胃液中，G1-Q[8]载药凝胶药物释放速度明显慢于原药，70min时累积释放度仅为43.95%，到400min时药物释放度为71.69%。

图12显示G2-Q[8]载药凝胶在人工肠液（pH6.86）中也释放较快，70min时达到85.26%，100min后不再释放；在pH=1.2的人工胃液中，G2-Q[8]载药凝胶的药物释放缓慢，70min时释放度为31.22%，400min时也仅为67.27%。

图13显示G3-Q[8]载药凝胶在人工肠液（pH6.86）中药物释放也较快，70min时累积释放度为88.96%，400min时达到97.91%。在人工肠液（pH6.86）中G3-Q[8]凝胶对5-Fu的无明显缓释作用，但在人工胃液（pH1.2）中，G3-Q[8]凝胶对5-Fu有明显的缓释作用，G3-Q[8]载药凝胶的累积释放度在70min为54.31%，400min时为67.98%，药物释放曲线平稳上升。

通过实验发现，在人工肠液（pH6.86）条件下，三种凝胶对5-Fu无明显的缓释作用，药物仍然表现为快速释放，并很快达到释放完全，而在人工胃液（pH1.2）中，G1-Q[8]载药凝胶、G2-Q[8]载药凝胶及G3-Q[8]载药凝胶凝胶均对5-Fu有明显的缓释作用。这可能与人工模拟介质pH不同有关，碱性条件下，形成超分子凝胶的相互作用力减弱，易导致凝胶结构被破坏，凝胶分解从而失去对药物的包埋作用，药物很快释放完全，在酸性介质中，超分子凝胶间的作用力不减弱，凝胶结构保持完整，凝胶包埋的药物通过在凝胶扩散实现平稳释放，并表现出明显的缓释效果，且具有一定的pH敏感释放的特点。