用于通过N-酰基或N-胍基保护的1,4-丁二胺前体制备1,4-丁二胺的方法

摘要

本发明涉及用于制备1，4-二氨基丁烷[DAB]的新颖方法。根据本发明的方法涉及至少一个生物催化步骤，所述生物催化步骤包括以生物催化的方式生产至少一种DAB的N-保护的前体。本发明还涉及用于制备DAB的方法，所述方法涉及至少一个生物催化步骤，并且包括步骤a)以生物催化的方式制备DAB的N-保护的前体，得到含有DAB的N-保护的前体的生物催化反应混合物，b)从生物催化反应混合物中回收N-保护的前体，和c)将N-保护的前体转化成DAB。更特别地，本发明涉及用于制备DAB的方法，其中至少DAB的N-保护的前体选自由N5-保护的鸟氨酸、N-保护的DAB和N-保护的4-氨基丁醛组成的组。

说明书

本发明涉及用于制备1，4-二氨基丁烷[DAB]的方法，所述方法涉及至 少一个生物催化步骤。

化合物DAB是一种重要的原材料，用于生产一些主要的工程塑料： 聚酰胺-4，6，所述聚酰胺-4，6是均聚物的形式，或是共聚物，例如与约5 wt.％的聚酰胺-6单体(己内酰胺)的共聚物。均聚物聚酰胺-4，6(尼 龙-4，6)早在1938年已被描述过(US-A-2,130,948，Carothers)。其为单体 DAB和己二酸的缩聚产物。目前，特别地，聚酰胺-4，6化合物被荷兰的 DSM生产并以商品名STANYL出售。

对DAB的合成而言，已知大量化学途径。这些化学途径受累于下述 缺点：起始材料必须得自被认为是不可更新的来源。然而，存在提供从可 更新的碳源开始并使用生物化学方法(也称作“生物转化”)合成DAB 的新的可行途径的重大需要。

涉及至少一个发酵步骤的用于制备DAB的方法已描述于作为 WO2006/005603和WO2006/00504公开的PCT申请中。两个文件均描述了 在具有提高的鸟氨酸脱羧酶活性水平的微生物中发酵生产DAB。

本发明的方法涉及用于制备DAB的替代性方法。根据本发明的方法 涉及至少一个生物催化步骤，所述生物催化步骤包括生物催化生产至少一 种DAB的N-保护的前体，随后将所述N-保护的前体体外转化成DAB。

已经发现在生物催化生产后回收DAB遇到了相当大的困难。在 WO2007/079944中描述了对有机胺(例如DAB)的回收。在本文所述的 一个特别的实施方案中，将含有胺的硫酸盐或磷酸盐(因此例如为DAB- 重硫酸盐)的无细胞发酵液浓缩，并添加碱(例如氨)。根据条件形成两 层体系。可以从主要含有有机化合物的层中回收想要的胺。

发明详述

根据一个实施方案，用于制备DAB的方法涉及至少一个生物催化步 骤，并且包括以下步骤：(a)以生物催化的方式制备DAB的N-保护的前 体，得到含有DAB的N-保护的前体的生物催化反应混合物，b)从生物催 化反应混合物中回收N-保护的前体，和c)将N-保护的前体转化成 DAB。

根据一个特别的实施方案，用于生产DAB的本发明涉及至少一个生 物催化步骤，所述生物催化步骤包括以生物催化的方式生产至少一种DAB 的N-保护的前体，所述DAB的N-保护的前体选自由N⁵-保护的鸟氨酸、 N-保护的DAB和N-保护的4-氨基丁醛组成的组，随后将所述N-保护的前 体体外转化成DAB。

“体外转化”在本文中表示在细胞外的介质中将DAB的N-保护的前 体转化成DAB。体外转化可以是至少一种生物催化剂催化的转化，或者可 以是涉及至少一个化学步骤的化学转化，或者可以是至少一个生物催化步 骤和至少一个化学步骤的组合。

“DAB的N-保护的前体”在本文中表示下述化合物，所述化合物含 有保护的氨基，并且可以通过至少一个化学反应或生物催化反应或通过化 学反应与生物催化反应的组合被转化成DAB。

“N⁵-保护的鸟氨酸”在本文中表示在其N⁵原子上具有保护基的鸟氨 酸分子；“N-保护的DAB”在本文中表示在其一个氨基上具有保护基团 的DAB分子；“N-保护的4-氨基丁醛”在本文中表示在氨基上具有保护 基的4-氨基丁醛。

上文所述的保护基可选自由具有1-6个碳原子的酰基种类组成的组， 或者可以是胍基。应当选择这样的保护基，以允许至少以下之一：生物催 化生产，易于从生物催化反应混合物(例如发酵液)中回收N-保护的前 体，和随后进行生物催化反应和/或反应，以最终生产DAB。

可以通过例如4-氨基丁醛或鸟氨酸的酰化来制备DAB的N-保护的前 体。例如，通过在甲酸中用乙酸酐酰化以引入甲基保护基，或通过C2-C6 羧酸酐或酰氯的反应以分别引入N-乙酰基、N-丙酰基、N-丁酰基、N-戊 酰基或N-己酰基。

N-胍基保护的前体是例如生成蛋白质的精氨酸或N-胍基-氨基丁醛或 N-胍基-DAB。发酵途径描述于例如EP1260588，所述文献描述了在精氨 酸脱羧酶的影响下从精氨酸以生物化学方式生产胍丁胺(agmatine)。胍 丁胺是N-胍基-保护的DAB。胍丁胺(N-胍基-保护的DAB)可以通过酸 水解，例如通过在水性浓矿物酸溶液(例如浓盐酸或浓硫酸)中回流胍丁 胺而被顺利地去保护成DAB。这产生了DAB二酸盐和副产物二氧化碳和 氨(后者是其使用的矿物酸的铵盐形式)。为了获得游离胺形式的DAB， 应当将形成的二酸盐分离、再溶解并用碱中和。

根据又一个特别的实施方案，本发明涉及用于制备DAB的方法，其 中生产至少一种DAB的N-保护的前体，所述N-保护的前体选自由N⁵-乙 酰基鸟氨酸、N-乙酰基DAB和N-乙酰基4-氨基丁醛组成的组。

根据一个特别的实施方案，涉及至少一个生物催化步骤的用于制备 DAB的方法包括以下步骤：(a)以生物催化的方式制备N⁵-乙酰基鸟氨 酸，得到含有N⁵-乙酰基鸟氨酸的生物催化反应混合物，(b)从生物催化 反应混合物中回收N⁵-乙酰基鸟氨酸，和(c)将N⁵-乙酰基鸟氨酸转化成 DAB。

根据一个特别的实施方案，涉及至少一个生物催化步骤的用于制备 DAB的方法包括以下步骤：(a)以生物催化的方式制备N-乙酰基 DAB，得到含有N-乙酰基DAB的生物催化反应混合物，(b)从生物催 化反应混合物中回收N-乙酰基DAB，和(c)将N-乙酰基DAB转化成 DAB。

根据一个特别的实施方案，涉及至少一个生物催化步骤的用于制备 DAB的方法包括以下步骤：(a)以生物催化的方式制备N-乙酰基4-氨基 丁醛，得到含有N-乙酰基4-氨基丁醛的生物催化反应混合物，(b)从生 物催化反应混合物中回收N-乙酰基4-氨基丁醛，和(c)将N-乙酰基4-氨 基丁醛转化成DAB。

在本文中明确或暗示地涉及胺或N-保护的胺(例如N-保护的DAB) 时，这些术语旨在包括中性氨基、相应的带电荷的质子化胺及其盐。

定义

除非另有说明，在本文中使用时，术语“或”被定义为“和/或”。

除非另有说明，在本文中使用时，术语“一个”(“a”或“an”)被定义 为“至少一个”。

提及单数名词(例如化合物、添加剂等)时，复数旨在被包括在内。

提及存在立体异构体的化合物时，化合物可以是所述立体异构体中的 任何或其组合。因此，提及例如存在对映异构体的氨基酸时，氨基酸可以 是L-对映异构体或D-对映异构体或其组合。存在天然立体异构体时，化 合物优选地是天然立体异构体。

参考括号中的酶种类(EC)提及酶时，酶种类是以Nomenclature  Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)所提供的酶命名法(Enzyme Nomenclature)为基础将酶分类 或可以分类的种类，所述命名法可在 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/.得到。(尚)未归入特定种类 但是可以如此被归类的其他合适酶旨在被包括在内。

术语“同源的”或“同源物”或“直系同源物”是指具有功能关系并 且通常基于序列同一性程度被测定的相关序列。这些术语可描述在一个物 种、亚种、变种、栽培种或菌株中存在的基因与在其他物种、亚种、变 种、培养种或菌株中的等同基因之间的关系。它们也可以描述天然存在的 基因与人工构建的基因之间，或两个人工构建的基因之间的关系。功能关 系可以通过大量方式中的任何一种来指明，包括但不限于(a)序列同一 性程度；(b)相同或相似的生物功能。优选地，(a)和(b)均被指 明。术语同源物还旨在包括由于遗传密码的简并性而与另一核酸序列不同 并且编码相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。

在本文中任何一处涉及多肽使用术语“同源物”旨在表示与参照多肽 具有相同或相似的生物功能以及一定程度的序列同一性的多肽。特别地， 其旨在表示至少30％，优选地至少40％，更优选地至少60％，更优选地 至少65％，更优选地至少70％，更优选地至少75％，更优选地至少 80％，特别地至少85％，更特别地至少90％，至少91％，至少92％，至 少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至 少99％的序列同一性。

“序列同一性”或“序列相似性”在本文中被定义为两条或更多多肽 序列或两条或更多核酸序列之间的相互关系，通过比较所述序列来测定。 通常，序列同一性或相似性在序列全长上比较，但是也可以仅在彼此对齐 的序列的一部分上比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多 肽序列或核酸序列之间之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列之间 的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之 间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似 性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN(Altschul，S.F. et al.，J.Mol.Biol.1990，215，403-410)，公众可以从NCBI和其它来源 (BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894)获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放 10.0，缺口延伸0.5，Blosum 62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的 优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，DNA全矩阵(DNA同一性矩 阵)。

“生物转化”或“生物催化反应”在本文中表示其中使用酶作为催化 剂的生物化学反应。根据本发明，其表示使用生物催化剂，方法中至少一 个反应步骤由生物材料或源自生物来源的部分(例如生物或源自生物的生 物分子)催化。特别地，生物转化可以是发酵步骤。生物催化剂可特别地 包括一种或多种酶。生物催化剂可以以任何形式使用。在一个特别的实施 方案中，使用作为下述形式的一种或多种酶：溶液、乳液、分散液、冻干 细胞(的悬浮液)，作为溶胞产物或固定在支持物上的，分离自天然环境 (分离自生产它的生物)的。在一个实施方案中，一种或多种酶构成活生 物的部分(例如活的全细胞)。酶可在细胞内发挥催化功能。酶可被分泌 进其中存在细胞的培养基中也是有可能的。

“生物催化反应混合物”在本文中表示其中发生生物催化反应的环 境。其可以是细胞环境(对细胞内或细胞外的生物催化反应而言)，或是 无细胞环境。

“发酵步骤”在本文中表示其中在单细胞宿主中，更特别地在细胞培 养物中的微生物中发生特别的化学实体的形成或转化的方法步骤。“发酵 制备”在本文中表示在含有可发酵的碳源的细胞培养物中，在包含生物催 化剂的微生物中生产具体化学实体，其中所述碳源含有要被转化成要制备 的特别化学实体的任何所述化合物，或其中细胞将要被转化的化合物制备 成要由碳源制备的特别化学实体。微生物可以是特别化学实体的天然生产 者，或者可以使用重组DNA技术，通过用编码至少一种合适酶的基因转 化而获得了生产特别化学实体的能力。也可以使用重组DNA技术，用编 码至少一种合适酶的基因转化特别化学实体的天然生产者，从而提高想要 的特别化学实体的生产，和/或消除下述组分的生产，所述组分可能干扰想 要的特别化学实体生产力，或可能干扰根据本发明方法中的其他步骤。

用于发酵制备DAB的N-保护的前体的优选的微生物可以是真核或原 核来源的。特别地，其可选自动物(包括人)细胞，植物细胞，细菌，古 细菌，酵母和真菌。更特别地，微生物可以选自由细菌、酵母、真菌组成 的组，所述细菌例如是Bacillus(特别是B.subtilis)，Brevibacterium(特 别是B.ketoglutamicum)，corynebacteria(特别是C.glutamicum)， Escherichia(特别是E.coli)，Klebsiella(特别是K.pneumoniae)， lactobacilli(特别是L.lactis)，propionibacterium，pseudomonas(特别是 P.putida)，Rodococcus(特别是R.erythropolis)，Streptomyces(特别是 S.coelicor和S.clavuligerus)，所述酵母例如是Kluyveromyces(特别是K. lactis)，Penicillium(特别是P.chrysogenum)，Saccharomyces(特别是 S.cerevisiae)，Aspergillus(特别是A.niger)，Pichia(特别是P. pastoris)，Hansenula，Schizosaccharomyces(特别是S.pombe)， Yarowia(特别是Y.lypolytica)，所述真菌例如是Talaromyces。

在最优选的实施方案中，N-保护的前体的发酵生产在微生物中进行， 其中N-保护的前体是体内形成的。优选地，根据本发明的N-保护的前体 的形成是由任何合适的碳源生物转化成N-保护的前体。

用于发酵方法的碳源可尤其含有至少一种选自下组的化合物：一元 醇、多元醇、羧酸、一氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括任何所述化合物的 混合物。合适的一元醇包括甲醇和乙醇。合适的多元醇包括甘油和碳水化 合物。合适的脂肪酸或甘油三酯可尤其以食用油的形式提供，优选地为植 物来源。

特别地，可以使用碳水化合物，因为通常碳水化合物可从生物可更新 来源如农产品(优选地农业废料)中大量获得。优选地，使用选自下组的 碳水化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蔗二糖、淀粉、纤维素和半纤 维素。尤其优选的是葡萄糖、包含葡萄糖的寡糖和包含葡萄糖的多糖。

另外，也可以使用氨基酸或其衍生物、谷氨酸或其衍生物和/或鸟氨酸 或其衍生物作为碳源。

可以使用含有无机氮的化合物例如胺、铵盐、尿素、硝酸盐和亚硝酸 盐，或含有有机氮的化合物例如氨基酸或其衍生物，更特别地谷氨酸或其 衍生物和/或鸟氨酸或其衍生物，作为氮源。

在本文中提及生物催化剂时，其可表示表达至少一种与生物催化功能 相关的酶的生物，或其可表示至少一种得自或源自生物的酶。生物可以是 真核或原核的。特别地，生物可选自动物(包括人)、植物、细菌、古细 菌、酵母和真菌。

在一个实施方案中，生物催化剂源自动物，特别地源自动物部分，例 如肝、胰、脑、肾、心或其他器官。动物可特别地选自哺乳动物的组，更 特别地选自灵长类动物(如Homo sapiens)、Leporidae、Muridae、Suidae 和Bovidae的组。

作为生物催化剂来源的合适植物特别是选自Asplenium； Cucurbitaceae，特别是Cucurbita，例如Cucurbita moschata(南瓜)，或 Cucumis；Mercurialis，例如Mercurialis perennis；Hydnocarpus；和 Ceratonia组的植物。

作为生物催化剂来源的合适细菌可特别选自Acinetobacter， Agrobacterium，Alcaligenes，Bacillus，Brevibacterium，Clostridium， Corynebacterium，Deinococcus，Enterobacter，Enterococcus，Erwinia， Escherichia，Geobacillus，Klebsiella，Lactobacillus，Lactococcus， Legionella，Mycobacterium，Neisseria，Nitrosomonas，Novosphingobium， Paracoccus，Proteus，Pseudomonas，Ralstonia，Rhodobacter， Rhodopseudomonas，Salmonella，Shigella，Staphylococcus， Streptococcus，Streptomyces，Thermus，Vibrio和Zymomonas的组。

作为生物催化剂来源的合适古细菌可特别地选自Aeropyrum， Archaeoglobus，Halobacterium，Methanobacterium，Methanobrevibacter， Methanocaldococcus，Methanococcus，Methanopyrus，Methanosarcina， Methanosphaera，Pyrobaculum和Thermoplasma的组。

作为生物催化剂来源的合适真菌可特别地选自Aspergillus， Neurospora，Penicillium，Rhizopus和Trichoderma的组。

作为生物催化剂来源的合适酵母可特别地选自Candida，Cytophagia， Hansenula，Humicola，Kluyveromyces，Mucor，Rhizoctonia， Saccharomyces和Yarrowia的组。

本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适 活性的天然存在的生物催化剂(野生型)或天然存在的生物催化剂的突变 体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设 计(rational design)改进天然存在的生物催化剂的特性。可例如通过使用 本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因 重组等)修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化剂的突变体， 所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分(如 酶)。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基 酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插 入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的 (宿主)细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人 员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO 2008/000632中所述方法。

突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方 面：底物选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、pH谱、温度谱、底物 谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适 的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来 鉴定具有改进的特性的突变体。

涉及来自具体来源的生物催化剂(特别是酶)、来自供体生物但是实 际上在(经遗传修饰的)宿主生物中生产的重组生物催化剂(特别是酶) 时，特定地旨在包括来自所述第一生物的生物催化剂(特别是酶)。

本发明上下文中任何生物催化步骤的反应条件可根据生物催化剂(特 别是酶)的已知条件、本文公开的信息和任选地一些常规实验来选择。

使用的反应培养基的pH可以在宽泛的界限内选择，制药生物催化剂 在所述pH条件下有活性即可。可以使用碱性、中性或酸性条件，取决于 生物催化剂和其它因素。当所述方法包括使用微生物(例如用于表达催化 本发明方法的酶)时，选择pH使得所述微生物能够发挥其预期的一种或 多种功能。在25℃下基本水性体系的情况下，特别可在低于中性pH四个 pH单位和高于中性pH两个pH单位的范围内选择pH，即在pH 3和pH9 之间选择。如果水是唯一的溶剂或主要的溶剂(以总液体为基础＞50wt. ％，特别是＞90wt.％)，则系统被认为是水性的，其中例如小量的醇或另 一种溶剂(以总液体为基础＜50wt.％，特别是＜10wt.％)可以下述浓度 溶解(例如作为碳源)，所述浓度使得可以存在的微生物保持活性。特别 是在使用酵母和/或真菌的情况下，可优选酸性条件，特别是25℃下基于 基本水性体系的pH可以在pH 3到pH 8的范围内。需要时可以使用酸和/ 或碱调节或者用合适的酸和碱的组合缓冲pH。

孵育条件可以在在广阔的界限内选择，只要生物催化剂显示足够的活 性和/或生长即可。这包括需氧、微需氧、限氧和厌氧的条件。

厌氧条件在本文中被定义为下述条件：无任何氧，或其中生物催化剂 (特别是微生物)基本不消耗氧并且通常对应于少于5mmol/l.h的氧消 耗，特别是小于2.5mmol/l.h的氧消耗，或小于1mmol/l.h的氧消耗。

需氧条件是下述条件，其中对不受限制的生长而言足够水平的氧溶于 培养基中，能够支持至少10mmol/l.h、更优选地多于20mmol/l.h、进一步 更优选地多于50mmol/l.h、最优选地多于100mmol/l.h的氧消耗速率。

限氧条件被定义为下述条件：其中氧消耗由从气体转移至液体的氧限 制。限氧条件的下限由厌氧条件的上限决定，即至少1mmol/l.h，特别是 至少2.5mmol/l.h，或至少5mmol/l.h。限氧条件的上限由需氧条件的下限 决定，即少于100mmol/l.h、少于50mmol/l.h、少于20mmol/l.h或少于10 mmol/l.h。

条件是需氧、厌氧还是限氧取决于所述方法进行的条件，特别是进入 气流的量和组成、使用的设备的实际混合/质量转移特性、使用的微生物的 类型和微生物密度。

使用的温度不是关键性的，只要生物催化剂(特别是酶)显示大量活 性即可。通常，温度可以是至少0℃，特别是至少15℃，更特别是至少20 ℃。想要的最大温度取决于生物催化剂。通常这类最大温度是本领域已知 的，例如在可商业获得的生物催化剂的情况下在产品数据表中指出，或者 可以基于公知常识和本文公开的信息常规地测定。温度通常是90℃或更 少，优选地是70℃或更少，特别是50℃或更少，更特别是40℃或更少。

特别地，如果在宿主生物外进行生物催化反应，包含有机溶剂的反应 培养基可以以高浓度(例如大于50％，或大于90wt.％)使用(使用在包 含有机溶剂的反应培养基中保持足够活性的酶时)。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于生产作为DAB的N-保护 的前体的N⁵-保护的鸟氨酸的生物催化方法。例如，N⁵-乙酰基鸟氨酸的制 备可包含一个或多个以下的被酶催化的反应：

1)谷氨酸到N-乙酰基谷氨酸

2)N-乙酰基谷氨酸到5-磷酸N-乙酰基谷氨酸

3)5-磷酸N-乙酰基-谷氨酸到N-乙酰基-谷氨酸半醛

4)N-乙酰基-谷氨酸半醛到N²-乙酰基-鸟氨酸

5)N²-乙酰基-鸟氨酸到N⁵-乙酰基-鸟氨酸

反应1)可由选自酰基转移酶(EC 2.3.1)组、优选地选自氨基酸N-乙酰 基转移酶(EC 2.3.1.1)组的酶催化。优选地，酶对作为乙酰基供体的乙酰基- CoA和作为乙酰基受体的谷氨酸而言是特异性的。氨基酸N-乙酰基转移酶 可源自原核生物或真核生物。能够催化反应1)的示范性蛋白质在表1中 给出，并给出它们在Uniprot数据库的登记号及其来源(微)生物。

反应2)可由选自乙酰基-谷氨酸激酶(EC 2.7.2.8)组的酶催化。所述酶 可使用ATP作为辅因子。乙酰基-谷氨酸激酶可源自原核生物或真核生 物。能够催化反应2)的示范性蛋白质在表1中给出，并给出它们在 Uniprot的登记号及其来源(微)生物。

反应3)可由选自氧化还原酶(EC 1.2.1)组，优选地选自N-乙酰基-γ-谷 氨酰基-磷酸还原酶(EC 1.2.1.38)组的酶催化。所述酶可使用NADH或 NADPH作为辅因子。N-乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶可源自原核生物或 真核生物。能够催化反应3)的示范性蛋白质在表1中给出，并给出它们 在Uniprot的登记号及其来源(微)生物。

反应4可由选自转氨酶(EC 2.6.1)组、优选地选自乙酰基鸟氨酸转氨酶 (EC 2.6.1.11)组的酶催化。乙酰基鸟氨酸转氨酶可使用谷氨酸作为氨基供 体。乙酰基鸟氨酸转氨酶可源自原核生物或真核生物。能够催化反应4) 的示范性蛋白质在表1中给出，并给出它们在Uniprot的登记号及其来源 (微)生物。

反应5)可由N-酰基转移酶如谷氨酸N-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.35)催 化。

谷氨酸可通过本领域公知的谷氨酸生物合成反应源自合适的碳源。优 选地，使用累积大量谷氨酸的微生物，例如Corynebacterium glutamicum。 用于(例如通过遗传工程)改进谷氨酸生产的方法，是本领域公知的 (Kimura E.，Adv Biochem Eng Biotechnol.2003；79：37-57)。

或者，N⁵-乙酰基鸟氨酸的制备可包括一个或多个以下由酶催化的反 应：

6)谷氨酸到N-乙酰基谷氨酸

7)N-乙酰基-谷氨酸加鸟氨酸到N²-乙酰基-鸟氨酸

8)N²-乙酰基-鸟氨酸到N⁵-乙酰基-鸟氨酸

表1：用于反应步骤1-8的酶

反应6)与反应1)相同，并且可以由相同类型的酶催化。

反应7)可由选自酰基转移酶(EC 2.3.1)组、优选地谷氨酸N-乙酰基转 移酶(EC 2.3.1.35)组的酶催化。优选地，酶使用鸟氨酸作为乙酰基受体， 从而产生谷氨酸和N-乙酰基-鸟氨酸作为反应产物。谷氨酸N-乙酰基转移 酶可具有针对N-乙酰基-谷氨酸的水解活性，产生谷氨酸和乙酸作为水解 产物。优选地，使用的酶不具有可检出的水解活性；或者可以改造野生型 酶，使得与野生型酶相比水解活性大幅降低。谷氨酸N-乙酰基转移酶可源 自原核生物或真核生物。能够催化反应7)的示范性蛋白质在表1中给 出，并给出它们在Uniprot的登记号及其来源(微)生物。

反应8)与反应5相同，并可由相同的酶催化。

在又一个优选的实施方案中，本发明涉及从N⁵-保护的鸟氨酸生产N- 保护的DAB的生物催化方法。通常，合适的脱羧酶具有N⁵-保护的鸟氨酸 脱羧酶活性，其能够催化N⁵-保护的鸟氨酸转化成为N-保护的DAB。

能够对N⁵-保护的鸟氨酸脱羧的酶可特别地选自脱羧酶(E.C.4.1.1)组， 优选地选自鸟氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.17)、二氨基庚二酸脱羧酶(EC 4.1.1.20)、支链α-酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.72)、α-酮异戊酸脱羧酶、α-酮戊二 酸脱羧酶(EC 4.1.1.71)的组。

一种或多种其他合适的脱羧酶可选自草酸脱羧酶(EC 4.1.1.2)、乙酰乙 酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)、缬氨酸脱羧酶/亮氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.14)、天冬氨 酸1-脱羧酶(EC 4.1.1.11)、3-羟基谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.16)、赖氨酸脱羧 酶(EC 4.1.1.18)、精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19)、2-酮戊二酸脱羧酶(EC 4.1.1.71)和二氨基丁酸脱羧酶(EC 4.1.1.86)的组。

脱羧酶可特别地是选自下组的生物的脱羧酶：南瓜；黄瓜；酵母；真 菌，例如Candida flareri，Hansenula sp.，Kluyveromyces marxianus， Neurospora crassa，Rhizopus javanicus和Saccharomyces cerevisiae；哺乳动 物，特别地来自于哺乳动物脑；和细菌，例如Bacillus cadaveris， Escherichia coli，Lactococcus lactis，Mycobacterium tuberculosis， Pseudomonas sp.和Zymomonas mobilis。

在又一个优选的实施方案中，本发明涉及经由N-保护的4-氨基丁醛生 产N-保护的DAB的生物催化方法。例如，N-乙酰基-DAB的制备可包括 一个或多个以下的由酶催化的反应：

9)谷氨酸到4-氨基丁酸

10)4-氨基丁酸到N-乙酰基-4-氨基丁酸

11)N-乙酰基-4-氨基丁酸到N-乙酰基-4-氨基丁醛

12)N-乙酰基-4-氨基丁醛到N-乙酰基-DAB

反应9)可由选自脱羧酶(EC 4.1.1)组、优选地选自谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)组的酶催化。谷氨酸脱羧酶可源自原核生物或真核生物或古细 菌。

反应10)可由选自酰基转移酶(EC 2.3.1)组、优选地选自氨基酸N-乙 酰基转移酶(EC 2.3.1.1)、甘氨酸N-酰基转移酶(EC 2.3.1.13)、天冬氨酸N- 乙酰基转移酶(EC 2.3.1.17)、谷氨酸N-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.35)、D-氨基 酸N-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.36)和二胺N-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.57)组的 酶催化。优选地，使用的酶对底物4-氨基丁酸是选择性的。野生型酶可具 有针对作为氨基受体的4-氨基丁酸的低活性/选择性。此类野生型酶可以被 改造，使得针对4-氨基丁酸的活性/选择性与野生型酶相比大幅提高。使用 的酶可以使用乙酰基-CoA作为乙酰基供体。或者，酶也可以使用N-乙酰 化的氨基酸(例如N-乙酰基-谷氨酸)作为乙酰基供体。酶可源自原核生 物或真核生物或古细菌。

或者，N-乙酰基-4-氨基丁酸可通过以下由酶催化的反应被转化成N- 乙酰基-4-氨基丁醛：

11a)N-乙酰基-4-氨基丁酸到磷酸N-乙酰基-4-氨基丁酸

11b)磷酸N-乙酰基-4-氨基丁酸到N-乙酰基-4-氨基丁醛

反应11a)可由选自磷酸转移酶(EC 2.7.2)组，优选地选自乙酸激酶 (EC 2.7.2.1)、天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)、丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、乙酰基谷 氨酸激酶(2.7.2.8)和谷氨酸5-激酶(2.7.2.11)组的酶催化。

反应11b)可由选自氧化还原酶(EC 1.2.1)组，优选地选自N-乙酰基-γ- 谷氨酰基-磷酸还原酶(EC 1.2.1.38)组的酶催化。

能够催化反应步骤9)到11)的示范性蛋白质在表2中给出，并给出 它们在Uniprot的登记号及其来源(微)生物。

表2：用于反应步骤9-11(a/b)的酶

反应12)涉及从N-保护的4-氨基丁醛生产N-保护的DAB的生物催 化方法。

通常，合适的氨基转移酶具有N-保护的4-氨基丁醛氨基转移酶活性， 其能够催化N-保护的4-氨基丁醛转化成N-保护的DAB。

氨基转移酶可特别地选自天冬氨酸转移酶、ω-氨基转移酶(EC 2.6.1)、 III类-氨基转移酶(EC 2.6.1)、4-氨基-丁酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)、L-赖氨 酸6氨基转移酶(EC 2.6.1.36)、5-氨基戊酸氨基转移酶(EC 2.6.1.48)、赖氨 酸：丙酮酸6-氨基转移酶(EC 2.6.1.71)和腐胺-氨基转移酶(EC 2.6.1.82)的 组。

在一个实施方案中，氨基转移酶可选自丙氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.2)、亮氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.6)、丙氨酸-氧化-酸氨基转移酶(EC 2.6.1.12)、β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶(EC 2.6.1.18)、(S)-3-氨基-2-甲基丙 酸氨基转移酶(EC 2.6.1.22)、L，L-二氨基庚二酸氨基转移酶(EC 2.6.1.83)的 组。

氨基转移酶可特别地选自来自哺乳动物、植物或微生物的氨基转移 酶。更特别地，氨基转移酶可来自Asplenium，更特别地来自Asplenium  unilaterale或Asplenium septentrionale，Bacillus，更特别地来自Bacillus  weihenstephanensis，Bacillus cereus和Bacillus subtilis，Ceratonia，更特别 地来自Ceratonia siliqua，Enterobacter，Erwinia，更特别地来自E. carotovora，Escherichia，更特别地来自E.coli，Legionella，Mercurialis， 更特别地来自Mercurialis perennis，更特别地来自Mercurialis perennis的 嫩枝，Neisseria，Nitrosomonas，Pseudomonas，更特别地来自 Pseudomonas aeruginosa，Rhodobacter，更特别地来自Rhodobacter  sphaeroides，Rhodopseudomonas，Salmonella，更特别地来自S.typhi，S. paratyphi，Shigella，更特别地来自Sh.boydii，Sh.flexneri，S.sonnei， Staphylococcus，更特别地来自Staphylococcus aureus，Vibrio，更特别地来 自Vibrio fluvialis，或酵母，更特别地来自Saccharomyces cerevisiae。

当酶是哺乳动物的酶时，其尤其可源自哺乳动物肾，来自哺乳动物 肝，来自哺乳动物心或来自哺乳动物脑。例如，合适的酶可选自下组：来 自哺乳动物肝的4-氨基-丁酸氨基转移酶，尤其是来自猪肝的4-氨基-丁酸 氨基转移酶；来自哺乳动物脑的4-氨基-丁酸氨基转移酶，尤其是来自 人、猪或大鼠脑的4-氨基丁酸氨基转移酶；Vibrio fluvialis的ω-氨基转移 酶，来自E.coli的4-氨基-丁酸氨基转移酶，和来自Clostridium、特别是 来自Clostridium aminovalericum的5-氨基戊酸氨基转移酶。

氨基供体特别地可选自氨、铵离子、胺和氨基酸的组。合适的胺是伯 胺和仲胺。氨基酸可具有D-构型或L-构型。氨基供体的例子是丙氨酸、 谷氨酸、异丙胺、2-氨基丁烷、2-氨基庚烷、苯甲胺、1-苯基-1-氨基乙 烷、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、β-氨基异丁酸酯、β-丙氨 酸、4-氨基丁酸酯和α-氨基己二酸酯。

在又一个优选的实施方案中，制备N-保护的DAB的方法包含在存在 下述酶时的生物催化反应，所述酶能够在存在氨来源时催化还原性氨基化 反应，所述酶选自作用于供体CH-NH₂基团上的氧化还原酶(EC 1.4)的 组，特别地是选自氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1)的组。通常，合适的氨基酸 脱氢酶具有催化N-保护的4-氨基丁醛转化成为N-保护的DAB的6-氨基己 酸6-脱氢酶活性，或者具有催化AKP转化成为AAP的α-氨基庚二酸酯2- 脱氢酶活性。合适的氨基酸脱氢酶特别地选自二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.16)、赖氨酸6-脱氢酶(EC 1.4.1.18)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3； EC 1.4.1.4)和亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)的组。

在一个实施方案中，氨基酸脱氢酶可选自被归类为以下的氨基酸脱氢 酶：以NAD或NADP作为受体的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)、以NADP 作为受体(EC 1.4.1.4)的谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)、 二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC 1.4.1.16)和赖氨酸6-脱氢酶(EC 1.4.1.18)。

氨基酸脱氢酶可特别地源自选自下组的生物：Corynebacterium，特别 是Corynebacterium glutamicum；Proteus，特别是Proteus vulgaris； Agrobacterium，特别是Agrobacterium tumefaciens；Geobacillus，特别是 Geobacillus stearothermophilus；Acinetobacter，特别是Acinetobacter sp. ADP1；Ralstonia，特别是Ralstonia solanacearum；Salmonella，特别是 Salmonella typhimurium；Saccharomyces，特别是Saccharomyces  cerevisiae；Brevibacterium，特别是Brevibacterium flavum；和Bacillus，特 别是Bacillus sphaericus、Bacillus cereus或Bacillus subtilis。例如，合适的 氨基酸脱氢酶可选自来自Bacillus，特别是Bacillus sphaericus的二氨基庚 二酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自 Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脱氢酶，特别是来自Corynebacterium  glutamicum的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Proteus的二氨基庚二酸酯脱 氢酶，特别是来自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自 Agrobacterium、特别是Agrobacterium tumefaciens的赖氨酸6-脱氢酶，来 自Geobacillus、特别是来自Geobacillus stearothermophilus的赖氨酸6-脱 氢酶；来自Acinetobacter的以NADH或NADPH作为辅因子发挥作用的谷 氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)，特别是来自Acinetobacter sp.ADP1的谷氨酸 脱氢酶；来自Ralstonia的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)，特别是来自 Ralstonia solanacearum的谷氨酸脱氢酶；来自Salmonella的以NADPH作 为辅因子发挥作用的，特别是来自Salmonella typhimurium的谷氨酸脱氢 酶；来自Saccharomyces的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.4)，特别是来自 Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸脱氢酶；来自Brevibacterium的谷氨酸脱 氢酶，特别是来自Brevibacterium flavum的谷氨酸脱氢酶；和来自Bacillus 的亮氨酸脱氢酶，特别是来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸 脱氢酶。

生物催化酶可以以任何形式使用。例如，可以以例如分散液、乳液、 溶液或固定化的形式(例如负荷在支持物例如颗粒或整体性运载体材料 商)，作为粗制酶、作为可商业获得的酶、作为从可商业获得的制剂进一 步纯化的酶、作为通过已知纯化方法的组合得自其来源的酶、在天然或通 过遗传修饰具有水解活性的全(任选地经通透化合/或固定化的)细胞中、 或在具有此类活性的细胞的裂解物中，使用生物催化酶。

生物催化酶可得自或源自任何生物，特别是来自动物、植物、细菌、 霉菌、酵母或真菌。

本领域普通技术人员应当明白，也可以利用在根据本发明的方法中具 有生物催化活性天然存在的(野生型)酶的突变体。野生型酶的突变体可 例如如下制造：使用本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点诱 变、定向进化、基因改组等)，使得DNA编码与野生型酶有至少一个氨 基酸不同的酶或使其编码与野生型酶相比更短的酶，并影响合适的(宿 主)细胞中通过这种方式修饰的DNA的表达。生物催化酶的突变体可具 有(例如关于一个或多个以下方面的)经改进的特性：针对底物的选择 性、活性、稳定性、溶剂抗性、pH谱、温度谱、底物谱。

提及来自特别来源的酶时，源自第一生物、但是实际上在(经遗传修 饰的)第二生物中生产的重组酶特定地旨在作为来自所述第一生物的酶而 被包括在内。

可以使用本领域本身已知的分子生物学技术(Maniatis et al.1982 “Molecular cloning：a laboratory manual”.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold  Spring Harbor，N.Y.；Miller 1972“Experiments in molecular genetics”，Cold  Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor；Sambrook and Russell 2001 ″Molecular cloning：a laboratory manual”(3rd edition)，Cold Spring Harbor  Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press；F.Ausubel et al，eds.， ″Current protocols in molecular biology″.Green Publishing and Wiley  Interscience，New York 1987)，构建包含用于在本发明方法中催化一个或 若干个反应步骤的一种或多种酶的细胞，特别是重组细胞。例如，如果要 在重组细胞(其可以是异源体系)中生产一种或多种生物催化剂，则这类 技术可以被用于提供下述载体(例如重组载体)，所述载体包含一个或多 个编码一种或多种所述生物催化剂的基因。可以使用一种或多种载体，每 种包含一个或多个这类基因。此类载体可包含一个或多个调节元件，例如 一个或多个启动子，所述启动子可与编码生物催化剂的基因可操作地连 接。

在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指功能性相互关系中多核 苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的一种连接。当核酸序列被置于与另 一核酸序列的功能性相互关系之中时，所述核酸序列是“可操作地连接” 的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增 强子与所述编码序列可操作地连接。

在本文中使用时，术语“启动子”是指一种核酸片段，其功能是控制 一个或多个基因的转录，根据转录的方向位于基因的转录起点上游，并且 结构上由DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和任何其它DNA序列的存 在识别，所述任何其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻抑 因子和激活因子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的直接或间接地作用 以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是 在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境 或发育调节下有活性的启动子。当用于指出给定的(重组的)核酸或多肽 分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的相互关系时，术语“同源的”应 当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种(优选地相同变种或 菌株)的宿主细胞或生物生产。

可用于实现编码本发明方法中使用的酶(特别是氨基转移酶、氨基酸 脱氢酶或脱羧酶，如上文所述)的核酸序列表达的启动子对编码要表达的 酶的核酸序列而言可以是天然的，或者可以对与之可操作地连接的核酸序 列而言是异源的。优选地，启动子是同源的，即对宿主细胞而言是内源 的。

如果使用(对编码感兴趣的酶的核酸序列而言)异源启动子，则所述 异源启动子优选地能够生产比编码序列的天然启动子更高稳态水平的包含 所述编码序列的转录本(或者单位时间能够生产更多转录本分子，即 mRNA分子)。本发明上下文中合适的启动子包括本领域技术人员公知的 组成型和诱导型启动子以及经改造的启动子。

“强组成型启动子”是与天然宿主细胞相比引起mRNA以高频率起始 的启动子。革兰氏阳性微生物中这类强组成型启动子的例子包括SP01- 26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。

革兰氏阳性微生物中诱导型启动子的例子包括IPTG诱导型Pspac启 动子，木糖诱导型PxylA启动子。

革兰氏阴性微生物中组成型和诱导型启动子的例子包括但不限于 tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara (P_BAD)、SP6、λ-P_R和λ-P_L。

针对(丝状)真菌细胞的启动子是本领域已知的，并且可以是例如葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子，蛋白酶启动子例如pepA、pepB、 pepC，葡糖淀粉酶glaA启动子，淀粉酶amyA、amyB启动子，过氧化氢 酶catR或catA启动子，葡萄糖氧化酶goxC启动子，β-半乳糖苷酶lacA 启动子，α-葡糖苷酶aglA启动子，翻译延长因子tefA启动子，木聚糖酶 启动子例如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD，纤维素酶启动子例如eglA、eglB、 cbhA，转录调节子的启动子例如areA、creA、xlnR、pacC、prtT，或其他 启动子，并且可与其他一起在NCBI网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)上找到。

在关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质的方面，使用术语“异源的” 表示下述核酸或蛋白质，其不作为其存在的生物、细胞、基因组或DNA 或RNA序列的部分天然存在，或其存在于与其天然存在的细胞或位置基 因组或DNA或RNA序列中的位点不同的地方。异源核酸或蛋白质对其被 引入的细胞而言不是内源的，但是得自另一细胞或被合成或重组地生产。 一般地(尽管并非必须)，这类核酸编码下述细胞通常不生产的蛋白质， 所述DNA在所述细胞中被转录或表达。类似地，外源RNA编码下述蛋白 质，所述蛋白质在存在所述外源RNA的细胞中通常不表达。异源核酸和 蛋白质也可以被称作外来核酸或蛋白质。在本文中术语异源核酸或蛋白质 包括本领域技术人员会识别为对于下述细胞是异源或外源的任何核酸或蛋 白质，所述核酸或蛋白质在所述细胞中被表达。

根据本发明的方法可以在宿主生物中进行，所述宿主生物可以是新颖 的。

因此，本发明还涉及包含能够催化本发明方法中至少一个反应步骤的 一种或多种酶的宿主细胞。

在一个特定的实施方案中，根据本发明的宿主细胞是包含下述核酸序 列的重组细胞，所述核酸序列编码能够催化从N-保护的谷氨酸半醛形成 N²-保护的鸟氨酸的转氨基反应或还原性氨基化反应的酶，或编码能够催化 从N²-保护的鸟氨酸形成N⁵-保护的鸟氨酸的N-酰基转移酶反应的酶，或 编码能够催化从N-保护的4-氨基丁醛形成N-保护的DAB的氨基转移酶反 应的酶。所述序列可以是载体的一部分，或者可以被插入染色体DNA 中。

回收DAB的N-保护的前体

将N-保护的前体转化成DAB之前，要从生物催化反应混合物中回收 N-保护的前体。

从生物催化反应混合物中回收N-保护的前体可以通过本领域已知用于 从生物催化反应混合物中回收类似化学实体的方法进行。特别地，对发酵 生产方法而言，此类回收方法可包含选自下组的至少一个步骤，从而去除 细胞，所述组由细胞分离(过滤、膜分离(MF))、沉降(如重力和离 心)、结晶组成。对于经济上良好的纯化而言，可能需要N-保护的前体的 进一步浓缩和纯化。为了进一步浓缩，可以使用技术如蒸发和膜分离 (RO、NF和UF)。也可以使用技术如(共融(eutectic))冷冻浓缩。

通过离子交换(色谱)或通过结晶/沉淀任一进行进一步的分离可能是 必需的。

所述方法不一定必须导致N-保护的前体的精确纯化，但是N-保护的 前体应当被纯化至至少下述程度：N-保护的前体成为DAB的随后转化不 会被来自生物催化反应混合物的副产物和污染物大幅妨碍。任选地，N-保 护的前体也可以被浓缩。

另外，N-保护的前体可以被转移至针对至少一个随后的转化步骤被优 化的培养基。

DAB的N-保护的前体转化成为DAB

N-保护的前体成为根据本发明的DAB的直接或间接转化可涉及至少 一个生物催化(特别是酶促)步骤或化学转化步骤。其还可涉及生物催化 步骤和化学转化步骤的组合。

例如，生物催化生产的N-保护的DAB成为未受保护的DAB的转化 可以通过生物催化方法或化学水解方法进行。对生物催化方法而言，可以 使用合适的水解酶。在本发明的一个有利的方法中，脱酰基作用被生物催 化。特别地，可以利用下述水解酶，所述水解酶能够催化N-Ac-DAB的脱 酰基作用，更特别地能够催化N-乙酰基-DAB的脱乙酰基作用。

通过化学或生物催化水解将N-乙酰基-DAB转化成DAB时，这通常 导致DAB和乙酸二者的形成。回收DAB后，优选地在方法中再使用含有 乙酸的部分。在发酵方法的情况下，乙酸可以被再使用，作为培养微生物 的碳源，或作为生产N-保护的-DAB或在发酵方法中能够被转化成N-保护 的DAB的化合物的碳源。

术语“水解酶”在本文中用于来自类别E.C.3的酶。优选地，使用选 自羧酸酯水解酶(E.C.3.1.1)、硫酯水解酶(E.C.3.1.2)和肽酶(E.C.3.4)组的一 种或多种水解酶。

特别可以使用肽酶(E.C.3.4)。优选的肽酶是选自丝氨酸型羧肽酶(E.C. 3.4.16)、金属羧肽酶(E.C.3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.18)、丝氨酸 内肽酶(E.C.3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(E.C.3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(E.C. 3.4.23)和金属内肽酶(E.C.3.4.24)组的肽酶，尤其是选自丝氨酸内肽酶(E.C. 3.4.21)的肽酶。用丝氨酸内肽酶、优选地枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)如 枯草杆菌蛋白酶Carlsberg实现了特别好的结果。

可作为水解酶来源的生物的例子包括Trichoderma sp，如Trichoderma  reesei；Rhizopus sp.，如Rhizopus oryzae；Bacillus sp，如Baccillus  licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus  clausii、Bacillus lentus、Bacillus alkalophilus、Bacillus halodurans； Aspergillus sp.，如Aspergillus oryzae或Aspergillus niger；Streptomyces  sp.，如caespitosus Streptomyces或Streptomyces griseus；Candida sp.；真 菌；Humicola sp；Rhizoctonia sp.；Cytophagia；Mucor sp.；和动物组 织，尤其是胰腺，例如猪胰腺、牛胰腺或绵羊胰腺。

如上文所述，一种优选的酶是枯草杆菌蛋白酶。多种枯草杆菌蛋白酶 是本领域已知的，见例如US 5,316,935和其中引用的参考文献。枯草杆菌 蛋白酶A是来自Novozymes的可商业获得的枯草杆菌蛋白酶。特别优选 的是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。发现Alcalase特别适合在本发明的方法 中使用。该产品可从Novozymes(Bagsvaerd，丹麦)获得。Alcalase是 Bacillus licheniformis生产的廉价并且可以工业获得的蛋白水解酶混合物 (含有枯草杆菌蛋白酶Carlsberg作为主要的酶成分)。使用经纯化的枯草 杆菌蛋白酶的实验证实，枯草杆菌蛋白酶催化酯交换、活化和肽键形成。

Novozymes(Bagsvaerd，丹麦)供应ovozyme、liquanase、 AlcalaseAlcalase-ultra(在碱性pH下特别有效)、duramyl、 esperase、kannase、savinase、savinase ultra、termamyl、termamyl ultra、 novobate、polarzyme、neutrase、novoline、pyrase、novocor(细菌碱性蛋 白酶)。

蛋白酶-K可得自New England Biolabs，Ipswich(MA)，美国。

Novo Nordisk Biochem North America Inc(Franklinton NC，美国)供应 Protease Bacillus species(Esperase 6.0T；Savinase 6.0T)、Protease Bacillus  subtilis(Neutrase 1.5MG)、Protease Bacillus licheniformis(Alcalase 3.0T)。

Amano International Enzyme Co(Troy，Va，美国)供应Protease Bacillus  subtilis(Proleather；Protease N)和Protease Aspergillus oryzae(Prozyme 6)。

这类酶的合适例子是例如Rhizopus japonicus脂肪酶，Aspergillus niger 的脂肪酶AP-6，Alcaligenes sp的脂肪酶QL，Bacillus amyloliquefaciens的 蛋白酶B(SEQ ID NO 19)，Bacillus licheniformis的Delvolase(SEQ ID  NO 20)，Rhizopus oryzae脂肪酶，Esperase，Alcalase，Aspergillus species 酰基转移酶，Prozyme，蛋白酶M，蛋白酶N。水解酶优选地选自下组： 作用于酯键的水解酶(脂肪酶、酯酶)(EC 3.1)、作用于肽键的肽水解酶 (肽酶、蛋白酶)(EC 3.4)，和作用于除肽键之外的C-N键的水解酶(EC 3.5)。

特别地，作用于除肽键之外的C-N键的水解酶可选自羧酸酯水解酶 (EC 3.1.1)和作用于线性酰胺的酰胺酶(EC 3.5.1)的组，特定地选自氨基酰胺 酶的组，更特定地选自来自Mycobacterium的氨基酰胺酶、更特定地来自 Mycobacterium neoaurum的氨基酰胺酶的组。

N-保护的DAB的化学水解可包括本领域已知的用于类似反应的方 法。一种合适的方法涉及通过(PhO)₃P.Cl₂试剂进行脱酰基化，所述 (PhO)₃P.Cl₂试剂通过用氯滴定三苯基磷酸溶液来制备。所述方法通常由 Saggiari et al(Organic Letters(2004)，6(22)，pp.3885-3888描述。

N⁵-保护的鸟氨酸成为未受保护的DAB的转化可如下进行：首先将 N⁵-保护的鸟氨酸特异性脱羧，得到N-保护的DAB，随后水解N-保护的 DAB，得到如前文所述的未受保护的DAB。

为了将N⁵-保护的鸟氨酸特异性脱羧得到N-保护的DAB，可利用合适 的生物催化剂例如具有裂合酶活性的酶。具有裂合酶活性的合适的酶属于 EC 4类。更特别地，可以利用碳-碳裂合酶(EC 4.1)如羧化酶(EC 4.1.1)，例 如Escherichia coli的鸟氨酸脱羧酶(SpeC)(EC 4.1.1.17)，Lactococcus lactis 的支链α-酮酸脱羧酶(KdcA；SEQ ID 8)和α-酮异戊酸脱羧酶(KivD；SEQ  ID 10)，和Eschericia coli的赖氨酸脱羧酶(LysA；SEQ ID 12)。

或者，首次提到的N⁵-保护的鸟氨酸的特异性脱羧可以通过本领域已 知用于类似化学实体的化学转化来进行。用于这一目的的合适的化学脱羧 反应可以通过在高沸点溶剂例如二苯基甲烷中，任选地在存在催化量的有 机过氧化物时加热化合物来进行，或者可以通过将化合物与一份或更多份 等量的酮或醛一起加热来进行。

随后N-保护的DAB的水解可以通过如上文针对生物催化生产的N-保 护的DAB所述的生物催化方法或化学方法来进行。

作为上文所述的两步骤转化的替代方式，可以利用一锅法从N⁵-保护 的鸟氨酸生产DAB。所述方法可以如下进行：根据本领域已知用于类似化 合物的方法，首先对N⁵-保护的鸟氨酸脱酰基并随后脱羧基，或者首先对 N⁵-保护的鸟氨酸脱羧基并随后脱酰基。脱羧反应可如上文所述进行。脱酰 基反应可以通过上文针对N-保护的DAB所述的方法进行。

N-保护的4-氨基丁醛成为未受保护的DAB的转化可如下进行：首先 用氨基对醛氧进行特异性置换，从而形成N-保护的DAB，随后对后者去 保护。对第一步转化而言，可以利用合适的生物催化剂，例如前文所述具 有转移酶活性(EC 2)的酶。就这一特别目的而言合适的具有转移酶活性的 酶的例子是转移氮基的转移酶(EC 2.6)，更特别地是氨基转移酶(转氨 酶)(EC 2.6.1)，进一步特别地是来自哺乳动物肝的4-氨基丁酸氨基转移 酶；更特别地是来自猪肝的4-氨基-丁酸氨基转移酶；来自哺乳动物脑的 4-氨基-丁酸氨基转移酶，更特别地是来自人、猪或大鼠脑的4-氨基-丁酸 氨基转移酶；Vibrio fluvialis的ω-氨基转移酶，来自E.coli的4-氨基-丁酸 氨基转移酶，和来自Clostridium的、更特别地来自Clostridium  aminovalericum的5-氨基戊酸氨基转移酶，例如Shigella或Salmonella的 腐胺氨基转移酶，鸟氨酸转氨酶(EC 2.6.1.11)和L-丙氨酸：3-氧丙酸氨基 转移酶(EC 2.6.2.18)。特别合适的氨基转移酶是例如Vibrio fluvialis的ω-氨 基转移酶(SEQ ID 5)，或Pseudomonas aeruginosa的氨基转移酶 (gi9946143(SEQ ID 1)或gi9951072(SEQ ID 3))，Paracoccus  denitrificans的氨基转移酶(ZP00628577；SEQ ID 14)，Bacillus  weihenstephanensis的氨基转移酶(ZP01186960(SEQ ID 16))。

用于将N-保护的4-氨基丁酸转化成N-保护的DAB的其他合适的生物 催化剂是氧化还原酶(EC 1)，更特别地是作用于供体的CH-NH₂基团(EC 1.4)或CH-NH基团(EC 1.5)的氧化还原酶，更特别地是EC 1.4.1、1.4.3 (优选地1.4.3.4)和1.4.99类的酶。

或者，N-保护的4-氨基丁醛的第一步转化可以通过本领域已知用于类 似化学实体的化学转化进行。用于这一目的的合适化学反应可以根据本领 域已知用于类似化合物的方法，通过N-保护的4-氨基丁醛的还原性氨基化 进行(见例如DE 4322065)。一种合适的方法是例如在异质催化剂(例如 RaNi、Ni/SiO₂和/或Al₂O₃、Ru/C、Rh/C)或均质催化剂(例如均质的Rh 催化剂)上与氨和氢反应。

N-保护的DAB的随后的水解可以通过上文针对生物催化生产的N-保 护的DAB所述的生物催化方法或化学方法进行。

附图说明

图1.N-Ac-鸟氨酸生物转化成N-Ac-DAB的结束时间样品的TLC。 1)谷氨酸DC；2)天冬氨酸DC；3)LysA；4)KdcA；5)KivD；6) Kgd；7)Lysin DC；8)ODC LJ110；9)ODC DH5α；10)酶空白；11) 化学空白；12)N-Ac-鸟氨酸参照样品；13)N-Ac-DAB参照样品；14) N-Ac-鸟氨酸&N-Ac-DAB参照样品。

实施例

一般方法

分子和遗传技术

标准遗传和分子生物学技术是本领域普遍已知的，并且先前已被描述 (Maniatis et al.1982“Molecular cloning：a laboratory manual”.Cold Spring  Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Miller 1972“Experiments in  molecular genetics”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor； Sambrook and Russell 2001″Molecular cloning：a laboratory manual”(3rd  edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory  Press；F.Ausubel et al，eds.，″Current protocols in molecular biology″， Green Publishing and Wiley Interscience，New York 1987)。

质粒和菌株

质粒pBAD/Myc-His C得自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。使用如 WO2005/068643中所述构建的质粒pBAD/Myc-His-DEST进行蛋白质表 达。使用E.coli TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行所有克隆程序 和靶基因的表达。

培养基

使用LB培养基(10g/l胰胨，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl)进行E. coli的培养。补充抗生素(50μg/ml氨苄西林)以保持质粒。为了诱导处 于源自pBAD/Myc-His-DEST质粒的P_BAD启动子控制下的基因表达，添加 L-阿拉伯糖至0.2％(w/v)的终浓度。

M.neoaurum氨基酰胺酶的生产

通过Mycobacterium neoaurum菌株ATCC 25795在以下条件下的生 长，获得氨基酰胺酶。将含有4,8g/l次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid， NTA)、4g/l尿素、6g/l葡萄糖、20g/l酵母碳基(来自Difco的 YCB)、1.55g/l K₂HPO₄和0.85g/l NaH₂PO₄.H₂O的一升Mycomed培养基 调节至pH 7，并用Mycobacterium neoaurum菌株ATCC 25795的甘油菌种 培养物接种。在New Brunswick Scientific G53摇床(150rpm，振幅4 cm)上于37℃下将预培养物摇动168小时。达到3.45的光密度(OD_620nm)时，使用500ml预培养物接种91Mycomed培养基。通过Mycomed培 养基中存在的NTA诱导酰胺酶表达。将发酵培养物在375-750rpm下以 0.5-2l/分钟的换气率搅拌。通过添加H₃PO₄和NaOH将pH保持恒定为7。 培养温度是37℃。培养44小时后，通过添加10g/l YCB对培养物补料。 培养68小时后，通过添加10g/l葡萄糖对培养物补料。培养94小时后， 通过在12,000g下离心10分钟收获培养物。将细胞沉淀物在20mM HEPES/NaOH缓冲液，pH 7中洗涤，随后冻干保存。

质粒的鉴定

通过本领域普遍已知的遗传、生物化学和/或表型手段，例如转化体对 抗生素的抗性、转化体的PCR诊断分析或质粒DNA的纯化、被修饰的质 粒DNA的限制性分析或DNA序列分析，鉴定带有不同基因的质粒。

靶基因的克隆

表达构建体的设计

在核糖体结合位点和起始密码子上游和终止密码子下游对所有基因添 加attB位点，以便于使用Gateway技术(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进 行克隆。

基因合成和质粒的构建

合成基因得自DNA2.0，并根据DNA2.0的标准程序针对在E.coli中 的表达进行了密码子优化。对分别编码V.fluvialis JS17ω-氨基转移酶的氨 基酸序列[SEQ ID No.6]和B.weihenstephanensis KBAB4氨基转移酶 (ZP_01186960)的氨基酸序列[SEQ ID No.17]的，来自Vibrio fluvialis JS17 的氨基转移酶基因[SEQ ID No.5]和来自Bacillus weihenstephanensis的氨 基转移酶基因KBAB4[SEQ ID No.16]进行密码子优化，并通过DNA分析 获得得到的序列[SEQ ID No.7]和[SEQ ID No.18]。

如制造商的流程(www.invitrogen.com)中所述，通过引入的attB位点和 pDONR201(Invitrogen)作为进入载体，使用Gateway technology(Invitrogen) 将基因构建体克隆进pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。通过这种方式分 别获得了表达载体pBAD-Vfl_AT和pBAD-Bwe_AT。通过用各种pBAD-表 达载体转化化学感受态E.coli TOP10(Invitrogen)获得相应的表达菌株。

以相似的方式，用编码SEQ ID No 15的氨基酸序列的来自Paracoccus  denitrificans的氨基转移酶基因[SEQ ID No 14]制造表达载体。

通过PCR克隆

根据制造商的说明书，使用PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)， 使用如表3中所列的引物，通过PCR从基因组DNA中扩增氨基转移酶基 因。

表3

通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，使用QIAquick PCR纯化试剂盒 (Qiagen，Hilden，德国)从凝胶中洗脱具有正确大小的PCR产物。如制 造商流程中所述，通过引入的attB位点和pDONR-zeo(Invitrogen)作为引 入载体，使用Gateway技术(Invitrogen)将经纯化的PCR产物克隆进 pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。通过DNA测序验证通过PCR克隆的基 因序列。通过这种方式，获得表达载体pBAD-Pae-_gi9946143_AT、 pBAD-Pae_gi9951072_AT和pBAD-Pde_AT_ZP00628577。通过用pBAD 构建体转化化学感受态E.coli TOP10(Invitrogen)，获得相应的表达菌株。

培养用于蛋白质表达的E.coli

在具有含0.02％(w/v)L-阿拉伯糖的940μl培养基的96-深孔平板中进 行小规模培养。通过用96孔印模(Kühner，Birsfelden，瑞士)将细胞从冷 冻菌种培养物转移，进行接种。在定轨摇床(300rpm，5cm振幅)上于 25℃下将平板孵育48小时。典型地，达到2-4的OD_620nm。

细胞裂解物的制备

裂解缓冲液的制备

裂解缓冲液含有表4中所列成分：

表4

  1M MOPS pH 7.5   5ml   II级DNAse I(Roche)   10mg   溶菌酶   200mg   MgSO4.7H2O   123.2mg   二硫苏糖醇(DTT)   154.2mg   H2O(MilliQ)   平衡至100ml

使用前即刻新鲜制备溶液。

通过裂解制备无细胞提取物

通过离心收获来自小规模培养(见前一段)的细胞，并弃去上清液。 将离心期间形成的细胞沉淀物在-20℃下冷冻至少16小时，然后在冰上融 化。向每个孔中添加500μl新鲜制备的裂解缓冲液，通过将平板剧烈振荡 2-5分钟重悬细胞。为了实现裂解，将平板在室温下孵育30分钟。为了去 除细胞碎片，将平板在4℃和6000g下离心20分钟。将上清液转移至新 鲜平板上，并置于冰上，直至进一步使用。

通过超声处理制备无细胞提取物

通过离心收获来自中等规模培养(见前一段)的细胞，并弃去上清 液。对0.5g湿细胞沉淀物添加1ml磷酸钾缓冲液pH 7，并通过剧烈振荡 重悬细胞。为了实现裂解，将细胞超声处理20分钟。为了去除细胞碎 片，将裂解物在4℃和6000g下离心20分钟。将上清液转移至新鲜管 中，并冷冻于-20℃下直至进一步使用。

将N-乙酰基-4-氨基丁醛生物转化成N-乙酰基-DAB

筛选条件

将所有酶重悬于100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5中至100μl的终体积。 通过添加含有胺供体(L-丙氨酸或(S)-α甲基苄胺)和辅因子(PLP)的 150μl储存溶液起始酶促反应。250μl反应混合物中的最终浓度为：N-乙 酰基-氨基丁醛(70mM)、胺供体(140mM)、PLP(12.5mM)。单独测试两种 胺供体。将反应混合物在28℃下孵育过夜(16.5和16小时)，同时在 IKA定轨摇床上于560rpm下摇动。孵育后终止反应混合物，并通过添加 750μl含有0.2％甲酸的乙腈的60％稀释液来稀释。将微量滴定板在3500 rpm下离心20分钟。通过LC-MS分析(见Resolve Job 2009-02-00649)进 行分析。

分析方法：

使用job 2009-01-00306中所述的分析方法，通过LC-MS分析总计 148个样品。检测界限；线性范围：对胺供体L-丙氨酸而言为0μmol/L- 550μmol/L，对胺供体(S)-α-甲基苄胺而言为0μmol/L-280μmol/L。

将N-乙酰基-4-氨基丁醛生物转化成N-乙酰基-DAB的结果

针对N-乙酰基-4-氨基丁醛成为N-乙酰基-DAB的途径，筛选总计148 种转氨酶。通过LC-MS，针对转化分析所有样品。基于N-乙酰基-DAB的 形成计算转化。使用L-丙氨酸作为胺供体时，发现总计31个氨基转移酶 命中(hits)(＞2％转化)。使用(S)-α-甲基苄胺作为胺供体时，发现其中 20个也是阳性的。这些阳性命中中的五个列举于表5中。

表5：

在N-乙酰基-4-氨基丁醛生物成为N-乙酰基-DAB的生物转化中显示 ＞2％转化的命中

N-乙酰基-DAB成为DAB的生物转化

筛选条件

将所有酶重悬于100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5中至100μl的终体积。 通过添加150μl磷酸钾缓冲液100mM中13.33mg/ml N-乙酰基-DAB.HCl (最终反应浓度8mg/ml≈48mM N-乙酰基-DAB)起始反应。将反应混合 物在37℃下孵育过夜，同时在IKA定轨摇床上于460rpm下摇动。孵育 后终止反应混合物，并通过添加750μl H₂O中100mM HClO₄，pH 1.0来 稀释。将微量滴定板在3500rpm下离心20分钟，并如下文所述通过 HPLC-PCR-FL分析DAB。

用于测定DAB的HPLC-MS分析方法

样品制备：

使用含有0.2％甲酸的乙腈和水的混合物稀释样品。乙腈的百分比必须 至少为50％。

LC条件：

MS条件：

在所采用的条件下DAB在6.3分钟洗脱。

N-乙酰基-DAB生物转化成DAB的结果

从所测试的酶中进行的选择列于表6中，所述选择在N-乙酰基-DAB 成为DAB的生物转化中显示水解活性。这些酶中的一些也通过它们并入 本专利申请的序列信息被表征。

表6：N-乙酰基-DAB成为DAB的水解

结论

发现大量水解酶可作为生物催化剂用于将N-乙酰基-DAB转化成 DAB。

可以通过例如4-氨基丁醛或鸟氨酸的酰化制备具有其他酰基-保护基 的DAB的N-保护的前体。例如，通过用甲酸中的乙酸酐酰化来引入甲酰 保护基，或通过C2-C6羧酸酐或酰氯的反应，分别引入N-乙酰基、N-丙 酰基、N-丁酰基、N-戊酰基或N-己酰基保护基。

预期这些DAB的N-保护的前体例如N-甲酰基-DAB和具有C3-C6酰 基保护基的更高的同源物能够通过上文所述的酶类似地转化。

N⁵-乙酰基-鸟氨酸成为N-乙酰基-DAB的生物转化

细胞培养和表达

使用脱羧酶进行所述生物转化。大部分脱羧酶在E.coli中在标准条件 下表达。

通过用带有pBAD-DEST_lysA、pBAD-DEST_kdcA、pBAD- DEST_kivD或pBAD-DEST_kgd的E.coli Top10从甘油菌种接种5ml LB^carb培养基制造预培养物。将预培养物在28℃下孵育过夜。将0.5ml每 种预培养物在50ml LB^carb培养基中稀释。将培养物在28℃下孵育，直至 达到0.6的OD₆₀₀(平均3-4小时后)。通过添加阿拉伯糖至0.02％的终浓 度，诱导蛋白质表达。在28℃下孵育过夜后收获细胞(10分钟，5000 rpm，4℃)。为了用SDS-PAGE进行分析，在诱导前、诱导后3小时和过 夜时采取1ml样品。使细胞形成沉淀物(5min，13,000rpm)并将沉淀物 储存于-20℃下。

培养两种鸟氨酸脱羧酶pBAD2_ODC E.coli DH5α/LJ110，并在略微不 同的条件下表达。将主培养物培养至1.5的OD₆₂₀，之后用50μM IPTG诱 导。所有其他条件与上文所述相同。

通过超声处理制备CFE

将细胞沉淀物在冰上融化，并重悬于2倍体积的50mM磷酸钾(KPi) 缓冲液pH 7.5中。将细胞悬浮液超声处理10分钟，所述处理有10秒开启 和闭合的脉冲。超声处理后通过离心(20分钟，13,200rpm，4℃)使细胞 碎片形成沉淀物。使用SDS-PAGE分析测定表达水平，并将CFE储存于- 20℃下。

所有N-Ac-鸟氨酸成为N-Ac-DAB的反应都在37℃下搅拌和孵育。 在0、2、18、28和44小时取样，并储存于-20℃下。为了进行分析，将 500μl每种样品添加至500μl乙腈中，并在最大速度下离心10分钟。在 TLC上分析样品，用铵∶甲醇(1∶1)的洗脱液洗脱，并用水合茚三酮喷雾染 色。为了进行定量分析，根据下文所述的方法通过LC-MS-MS测量样品。

用于测定N-乙酰基-DAB的HPLC-MS分析方法

样品制备：

使用含有0.2％甲酸的乙腈和水的混合物稀释样品。乙腈的百分比必须 至少为50％。

在来自Applied Biosystems的PE SCIEX API2000LC-MS/MS上进行实 验。

LC条件：

MS条件：

在所应用的条件下N-Ac-DAB在4.2分钟洗脱。

N⁵-乙酰基-鸟氨酸生物转化成N-乙酰基-DAB的结果

对鸟氨酸成为DAB的转化而言，在TLC上分析结束时间样品(44小 时)(图1)。

用LC-MS-MS分析所有结束时间样品。显示高于对照样品水平至少3 微摩尔数值的这些样品展示于表8中。

表8生物转化的LC-MS-MS结果