一种无患子皂苷生产质控分级标准品制备的方法

摘要

一种无患子皂苷生产质控分级标准品制备的方法，其生产步骤：加1-6倍的水，提取2-3次，合并提取液；离心得上清液；用石油醚萃取，弃上得下；用正丁醇萃取，弃下留上；旋转蒸发,得粉末；用水稀释至1.5-2.2%;用树脂柱吸附，水洗脱至无色，弃洗脱液；再以30%-80%的乙醇或甲醇洗脱，至无色，收集洗脱液；将醇挥发完全；用水稀释至1.5-2.2%；过MCI柱；水洗脱MCI柱，真空干燥得无患子苷的质控品；再用20%-40%乙醇或甲醇洗脱MCI柱，真空干燥得皮哨子苷的质控品；再用50%-95%乙醇或甲醇洗脱MCI柱，真空干燥得三萜皂苷类混合物的质控品。为进一步分离出无患子皂苷单体打下基础。

说明书

技术领域

本方法涉及一种制备无患子皂苷质控品的方法，特别是一种制备无患子皂苷质控标准品分级产品的方法。

背景技术

无患子(Sapindus mukorossi Gaerth.)在东南亚各国、我国的台湾省及淮河以南各省均有分布。无患子假种皮中含有丰富的糖苷类物质，具有良好的去污性和起泡性能，可作为天然活性物质用于洗发香波及各种洁肤护肤化妆品中；它还具有抗菌、止痒、美白等生理功效。无患子皂苷在自然界可被100％降解，温和无刺激。不会产生有害人体健康和有害环境的残留物，因此近年来成为医药、农药、化妆品行业的研究热点。

目前市场上没有无患子皂苷的质控品出售，对于无患子皂苷质控标准品的分级也罕有文献报道，因此给无患子皂苷的质量评价及常规检测分析带来一定的困难。解辉等研究人员将无患子水提液经大孔树脂吸附分离和硅胶柱吸附分离后，得到无患子总皂苷的标准品，纯度大于96％，可作为无患子总皂苷质控品。但无患子总皂苷是个混合物，内含有多种物质，按用途可分为如：1）无患子苷（表面活性较强，可作为天然的非离子型表面活性剂）： MukuroziosideⅠb即 无患子苷Ⅰb、MukuroziosideⅡb即无患子苷Ⅱb、MukuroziosideⅠa即无患子苷Ⅰa、MukuroziosideⅡa 即 无患子苷 Ⅱa、Mukurozioside A即无患子苷A；2）皮哨子苷（具有较好的抑菌作用，可作为天然的防腐剂）：PyishiauosideⅠb即皮哨子苷Ⅰb、PyishiauosideⅡb即皮哨子苷Ⅱb、PyishiauosideIVb即皮哨子苷IVb、PyishiauosideIVa即皮哨子苷IVa；3）无患子皂苷（具有抗肿瘤活性，可用于制备无患子皂苷中药静脉注射液）：Sapindoside A 即无患子皂苷A 、Sapindoside C即无患子皂苷C、Sapindoside K即无患子皂苷K、Sapindoside M即无患子皂苷M。因此，仅提供无患子总皂苷的标准品无法满足生产需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、提取物纯度较高的无患子皂苷生产质控分级标准品制备的方法。

本发明所采用的技术方案为一种无患子皂苷生产质控分级标准品制备的方法，该方法包括以下生产步骤： 1）将干燥的无患子果皮粉碎到5-20目，得到无患子果皮粉，加入重量为无患子果皮粉重量1-6倍的水，在20℃-70℃的恒温状态下搅拌，提取2-3次，每次提取1-9小时，过滤，合并提取液；2）用离心机分离得到上清液；3）将上清液用体积为其体积0.9-1.2倍的石油醚或乙醚进行液液萃取，静置待完全分为两层，弃去上层液体，得下层皂苷；4）将上步得到下层液体继续用体积为其体积1—1.5倍的正丁醇进行萃取，静置待完全分为两层，将下层弃去，上层留下；5）将上步得到的上层液体进行旋转蒸发,待液体全部蒸发，容器内只剩下粉末状物质； 6）取上步得到的粉末，用水稀释至固体浓度为1.5—2.2%; 7）将上步液体过80目筛子以除去沉淀；8)用体积为上述液体体积1.8—2倍体积的大孔吸附树脂柱对其进行吸附，具体吸附步骤为：将上清液上大孔吸附树脂柱，泵的流速根据柱压调节，柱压不能超过0.4MPa，然后用去离子水洗脱大孔吸附树脂柱至无色，所述的无色是指同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷或糖苷部分不再显色为止，弃去此部分洗脱液；9）再以30%-80%的乙醇或甲醇水溶液洗脱树脂柱，至无色，所述的无色是指同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷或糖苷部分不再显色为止，收集洗脱液；10）将收集的洗脱液经旋转蒸发至乙醇或甲醇挥发完全；11）将所剩余的洗脱液过80目筛子以除去沉淀，用水稀释至固体浓度为1.5—2.2%；12）再将过滤后的洗脱液过MCI柱，MCI柱体积为大孔吸附树脂柱体积的二分之一；13)用去离子水洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到含有MukuroziosideⅠb即 无患子苷Ⅰb、MukuroziosideⅡb即无患子苷Ⅱb、MukuroziosideⅠa即无患子苷Ⅰa、MukuroziosideⅡa 即 无患子苷 Ⅱa、Mukurozioside A即无患子苷A 的无患子苷类混合物质控标准品；14）再用20%-40%乙醇或甲醇水溶液洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到含有 PyishiauosideⅠb即皮哨子苷Ⅰb、PyishiauosideⅡb即皮哨子苷Ⅱb、PyishiauosideIVb即皮哨子苷IVb、PyishiauosideIVa即皮哨子苷IVa的皮哨子苷类混合物质控标准品；15）再用50%-95%乙醇或甲醇水溶液洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到含有Sapindoside A 即无患子皂苷A 、Sapindoside C即无患子皂苷C、Sapindoside K即无患子皂苷K、Sapindoside M即无患子皂苷M的三萜皂苷类混合物的质控标准品。

无患子苷、皮哨子苷均为倍半萜糖苷类。无患子皂苷为三萜皂苷类。

上述步骤中“10）将收集的洗脱液经旋转蒸发至乙醇或甲醇挥发完全”，是指乙醇或甲醇沸点较低，会先于水蒸出，比如若洗脱剂为1L 30%的乙醇或甲醇的水溶液,旋转蒸发时剩余液体体积小于700ml时，基本可以判断乙醇或甲醇已蒸发完全。

所述的离心机转速及时间为5000-10000rpm，10-30min。

所述的洗脱时去离子水及乙醇溶液的用量是以同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为标准，此时说明皂苷已全部被洗脱下来。

所述的大孔树脂柱为：AB-8、D101中的一种。

所述的MCI柱为： MCI GEL CHP 55A、MCI GEL CHP 55Y、MCI GEL CHP 20Y、MCI GEL CHP 20SS或MCI GEL CHP 20P中的一种。

本发明与现有研究相比，具有以下明显的优势和有益效果：

1.本方法工艺简单，溶剂无毒，易回收。

2.本发明将无患子总皂苷根据其不同的性能用途进行提取、分类，得到纯度大等于97%的三个不同部分的无患子皂苷质控品，用此三种标准品做出的标准曲线可对其他产品中的同类物质进行更细致的定量，克服了以往用无患子总皂苷定量不准确的缺陷，为进一步分离出无患子皂苷单体打下基础。

3.在某些特殊的情况下，若需要更高纯度的分级质控品，可将三部分洗脱液重复上MCI柱用三种溶剂反复洗脱，最后得到的产品纯度可接近100%。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业的技术人员更理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

一种无患子皂苷生产质控分级标准品制备的方法，其生产步骤为：其生产步骤为：1）将干燥的无患子果皮粉碎到5-20目，得到无患子果皮粉，加入重量为无患子果皮粉重量1-6倍的水，在20℃-70℃的恒温状态下搅拌，提取2-3次，每次提取1-9小时，过滤，合并提取液；2）用离心机分离得到上清液；3）将上清液用体积为其体积0.9-1.2倍的石油醚或乙醚进行液液萃取，静置待完全分为两层，弃去上层液体，得下层皂苷；4）将上步得到下层液体继续用体积为其体积1—1.5倍的正丁醇进行萃取，静置待完全分为两层，将下层弃去，上层留下；5）将上步得到的上层液体进行旋转蒸发,待液体全部蒸发，容器内只剩下粉末状物质； 6）取上步得到的粉末，用水稀释至固体浓度为1.5—2.2%; 7）将上步液体过80目筛子以除去沉淀；8)用体积为上述液体体积1.8—2倍体积的大孔吸附树脂柱对上步液体进行吸附，将上清液上大孔吸附树脂柱，泵的流速根据柱压调节，柱压不能超过0.4MPa，然后用去离子水洗脱大孔吸附树脂柱至无色，所述的无色是指同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷或糖苷部分不再显色为止，弃去此部分洗脱液；9）再以30%-80%乙醇或甲醇水溶液洗脱树脂柱，至无色，所述的无色是指同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷或糖苷部分不再显色为止，收集30%-80%乙醇或甲醇水溶液洗脱液；10）将收集的洗脱液经旋转蒸发至乙醇或甲醇挥发完全；11）将所剩余的洗脱液过80目筛子以除去沉淀；12）再将过滤后的洗脱液用水稀释至固体浓度为1.5—2.2%后，过MCI柱，MCI柱体积为大孔吸附树脂柱体积的二分之一；13)用去离子水洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂（水），真空干燥（温度50-70℃）得到含有MukuroziosideⅠb即 无患子苷Ⅰb、MukuroziosideⅡb即无患子苷Ⅱb、MukuroziosideⅠa即无患子苷Ⅰa、MukuroziosideⅡa 即 无患子苷 Ⅱa、Mukurozioside A即无患子苷A 的无患子苷类混合物质控标准品；14）再用20%-40%乙醇或甲醇水溶液洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到含有 PyishiauosideⅠb即皮哨子苷Ⅰb、PyishiauosideⅡb即皮哨子苷Ⅱb、PyishiauosideIVb即皮哨子苷IVb、PyishiauosideIVa即皮哨子苷IVa的皮哨子苷类混合物质控标准品；15）再用50%-95%乙醇或甲醇水溶液洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到含有Sapindoside A 即无患子皂苷A 、Sapindoside C即无患子皂苷C、Sapindoside K即无患子皂苷K、Sapindoside M即无患子皂苷M的三萜皂苷类混合物的质控标准品。

无患子苷、皮哨子苷均为倍半萜糖苷类。无患子皂苷为三萜皂苷类。

实施例1：1）将干燥的无患子果皮粉碎成8目的无患子果皮粉，在提取罐中加入无患子果皮粉500g加水2.5L，在40℃的恒温状态下搅拌，提取8小时，过滤(20目)得提取液，在剩余的残渣中再加入水2L，在40℃的恒温状态下搅拌，提取6小时，过滤(20目)得提取液，在剩余的残渣中再加入水750ml, 在40℃的恒温状态下搅拌，提取1小时，过滤得提取液，与前两次提取液合并；2）离心机离心分离， 5000rpm工作15min，得上清液约4L； 3)将4L上清液用4L石油醚进行液液萃取，静置待完全分为两层，上层主要为脂类等杂质，下层主要为皂苷（约3.5L），弃去上层液体；4）将上步得到的3.5L下层液体继续用4L正丁醇进行萃取，静置待完全分为两层，上层主要为皂苷，下层为糖类，将下层弃去，上层留下；5）将上步得到的上层液体进行旋转蒸发,待液体全部蒸发，容器内只剩下粉末状物质（约176g），可判断正丁醇已挥发完全，6）取上步得到的粉末20 g，用约1L水稀释至浓度为2%，7）将上步液体过80目筛子以除去沉淀；8）用体积为2L的大孔吸附树脂柱(AB-8)（也可用D101）对上步液体进行吸附，将1L上清液上大孔吸附树脂柱(泵的流速根据柱压调节，柱压不能超过0.4MPa)，然后用去离子水洗脱大孔吸附树脂柱(AB-8)至无色，所述的无色是指同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷或糖苷部分不再显色为止，这部分洗下的为蛋白质和糖等杂质，弃去此部分洗脱液；9）以60%乙醇水溶液洗脱树脂柱，至无色，所述的无色是指同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷或糖苷部分不再显色为止，收集60%乙醇水溶液洗脱液；10）将收集的洗脱液经旋转蒸发至原体积35%（因乙醇沸点较低，会先于水蒸出，比如若洗脱剂为1L 30%酒精,旋转蒸发时剩余液体体积小于700ml时，基本可以判断乙醇已蒸发完全。），除去乙醇；11)将剩余的洗脱液过80目筛子以除去沉淀；12）再将过滤后的洗脱液过MCI柱，MCI柱体积为1L（可以为： MCI GEL CHP 55A、MCI GEL CHP 55Y、MCI GEL CHP 20Y、MCI GEL CHP 20SS或MCI GEL CHP 20P中的一种）；13)用去离子水洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到6克纯度为97%的MukuroziosideⅠb即 无患子苷Ⅰb、MukuroziosideⅡb即无患子苷Ⅱb、MukuroziosideⅠa即无患子苷Ⅰa、MukuroziosideⅡa 即 无患子苷 Ⅱa、Mukurozioside A即无患子苷A 的无患子苷类混合物质控标准品；14）再用30%乙醇水溶液洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到4.8克纯度为97%的  PyishiauosideⅠb即皮哨子苷Ⅰb、PyishiauosideⅡb即皮哨子苷Ⅱb、PyishiauosideIVb即皮哨子苷IVb、PyishiauosideIVa即皮哨子苷IVa的皮哨子苷类混合物质控标准品；15）再用60%乙醇水溶液洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到7克纯度为97%的Sapindoside A即无患子皂苷A 、Sapindoside C即无患子皂苷C、Sapindoside K即无患子皂苷K、Sapindoside M即无患子皂苷M的三萜皂苷类混合物的质控标准品。

实施例2：1）将干燥的无患子果皮粉碎成5目的无患子果皮粉，在提取罐中加入无患子果皮粉500g加水2.5L，在40℃的恒温状态下搅拌，提取8小时，过滤(20目)得提取液，在剩余的残渣中再加入水2L，在40℃的恒温状态下搅拌，提取6小时，过滤(20目)得提取液，在剩余的残渣中再加入水1 L, 在40℃的恒温状态下搅拌，提取1小时，过滤得提取液（约4.3L），与前两次提取液合并；2）离心机离心分离， 5000rpm工作15min，得上清液约4.3L； 3)将上清液用4.5L乙醚进行液液萃取，静置待完全分为两层，上层主要为脂类等杂质，下层主要为皂苷，弃去上层液体；4）将上步得到的4L下层液体继续用4L正丁醇进行萃取，静置待完全分为两层，上层主要为皂苷，下层为糖类，将下层弃去，上层留下；5）将上步得到的上层液体进行旋转蒸发,待液体全部蒸发，容器内只剩下粉末状物质（约180g），可判断正丁醇已挥发完全，6）取上步得到的粉末21g，用约1L水稀释至固体浓度为1.8%，7）将上步液体过80目筛子以除去沉淀；8）用体积为2L的大孔吸附树脂柱（D101）对上步液体进行吸附，将1L上清液上大孔吸附树脂柱(泵的流速根据柱压调节，柱压不能超过0.4MPa)，然后用去离子水洗脱大孔吸附树脂柱至无色，所述的无色是指同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷或糖苷部分不再显色为止，这部分洗下的为蛋白质和糖等杂质，弃去此部分洗脱液；9）以60%甲醇水溶液洗脱树脂柱，至无色，所述的无色是指同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷或糖苷部分不再显色为止，收集60%甲醇水溶液洗脱液；10）将收集的洗脱液经旋转蒸发至原体积35%；11)将剩余的洗脱液过80目筛子以除去沉淀；12）再将过滤后的洗脱液过体积为1L的MCI GEL CHP 55A 柱；13)用去离子水洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到6克纯度为97%的MukuroziosideⅠb即 无患子苷Ⅰb、MukuroziosideⅡb即无患子苷Ⅱb、MukuroziosideⅠa即无患子苷Ⅰa、MukuroziosideⅡa 即 无患子苷 Ⅱa、Mukurozioside A即无患子苷A 的无患子苷类混合物质控标准品；14）再用30%甲醇水溶液洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到4.7克纯度为97%的  PyishiauosideⅠb即皮哨子苷Ⅰb、PyishiauosideⅡb即皮哨子苷Ⅱb、PyishiauosideIVb即皮哨子苷IVb、PyishiauosideIVa即皮哨子苷IVa的皮哨子苷类混合物质控标准品；15）再用60%甲醇水溶液洗脱MCI柱，同步进行薄层色谱分析直至洗脱下来的液体在平板上皂苷部分不再显色为止，停止洗脱，收集洗脱液进行旋转蒸发挥去大部分溶剂，真空干燥（温度50-70℃）得到6.9克纯度为97%的Sapindoside A 即无患子皂苷A 、Sapindoside C即无患子皂苷C、Sapindoside K即无患子皂苷K、Sapindoside M即无患子皂苷M的三萜皂苷类混合物的质控标准品。