一种用于测定β-微管蛋白III 基因表达的引物、探针及检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种用于β-微管蛋白III表达测定的引物、探针及检测试剂盒，用于检测β-tubulin III基因表达的引物和探针，包括：TUBB3-F TCTACTACAACGAGGCCTCTTCT；TUBB3-R CAAAGATGAAATTGTCAGGCCTGAA；TUBB3-P AGCCACACCAGAATGGCTCGAGGCACGTACCTCG；TUBB3-反转录-TTGCCGGCCCCACTCTGACCAAA。本发明的检测试剂盒可测定β-微管蛋白III mRNA的表达水平，为受试者提供基于紫杉醇类或长春碱类的治疗的可能抗性的方法。

说明书

发明领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及到使用定量荧光PCR确定β-微管蛋白III(β-tubulin III)在肿瘤细胞的基因表达和一种用于检测β-微管蛋白III表达的引物、探针、试剂盒及检测方法。 

发明背景 

肿瘤是机体的正常细胞在各种致癌因素下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的。当肿瘤细胞继续高速生长和分裂，生长处于失控状态，能侵入正常组织，并常常转移到远离其起源的部位生长，就会形成恶性肿瘤即癌症。当肿瘤形成时，临床的目标是希望可以选择性的杀死肿瘤细胞，同时减轻在治疗过程中，对机体正常细胞的损害。 

化疗是指应用化学药物治疗癌症的方法。化疗药物可以杀死癌细胞，抑制癌细胞的生长和繁殖，从而到达治疗或治愈的目的，化疗在杀伤癌细胞的同时，也会杀伤正常的细胞，产生毒副作用。肿瘤化疗作为一种全身性治疗，是目前临床恶性肿瘤治疗的主要手段之一。可消灭肿瘤原发灶及远距离转移的癌细胞，因此在肿瘤治疗中占有很重要的地位。目前研制出的化疗药物中，主要包括抗微管类药物，如紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱和长春瑞滨等，其主要作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药物。另一类为损害细胞的DNA，如顺铂和卡铂类药物，这些药物通常被称作基因毒性药物。其它类的化疗药物是干扰核酸生物合成，蛋白质合成及功能，如5-氟尿嘧啶，吉西他滨，甲氨蝶呤类药物，这些通常被称作抗代谢药物。然而，化疗药物的疗效与患者个体差异有关，这些差异包括病人对化疗药物的敏感程度以及对药物的耐受程度不同，同一个患者，某些化疗药物会有很好的疗效，而另一些药物则疗效差，甚至有些药物会产生严重的毒副作用。 

已有研究表明，肿瘤细胞内某些基因表达与化疗药物对肿瘤作用的敏感性和药物的耐 受程度有一定关系。不同肿瘤细胞对同一种药物的敏感性不同，同一肿瘤细胞对不同药物的反应也存在差异。因而，在化疗给药过程中，对每种药物的敏感性或抗性决定因素的鉴定和检测成为设计个体化疗的有效工具。 

已经发现的抗细胞微管类并且广泛使用的化疗药物是紫杉醇类和长春碱类，紫杉醇类和长春碱类化疗药物主要作用于肿瘤细胞中构成细胞骨架的微管结构。细胞微管(Microtubule)是真核生物细胞内重要的细胞骨架，是由13条原纤丝纵向排列构成中空的圆柱状结构体，每条原纤丝是tubulin α和β形成的二聚体所组成的。Tubulin α和β担任着维持细胞形态功能，传递细胞信号信息，参与有丝分裂等重要功能。(Giannakakou P，Sackett DL，Fojo T.Tubulin/Microtubules：still a promising target for new chemotherapeutic agents.J Natl Cancer Inst，2000；92；3182-3.)人类细胞中存在着6种β微管蛋白同型体，其中3型β-微管蛋白与作用于微管的化疗药物敏感性有最密切的关系。 

紫杉醇类化疗药物作用于肿瘤细胞G2/M期，主要通过与β-tubulin III第31位氨基酸残基和第217-231位氨基酸残基结合，诱使微管蛋白聚合，抑制其解聚过程。使维管束不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于G2/M期，导致肿瘤细胞有丝分裂异常或停止，使肿瘤细胞无法继续分裂而死亡。(Seve P，Dumontet C.Is class III beta-tubulin a predictive factor in patient receiving tubulin-binding agents？Lancet Oncol 2008；9：168-75)与紫杉类化疗药物相类似的，长春碱类化疗药物是作用于β-tubulin Ⅲ的175-213氨基酸残基，影响微管形成时新的微管蛋白二聚体的形成，使新形成的二聚体蛋白的原丝弯曲，不能延长，从而阻断微管聚合成纺锤体，破坏肿瘤细胞的有丝分裂，使微管和纺锤体失去正常功能而导致细胞死亡(Gan P，Pasquier E，Kavallris M.Class III-tubulin mediates sensitivity to chemotherapeutic drugs in non-small cell lung cancer.Cancer Res 2007；67：9356-63.)。 

已有研究报道，β-tubulinⅢ的表达水平与紫杉醇类化疗药物和长春碱类化疗药物疗效存在密切联系。Seve等(Sève P，Mackey J，Isaac S，Tredan O，Souquet PJ，PerolM，et al.Class III-Tubulin expression intumor cells predicts response and outcome inpatients with non-small cell lung cancer receiving paclitaxel.Mol Cancer Ther 2005；4：2001-7.)以47例非 小细胞肺癌患者为研究对象，发现在β-tubulin Ⅲ高表达者中紫杉醇类化疗药物的治疗有效率为12.5％，而在β-tubulin Ⅲ低表达者中其治疗有效率为61.9％，β-tubulin Ⅲ低表达患者的无复发生存期和总生存期均明显长于高表达者。Rosell等人(Rosell R，Scagliotti G，Danenberg KD，Lord RV，Bepler G，Novell O，et al.Transcripts in pretreatment biopsies from a three-arm randomized trial in metastatic non-small-cell lungcancer.Oncogene 2003；22：3548-52.)研究检测了非小细胞肺癌患者中β-tubulin Ⅲ基因的mRNA表达水平，结果发现在接受长春碱/顺铂化疗方案的患者中，低表达β-tubulin Ⅲ mRNA的患者有更高的化疗有效率，其生存期有明显的延长的趋势，预示了β-tubulin Ⅲ的表达水平可作为预测非小细胞肺癌患者对长春碱化疗疗效的重要指标。因此，β-tubulin Ⅲ在肿瘤内表达的水平可以用来确定紫杉醇类化疗药物和长春碱类化疗药物是否可以有效治疗癌症的主要预后因素。 

临床成本效益(Cost effectiveness)分析研究表明(A Clegg，DA Scott，P Hewitson，M Sidhu，N Waugh.Clinical and cost effectiveness of paclitaxel，docetaxel，gemcitabine，and vinorelbine in non-small cell lung cancer：a systematic review.Thorax 2002；57：20-8.)，采用紫杉醇类或长春碱类化疗药物治疗肺癌可以明显增加肿瘤患者的生存期，并且这种生存期的延长并没有显现出生存质量(Quality of Life)的下降和治疗费用支出的增加。研究发现，对肺癌患者接受以紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合铂类化疗药物为治疗的方案是非常受益的。β-tubulin Ⅲ基因作为与紫杉醇类和长春碱类化疗药物敏感性密切相关基因，因此，在实施化疗之前对于β-tubulin Ⅲ基因表达检测对于增加患者生存期，提高治疗生命质量，减少患者治疗成本，具有很重要的意义。 

目前，包括β-tubulin Ⅲ表达在内的定量检测基因表达的测定方法是分子生物医药领域研究的热点之一，其定量检测基因表达方法的灵敏度，准确性及衡量基因表达高低的计算方法，备受分子生物医药研究人员所关注。迄今为止，在该技术领域仍然没有较大的进展。因此，特别需要一种可以高效快速，高准确率，高灵敏度的定量基因表达的检测方法和一种简便的，可以直观衡量基因表达高低的计算方法，以便提供肿瘤治疗的早期预后。 

本发明提供一种检测患者肿瘤细胞中的β-tubulin Ⅲ mRNA表达量的检测方法，从 而评估各种石蜡包埋和新鲜组织中的β-tubulin Ⅲ表达水平，以预测肿瘤患者对紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合铂类药物治疗的可能的抗性。本发明同时提供了一种高效，高准确率，高灵敏度的实时定量荧光PCR检测方法和检测试剂盒及一种衡量基因表达高低的新的计算方法。 

发明内容

本发明一方面提供了评估测定石蜡包埋和新鲜组织细胞中β-tubulin Ⅲ mRNA表达水平的方法。 

本发明另一方面提供一种确定患者的化疗方案的方法，包括从肿瘤组织样品中分离RNA；测定样品中β-tubulin Ⅲ基因的表达水平；β-tubulinⅢ基因的表达水平与β-tubulin Ⅲ基因的参照组进行比较；基于β-tubulin Ⅲ基因的表达与参照组表达水平进行比较来确定的化疗方案。如果所述β-tubulin Ⅲ表达小于或等于β-tubulin Ⅲ表达水平的25％分位值，那么选择包含紫杉醇类或长春碱类以及紫杉醇类或长春碱类联合铂类的化疗药物进行治疗，而如果β-tubulin Ⅲ表达水平高于75％分位值，那么选择不含紫杉醇类或长春碱类以及紫杉醇类或长春碱类联合铂类的化疗为宜。 

本发明在实施方案中，提供用于测定β-tubulin基因表达的引物和探针的序列见表1。 

表1 引物和探针序列 

本发明另一方面提供了用于测定来自患者的组织样品中β-tubulin Ⅲ基因表达的试剂盒。在实施方案中，所述用于测定β-tubulin Ⅲ表达试剂盒包含：寡核苷酸引物，与β-tubulin Ⅲ杂交的正向引物，逆转录酶，DNA聚合酶，缓冲液和核苷酸，其中荧光PCR反应扩增体系如下： 

本发明另一方面，提供为受试者评价适宜的化疗方法。该方法包括采用实时定量荧光PCR测定肿瘤样品中的β-tubulin Ⅲ基因表达水平和基于β-tubulin Ⅲ基因表达水平确定的化疗方案，该方法包括以下步骤： 

(1)收集癌症患者的血清样本，提取其mRNA； 

(2)PCR引物和探针的设计与合成，引物和探针序列见表1； 

(3)总mRNA的分离制备； 

(4)总cDNA的合成； 

(5)进行实时荧光定量PCR扩增； 

(6)根据Ct值计算基因表达量的公式。包括：记录β-tubulin Ⅲ基因标准曲线上的数值C1，检测样品在内参基因β-actin标准曲线上的数值C2，再求相对比值＝C1/C2，然后对相对比值取自然对数，即：基因表达量＝ln(C1/C2)。 

本发明中所使用的抗细胞微管蛋白类化疗剂紫杉醇类和长春碱类，包括紫杉烷(taxanes)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他塞(docetaxel)、及长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春花生物碱(vinca alkaloids)、长春地辛(vindesine)和长春氟宁(vinflunine)。 

本发明所使用的含铂化疗剂，包括顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)，和奥沙 利铂(oxaliplatin)。 

本发明的试剂盒有益效果在于：采用基于特异性引物和新型双环探针技术，建立了实时PCR检测β-tubulin Ⅲ表达的检测方法，此方法：(1)灵敏度高，可以检出低至15拷贝的突变DNA；(2)特异性强，10⁴拷贝基因组DNA不会有非特异信号；(3)检测速度快，整个检测过程只需要90分钟即可完成。(4)提供一种新的基因表达计算方法，即记录β-tubulin Ⅲ基因标准曲线上的数值C1，检测样品在内参基因β-actin标准曲线上的数值C2，求相对比值＝C1/C2，然后对相对比值取自然对数，基因表达量＝ln(C1/C2)。该方法计算简便、方法科学直观。 

附图说明

图1为纳入Meta分析有关β-tubulin Ⅲ随机临床研究文献的纳入过程流程图。 

图2为β-tubulinⅢ低表达者和高表达者对紫杉醇类或长春碱类/紫杉醇类或长春碱类联合铂类的化疗疗效的Meta分析森林分析图。 

图3为β-tubulinⅢ低表达者和高表达者对接受紫杉醇类或长春碱类/紫杉醇类或长春碱类联合铂类化疗疗效的Meta分析漏斗分析图。 

图4为β-tubulinⅢ低表达者和高表达者在亚洲人和欧洲人对紫杉醇类或长春碱类/紫杉醇类和长春碱类联合铂类化疗对比的森林分析图。 

图5为参照组中β-tubulinⅢ基因表达量高与低分布图。 

发明详述 

本发明提供了一种高灵敏度，高准确率的实时定量荧光PCR方法测定β-tubulin Ⅲ基因表达的方法和试剂盒，并且采用Meta-analysis分析方法进行化疗方案的确定。 

以“Class III β-tubulin/β-tubulin”、“Cancer”和“Chemotherapy”通过计算机对PubMed、EMBASE、中国生物医学文献数据库(CBM)、中国期刊全文数据库(CNKI)和万方数据库等数据库进行检索。 

共检索到543篇相关的文章，经过阅读题目和摘要后，排除了430篇与β-tubulin Ⅲ 表达及化疗没有关系的文献。初步筛选了113篇相关文献，经阅读全文，其中有26篇与β-tubulin Ⅲ表达和临床化疗研究相关。再经阅读筛选，发现有11篇与β-tubulin Ⅲ表达和临床化疗文献符合纳入标准，在这11篇文献中，有7篇来自亚洲，4篇来自欧洲。在文献筛选过程中，文献纳入标准(1)研究设计：原始研究类型为前瞻性临床对照研究；(2)研究对象：经组织或细胞病理学确诊且未经手术治疗的癌症患者；(3)研究内容：研究β-tubulin Ⅲ高表达与β-tubulin Ⅲ低表达对紫杉醇类或长春碱类/紫杉醇类或长春碱类联合铂类化疗疗效的关系；(4)疗效评价采用WHO标准，以客观缓解率即完全缓解+部分缓解(CR+PR)为治疗有效率。以下文献是不被纳入的：(1)综述性研究和非临床研究；(2)研究对象及干预措施不符合入选标准；(3)未提供足够详细的生存资料信息，文献纳入过程如图1所示。 

文献资料的收集，分析和质量评价：由两位研究人员严格按照纳入标准进行筛选，纳入研究的文献质量评价采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)标准进行质量评价法。(Wells GA，Shea B，O’Connell D，Peterson J，Welch V，Losos M，et al.The Newcastle-Ottawa Scale(NOS)for assessing the quality of non randomised studies in meta-analyses；2003)评价系统由研究对象的选择，研究的可比性及研究结果组成：(1)表达量高组和表达量低组研究对象选择(满分4分)；(2)表达量高组和表达量低组研究对象的可比性(满分2分)；(3)结果评价(满分3分)。经筛选，最后有11项前瞻性的临床研究纳入Meta分析(见表2)，共累计病例534人，包括256例β-tubulin Ⅲ高表达患者和278例β-tubulin Ⅲ低表达患者，β-tubulin Ⅲ高表达患者的合并有效率为20.7％，β-tubulin Ⅲ低表达患者的合并有效率为50.7％。纳入研究的11项前瞻性临床研究基本特征见表3. 

本发明采用世界卫生组织(WHO)对实体瘤判定标准的客观缓解率为效应统计量，采用合并优势比(Odds Ration，OR)及其95％可信区间(Confidence internal，CI)作为化疗疗效分析统计量，对异质性，如果研究结果间有较好的同质性，采用固定效应模型(Fix effect)；反之采用随机效应模型分析(Random effects)；以上数据采用双侧检验。 

Meta分析结果：对纳入的11篇文献进行异质性分析，异质性：Chi²＝7.48，P＝0.68， I²＝0％采用固定效应模型；合并OR值为0.25，95％可信区间0.17-0.37，Z＝6.93，P＜0.00001，表明β-tubulin Ⅲ低表达患者和高表达患者对紫杉醇类或长春碱类/紫杉醇类或长春碱类联合铂类的化疗疗效有很显著差异。分析结果表明β-tubulin Ⅲ低表达患者对紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类和长春碱类联合铂类的化疗较敏感，β-tubulin Ⅲ高表达患者对紫杉醇或长春碱/紫杉醇和长春碱联合铂类的化疗有强的抗药性，结果森林分析图见图2，漏斗图如图3所示。 

同时采用Meta分析方法，对比了β-tubulin Ⅲ基因高表达患者和低表达者在亚洲人和欧洲人中对紫杉醇类或长春碱类/紫杉醇类或长春碱类联合铂类化疗敏感性的差异，亚组分析结果显示，Chi²＝0.04，P＝0.83，I²＝0％，表明β-tubulinⅢ高表达与低表达在亚洲人和欧洲人中对紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合铂类化疗具有相同的敏感性，两人群对接受紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合铂类化疗的敏感性是没有统计学差异的。对比分析森林图如4所示。 

因此，表达低水平β-tubulin Ⅲ mRNA的肿瘤可以确定选用基于紫杉醇类或长春碱类/紫杉醇类或长春碱类联合铂类的化疗，肿瘤患者具有更长的生存期。如果表达高水平β-tubulin Ⅲ mRNA的肿瘤可以确定无紫杉醇类或长春碱类/紫杉醇类或长春碱类联合铂类化疗为适宜。 

在测定包括β-tubulin Ⅲ基因表达方法是实施化疗早期预后重要基础，目前的测定基因表达的方法灵敏度低，特异性差，影响了测定的准确率。本发明提供一种基于特殊引物和探针的实时定量荧光PCR技术检测β-tubulin Ⅲ基因表达的测定和计算方法。应用该检测方法测定的准确率可达到99％，检测样本的敏感性可以低到1％，其整个测定过程只需90分钟即可完成。该检测方法具有灵敏度好、准确率高、特异性强、方便快捷等特点，其完整的测定过程如实施例。 

实施例1 

样本组织来源：取自2010-2011年送我公司检测的未经过化疗癌患者组织共65例，65例患者中男39例，女21例，其中腺癌54例，鳞癌11例。 

引物设计与合成：根据GeneBank的序列β-tubulin Ⅲ和管家基因β-actin进行引物设计。应用加拿大的Premier公司的Premier 5.0软件设计引物和探针，引物和探针序列如表1所示。 

病理组织RNA制备：对于新鲜的病理组织，在液氮环境下，剪取约1g左右，捣碎后使用RNA提取试剂盒(Qiagen，Blood & Tissue Kit)提取RNA。具体步骤按试剂盒的操作说明。对于石蜡包埋组织样品，采用RNA提取试剂盒(Qiagen，RNeasy FFPE kit)提取RNA，具体步骤按试剂盒的操作说明。上述所提RNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，PH＝8.0)，使用紫外分光光度计检测提取的RNA，要求D_260nm/D_280nm在1.9-2.1之间，并读取RNA含量。 

cDNA合成：采用厦门艾德生物医药科技有限公司试剂盒合成cDNA，取提取的RNA 1μg作为反应模板；在反应体系中加入0.04μL引物(50μmol/L)；0.04mM each dNTP；5μL Buffer(PH＝8.3)；3.75mM的MgCL₂；12.5mM DTT；1μL RNase Inhibitor(40U/μL)，用DEPC水补足到16μL。然后按以下步骤进行逆转录反应： 

(1)取上述逆转录反应混合液16μL，M-MLV逆转录酶1μl(200U/μL)，加入无菌离心管中，混匀。 

(2)加入待测样品的RNA 3μl，RNA总量在10ng-2μg范围内。 

(3)42℃保温1个小时。 

(4)95℃保温5分钟后立即置于冰上，离心收集产物，得到的cDNA溶液用于PCR扩增，合成cDNA后置于-70℃冰箱保存备用。 

将β-tubulin Ⅲ cDNA和管家基因β-actin标准品等比稀释成4个浓度，采取实时定量荧光PCR进行扩增，实时定量荧光PCR 25μL反应扩增体系如下： 

实时PCR反应条件：第一阶段：94℃5min 1个循环；第二阶段：94℃15S；60℃20S；72℃20S；10个循环；第三阶段：94℃15S；58℃35S；72℃15S；30个循环；根据扩增曲线的Ct值来进行定量分析。 

在实时定量荧光PCR反应过程中，本实施例采用的探针为一种“荧光双环探针”(Pat.No.200910300518.6)，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构。双环探针环形结构的消失引起荧光的产生，双环探针可以在该反应中，将完全匹配的靶序列检测出来，其荧光信号的强弱可反映目标序列的拷贝数，从而使检测灵敏度及准确率得到大幅度的提高。 

结果计算与统计：以β-tubulin Ⅲ cDNA和管家基因β-actin各自4个梯度标准品分别作标准曲线，要求β-tubulin Ⅲ和管家基因β-actin相关系数在0.97-1.00之间，所得到的Ct值与不同浓度标准品的对数值之间具有良好的线性关系。 

分别记录检测样品在β-tubulin Ⅲ基因标准曲线上的数值C1，检测样品在内参基因β-actin标准曲线上的数值C2，再求相对比值＝C1/C2，然后对相对比值取自然对数，即Y＝ln(C1/C2)。 

采用SPSS 13.0统计软件对计算结果进行累计频率统计，采用二分法将β-tubulin Ⅲ基因表达分为低和高的表达阈值，如果表达水平小于或等于25％分位值时表现为低表达，如果表达大于或等于75％分位值时表现为高表达，计算结果如见表4，统计分布如图5所示。 

在确定基于紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合铂类化疗药物为治疗的方案中，β-tubulin Ⅲ基因表达水平的低和高是相对值是通过与参照组的值比较的(如，Lord et al.，Clin Cancer Res；2002，2286-2291)，如果表达水平等于或低于参照组中的25％分位值β-tubulin Ⅲ表达水平，表现为β-tubulin Ⅲ低表达；如果表达水平高于参比组中的75％分位值β-tubulin Ⅲ表达水平，表现为β-tubulin Ⅲ高表达。参照 组的样品应来自相同类型的肿瘤的患者，并且未经过任何化疗，参照组的分析数据应至少大于20位受试者的肿瘤样品。 

实施例2 

取2011年5月送我公司检测腺癌患者石蜡包埋组织样本2例，记为病人A与病人B。按照实施例1所述之检测试剂盒和方法进行β-tubulin Ⅲ mRNA提取、合成cDNA、和实时荧光PCR定量测定(实验步骤按照试剂盒说明书操作步骤进行操作)。以β-tubulin Ⅲ cDNA和管家基因β-actin各自4个梯度标准品分别作标准曲线，β-tubulin Ⅲ和管家基因β-actin相关系数为0.98。分别记录检测样品在β-tubulin Ⅲ基因标准曲线上的数值C1，检测样品在内参基因β-actin标准曲线上的数值C2。 

运用公式：Y＝ln(C1/C2) 

分别计算两名患者的β-tubulin Ⅲ基因表达量，计算结果见表5。 

将所计算值与实施例1的参照组进行对比，结果显示病人A的β-tubulin Ⅲ基因表达高于参照组75％分位值，因此采用不含紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合铂类的化疗为适宜。病人B的β-tubulin Ⅲ基因表达低于参照组25％分位值，因此采用包含紫杉醇类或长春碱类及紫杉醇类或长春碱类联合铂类药物的化疗方案为宜。 

上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。 

表2 纳入Meta分析的11项临床研究的Newcastle-Ottawa Scale(N0S)标准的质量评价表 

表4 参照组中在25％，50％和75％分位时的β-tubulinⅢ基因表达值及相对表达值。 

表5 对欲实施化疗的病人A与病人B进行的β-tubulinⅢ基因表达测定的计算结果