一种去氢二异丁香酚单体的分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种从肉豆蔻中提取分离去氢二异丁香酚单体的方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。它是以肉豆蔻为原料进行乙醇提取、乙酸乙酯萃取、以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯作为洗脱剂的硅胶柱分离、流动相为甲醇-水，检测波长为274nm的高效液相色谱柱分离、产品回收等步骤。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量去氢二异丁香酚单体的高纯度分离制备，得到的去氢二异丁香酚单体纯度高，可作为含量测定的对照品使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物化合物单体的制备方法，具体涉及从肉豆蔻中提取分离去氢二异丁香酚单体的方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。

背景技术

肉豆蔻，肉豆蔻科肉豆蔻属植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥种仁。主产于马来西亚、印度尼西亚；我国广东、广西、云南亦有栽培。该种为热带著名的香料和药用植物。冬、春两季果实成熟时采收。其种仁入药，可治虚泻冷痢、脘腹冷痛、呕吐等；外用可作寄生虫驱除剂，治疗风湿痛等。去氢二异丁香酚为肉豆蔻中特征性化学成分，其英文名Dehydrodiisoeugenol，分子式为C₂₀H₂₂O₄⁺，分子量为326.39，属于木脂素类化合物，其结构式如下:

                                   

去氢二异丁香酚是肉豆蔻中特征性化学成分，2010年版中国药典以去氢二异丁香酚为鉴别肉豆蔻药材标准的唯一依据。

但是，发明人通过查阅大量文献发现，目前只有对去氢二异丁香酚常规结晶的文献介绍，但都不能很好的将高纯度去氢二异丁香酚的分离出来。因此，迄今为止，尚没有从肉豆蔻中制备有效成分去氢二异丁香酚的成熟工艺报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的缺陷，提供一种从肉豆蔻中提取分离去氢二异丁香酚单体的方法。该方法操作简便，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现去氢二异丁香酚单体的工业化分离制备，得到的去氢二异丁香酚单体纯度高，可达到99.5%以上。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种去氢二异丁香酚单体的分离纯化方法，它是以肉豆蔻为原料进行提取、萃取、硅胶柱分离和制备回收而得，其具体工艺步骤如下：

A、提取：

将干燥的肉豆蔻粉碎成粗粉，按药材重量与乙醇体积比为1:8～10加入质量百分比浓度为95%的乙醇溶液，加热回流提取，共提取3次，每次2～3小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待下一步进行萃取处理；

B、萃取：

于步骤A所得浓浸膏的体积加入1倍体积的水（80℃）稀释，再加入与稀释后的浸膏水溶液1倍体积的乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并乙酸乙酯层，用旋蒸蒸发器55℃浓缩至成流浸膏，加入所得浸膏重量5倍的60～80目硅胶拌样干燥备硅胶柱分离；

C、硅胶柱分离：

根据步骤B所得拌样样品重量，称取10倍重量的200～300目硅胶，用洗脱剂拌匀装入玻璃层析柱中，用洗脱剂沉降，流速恒定为止；将步骤B中干燥好的硅胶样品，装入玻璃层析柱中，用洗脱剂洗脱，根据TLC检测收集去氢二异丁香酚产品段，回收洗脱剂，得白色絮状固体；

所述洗脱剂由石油醚（60-90℃）与乙酸乙酯按6:1体积比组成。

D、高效液相制备分离：

取步骤C所得的固体，用二甲基甲酰胺（DMF）按1g:10ml溶液溶解、过滤，进行去氢二异丁香酚单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集去氢二异丁香酚单体的制备馏分溶液，得去氢二异丁香酚单体溶液；

所述高效液相分离采用填料为C18的色谱柱；流动相组成为：按体积比，甲醇：水=75:25，检测波长为274nm。

E、产品回收：

将步骤D高效制备液相色谱分离得到的去氢二异丁香酚单体溶液加热回收甲醇，去氢二异丁香酚在剩余液体中会析出成絮状晶体，用漏斗过滤，所得絮状晶体放置进烘箱55℃干燥即得到去氢二异丁香酚单体产品。

本发明的优点在于：

1、步骤少，耗时短，能大大缩短生产周期，节约生产成本。

2、溶剂消耗少，制备液相色谱分离步骤中的溶剂都可回收再利用。

3、制得的去氢二异丁香酚单体纯度高，达99.5%以上，可作为含量测定的对照品使用。

4、经济效益好，能进行大规模生产，且工序简便，易于控制，分离效率高。

附图说明

图1为本发明实施例1产品的HPLC图谱

图2为本发明实施例1步骤D制备液相图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

下述各实施例中，终产品去氢二异丁香酚单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）法，色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:水（75:25）为流动相；柱温30℃；流速1.0ml/min；检测波长为274 nm。

实施例1

一种去氢二异丁香酚单体的分离纯化方法，它是以肉豆蔻为原料进行提取、萃取、硅胶柱分离和制备回收而得，其具体工艺步骤如下：

A、提取：

将干燥的肉豆蔻1kg粉碎成粗粉，装入体积10L的提取罐中，加入质量百分比浓度为95%的乙醇溶液8L，加热回流提取，共提取3次，每次3小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待下一步进行萃取处理；

B、萃取：

于步骤A所得的浸膏加入1倍体积量的水（80℃）进行稀释，共得溶液1.6L，加入等量体积的乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并收集乙酸乙酯层，在55℃旋转蒸发器中回收至浸膏状，加入所得浸膏5倍重量的60～80目硅胶（50克），拌样干燥后得硅胶样品60克；

C、硅胶柱分离：

称取600g 200～300目硅胶，用石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯（6:1）组成的洗脱剂拌匀，装入备好的直径10cm高70cm的玻璃层析柱中，用石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯（6:1）组成的洗脱剂沉降，流速恒定为止；将步骤B中干燥好的硅胶样品62克，装入层析柱中，用石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯(6:1)组成的洗脱剂洗脱，根据TLC检测收集去氢二异丁香酚产品段，回收洗脱剂，得白色状固体1.8克；

所述洗脱剂由石油醚（60-90℃）与乙酸乙酯按6:1体积比组成。

D、高效液相制备：

取步骤C所得的1.8g白色固体加入18mL的DMF充分溶解，过滤除去不溶性杂质，滤液进样，紫外检测器在线监测，针对性收集去氢二异丁香酚单体的制备馏分溶液，得去氢二异丁香酚单体溶液；

所述高效液相分离采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶（C18）的色谱柱，柱规格为50cm×8cm；流动相组成为：甲醇：水（体积比）=75:25；检测波长为274nm；室温下操作。

E、产品回收：

将步骤D高效制备液相色谱分离得到的去氢二异丁香酚单体溶液用减压旋蒸55℃浓缩至无甲醇，去氢二异丁香酚单体在剩余水相中析出的白色絮状晶体，用漏斗过滤收集沉淀，去氢二异丁香酚产品放置进烘箱中55℃干燥，烘干后得到去氢二异丁香酚单体产品1.1克。

整个生产流程用时约5天。

计算得产品收率为（1.1/1000）×100%=0.11%。

通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.56%。

实施例2

一种去氢二异丁香酚单体的分离纯化方法，它是以肉豆蔻为原料进行提取、萃取、硅胶柱分离和制备回收而得，其具体工艺步骤如下：

A、提取：

将干燥的肉豆蔻10kg粉碎成粗粉，装入体积100L的提取罐中，加入质量百分比浓度为95%的乙醇溶液80L，加热回流提取3次，每次3小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得10L浓浸膏待进行下一步萃取处理；

B、萃取：

于步骤A所得的浸膏加入10L的水（80℃）进行稀释，共得溶液20L，加入等量体积（20L）的乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并收集乙酸乙酯层，在55℃旋转蒸发器中浓缩回收至浸膏状，加入浸膏5倍重量的60-80目硅胶（775克）拌样干燥得硅胶样品930克；

    C、硅胶柱分离：

称取9.3kg 200-300目硅胶用石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯(6:1)拌匀，装入3根备好的直径15cm高120cm的玻璃层析柱中，用石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯(6:1)沉降，流速恒定为止；将步骤B中干燥好的硅胶样品930克，分3批均匀装入层析柱中，用石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯(6:1)洗脱，根据TLC检测收集去氢二异丁香酚产品段，回收石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯(6:1)，得白色状固体24克，待下一步制备。

D、高效液相制备：

采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶（C₁₈）的色谱柱，柱规格为50cm×10cm；

流动相组成为：甲醇：水（75:25）。

检测波长为274nm；室温下操作。

取步骤C所得的24g白色固体加入240ml的DMF充分溶解，过滤除去不溶性杂质，滤液进样，紫外检测器在线监测，针对性收集去氢二异丁香酚单体的制备馏分溶液，得去氢二异丁香酚单体溶液。

E、产品回收;

 将步骤D高效制备液相色谱分离得到的去氢二异丁香酚单体溶液用减压旋转蒸发器55℃浓缩至无甲醇，样品在剩余水相中析出白色絮状晶体，用漏斗过滤收集沉淀，放置进烘箱中55℃干燥，即得到去氢二异丁香酚单体产品，烘干后得到产品13.8克.

整个生产流程用时约15天。

计算得产品收率为（13.8/10000）×100%=0.138%。

通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.68%。