利用竞争性微生物提高埃博霉素发酵产量的方法及应用

摘要

本发明公开了一种利用纤维堆囊菌的竞争性微生物少根根霉或斜卧青霉代谢产物诱导提高埃博霉素发酵产量的方法。本发明所述方法是培养竞争性微生物并提取其代谢产物，将该代谢产物添加到纤维堆囊菌发酵培养基中，利用该外界添加物的刺激来激活埃博霉素生产菌株内部的相关调控基因，进一步激发埃博霉素的合成。经检测，采用此法后埃博霉素发酵产量与原始条件相比可以提高46.3～58.7％，该方法具有重要的理论意义和经济价值。

说明书

技术领域

本发明涉及利用竞争性微生物及其代谢产物诱导纤维堆囊菌(Sorangium  cellulosum)提高埃博霉素(epothilone)发酵产量的方法及其在抗生素发酵生产中的应用， 属于微生物技术领域。

背景技术

埃博霉素是一类由粘细菌纤维堆囊菌合成的大环内酯类化合物，具有促微管聚合活 性，其作用机制类似于紫杉醇紫杉醇及其类似物是目前临床上最为成功的抗 肿瘤化疗药物，被用于卵巢癌、胸腺癌、肺癌和肝癌等实体癌的治疗，是美国FDA认 定的实体瘤化疗首选药物。紫杉醇虽然广为采用，但仍然有一些缺点，如水溶性低，毒 副作用明显，易产生耐药性等等，在一定程度上限制了其应用。而埃博霉素与紫杉醇相 比则具有如下明显的优势：①分子结构简单，水溶性更好；②其噻唑环结构与微管作用 更加紧密；③不会产生长期使用紫杉醇类药物带来的白细胞减少，脱发等症状；④具有 比紫杉醇更广泛的抗肿瘤谱，一般比紫杉醇的抗肿瘤活性高5-25倍；⑤具有对多重耐 药性及耐紫杉醇肿瘤细胞的很高的细胞毒活性，比紫杉醇强2000-5000倍；⑥是目前发 现的唯一一种由微生物产生的促微管聚合活性化合物，可以通过发酵进行大规模制备， 不必像紫杉醇那样必须通过对杉树的采伐或者复杂的化学合成途径来获取。因此埃博霉 素被认为是紫杉醇类抗肿瘤化合物的更新换代产品。目前已经发现了多种埃博霉素结构 类似物，而且目前已经有多种埃博霉素类化合物进入不同阶段的临床评估，如 BMS-247550、BMS310705、KOS-862以及ZK-EPO等，它们均为纤维堆囊菌的发酵产 物或者发酵产物的化学衍生物。埃博霉素已经成为目前生物医药方面令人兴奋地研究 热点之一，目前其发酵产量的较低是制约埃博霉素应用的瓶颈。

目前针对微生物药物发酵产量提高主要有两种策略，即传统手段育种和发酵条件优 化，对工业菌株进一步采用传统育种方法让产量大幅提高的潜力不大，而另外一些遗传 背景不清晰或操作手段不完善的菌株如纤维堆囊菌，菌种改良方法效率也不高；发酵条 件优化作为提高产量的另一关键技术也已经在几乎所有发酵生产过程中被引入，但是菌 株对营养物质的代谢能力有限，我们不可能通过发酵条件优化方法无限制的提高产量。 当某些菌株经过不断地育种或发酵条件优化试验后，产量达到某一瓶颈，采用这两种手 段很难再有突破。

发明内容

本发明针对传统育种手段和发酵条件优化提高抗生素产量方法上的一些不足，以纤 维堆囊菌发酵生产埃博霉素为材料，提供了一种使用竞争性微生物及其代谢产物有效刺 激提高抗生素产量的方法，以及该方法在一些抗生素发酵工艺中的应用。

本发明的技术方案如下：

埃博霉素生产菌株为纤维堆囊菌So0157-2，该菌种由山东大学微生物技术国家重点 实验室李越中教授提供，目前保藏于中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，编号 NO.M208078。

竞争性微生物为本课题组自行筛选得到的与纤维堆囊菌So0157-2存在竞争性生存 关系的少根根霉(Rhizopus arrhizus)ATCC56015菌株和斜卧青霉(Penicillium  decumbens)UC086(中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC 4075)。少 根根霉菌株在马铃薯琼脂平板培养基(PDA)上生长，菌落圆形，扩展，最初2天菌丝 体为白色生长密集。菌落表面平坦，孢子成粉状覆盖菌落表面，菌落与培养基结合紧密。 显微镜下观察菌丝体透明，菌丝无隔、多核、分枝状，在假根的上方长出一至数根孢囊 梗，顶端长球形孢子囊。囊的基部有囊托，中间有球形或近球形囊轴。囊内产大量孢囊 孢子，成熟后孢囊壁消解或破裂，释放球形或卵形等孢囊孢子。斜卧青霉菌株在马铃薯 琼脂(PDA)平板培养基上生长，菌落圆形，扩展，最初2天菌丝体为白色生长密集。 菌落表面平坦，孢子呈粉状覆盖在菌落表面，整个菌落与培养基结合很紧密，菌落背面 呈暗黄色。显微镜下观察菌丝体透明，分枝多且有横隔，顶端的分生孢子梗不对称分布， 分生孢子梗呈扫帚状，分生孢子呈圆形或椭圆形，表面光滑呈灰绿色(图3)。

1.上述竞争性微生物菌株的发酵产物制备方法步骤如下：

(1)将菌株接种于活化培养基，培养条件：温度27～29℃，培养3～4天，得活 化后的菌株。

(2)取活化后的菌株接种于营养培养基中，于25～35℃、100～300r/min的培养条 件下培养2～4天。

(3)向发酵液中按体积比1∶1加入乙酸乙酯，200r/min搅拌抽提3小时，重复2次 后将乙酸乙酯相合并，真空干燥。

(4)采用1/200～1/100发酵液体积的有机溶剂溶解步骤(3)所得干燥产物，离心 或微滤后清液即为竞争性菌株的代谢产物。

所述步骤(1)中的菌株为纤维堆囊菌的竞争性少根根霉ATCC56015菌株和斜卧青 霉UC086。

所述步骤(1)中的活化培养基组分如下：马铃薯(去皮)：200g，葡萄糖：20g，琼 脂：20g，水：1000mL，pH值自然。

所述步骤(2)中的营养培养基组分如下：碳源1～5g/L，氮源1～5g/L，无机盐0.01～ 2g/L，碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉中的一种或其组合；氮源选 自酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、硝酸钠、硫酸铵中的一种或其组合； 无机盐选自硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰中的一 种或其组合；pH 5.0～9.0。

上述营养培养基组分如下：葡萄糖3～5g/L，酵母浸粉3-5g/L，硫酸镁为0.1～1g/L。

所述步骤(2)中营养培养基的接种量为5×10⁶～1×10⁸个/mL。

所述步骤(3)中采用的乙酸乙酯为分析纯度以上试剂，真空干燥温度在45℃以下。

所述步骤(4)中使用的有机溶剂为分析纯度以上丙酮、甲醇、乙醇或异丙醇试剂， 离心时使用灭菌处理的离心管，转速为10000r/min，时间10min，离心后清液转入灭 菌处理的容器中，微滤条件为灭菌处理的0.22μm微孔滤膜过滤。

所述步骤(4)中所得的竞争性菌株发酵产物制备后保存温度为4℃。

2.上述竞争性微生物发酵产物诱导提高埃博霉素产量方面的应用，应用步骤如下：

(1)取纤维堆囊菌So0157-2接种至种子培养基，30℃培养3～4天。

(2)配制纤维堆囊菌产埃博霉素发酵培养基，灭菌处理后在无菌条件下向其中加 入1/50～1/100体积的竞争性微生物发酵产物丙酮溶液。

(3)将纤维堆囊菌种子液中的菌团使用灭菌处理的带有玻璃珠的转瓶打碎，接种 至添加了竞争性微生物发酵产物的发酵培养基中，30℃培养一周。

(4)收集发酵液中的树脂，蒸馏水洗去菌体和发酵液后用甲醇萃取过夜后HPLC 进行埃博霉素定量分析。

所述步骤(1)中种子培养基为碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳 糖、柠檬酸中的一种或其组合，添加量为1～5g/L；氮源选自蛋白胨、胰蛋白胨、酵母 膏、玉米浆、硫酸铵、硝酸钠中的一种或其组合，添加量为1～5g/L；无机盐选自硫 酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰中的一种或其组合，添加 量为0.0001～2g/L，pH 5.0～9.0。

所述步骤(2)中发酵培养基为碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳 糖、柠檬酸中的一种或其组合，添加量为1～5g/L；氮源选自蛋白胨、胰蛋白胨、酵母 膏、玉米浆、硫酸铵、硝酸钠中的一种或其组合，添加量为1～5g/L；无机盐选自硫 酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰中的一种或其组合，添加 量为0.0001～2g/L，pH 5.0～9.0。

上述发酵培养基为葡萄糖为3～5g/L，马铃薯淀粉3～5g/L，酵母膏为3～5g/L， 蛋白胨为0.1～1g/L，氯化钙0.1～1g/L，硫酸镁为0.0001～0.01g/L，硫酸亚铁为0.0001～ 0.01g/L。

所述步骤(4)中使用的甲醇为色谱纯度以上溶剂，色谱条件为：Shimadzu ODS-C18 色谱柱(4.6×250mm)，流动相甲醇∶水(13∶7)，流速0.8mL/min，检测波长249nm，进 样量10μL。

经检测，与不添加竞争性微生物发酵产物相比，添加后纤维堆囊菌的埃博霉素发酵 产量提高46.3～58.7％，菌体量也有明显提高。

附图说明

图1竞争性菌株ATCC56015和CGMCC4075的菌落及菌丝体照片；

图2埃博霉素的HPLC色谱结果；

图3改进后的培养方法与初始方法产量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

1.少根根霉ATCC56015发酵产物制备方法，步骤如下：

(1)取保藏菌株接种于活化培养基，培养条件：温度29℃，培养3天活化。

(2)取活化后的根霉菌株接种于营养培养基中，于30℃、150r/min的培养条件下 培养4天。

(3)向发酵液中按体积比1∶1加入乙酸乙酯，200r/min搅拌抽提3小时，重复2次 后将乙酸乙酯相合并，真空干燥。

(4)采用1/200发酵液体积的丙酮溶解步骤(3)所得干燥产物，微滤后清液即为 竞争性菌株代谢产物。

所述步骤1中的活化培养基为：马铃薯(去皮)：200g，葡萄糖：20g，琼脂：20g， 水：1000mL，pH值自然。

所述步骤2中的营养培养基为：葡萄糖5g/L，酵母浸粉3g/L，硫酸镁为0.5g/L。

2.竞争性微生物根霉菌株代谢产物诱导提高埃博霉素产量方面的应用：

(1)取纤维堆囊菌So0157-2接种至种子培养基，30℃培养3天。

(2)配制纤维堆囊菌产埃博霉素发酵培养基，灭菌处理后在无菌条件下向其中加 入1/100体积的根霉产物丙酮溶液。以不添加该根霉产物的发酵培养基做为对照。

(3)将纤维堆囊菌种子接种至添加了根霉产物的发酵培养基中，30℃培养一周。

(4)收集发酵液中的树脂，蒸馏水洗去菌体和发酵液，用甲醇萃取后进行埃博霉 素HPLC定量分析。

经检测，添加少根根霉ATCC56015代谢产物后，埃博霉素产量由50.26mg/L提高 至73.56mg/L，提高46.35％。

实施例2

1.少根根霉ATCC56015代谢产物制备方法，步骤如下：

(1)取根霉菌株接种于活化培养基，培养条件：温度30℃，培养3天活化。

(2)取活化后的根霉菌株接种于种子培养基中，于30℃、150r/min的培养条件下 培养4天。

(3)向发酵液中按体积比1∶1加入乙酸乙酯，200r/min搅拌抽提3小时，重复2次 后将乙酸乙酯相合并，真空干燥。

(4)采用1/200发酵液体积的甲醇溶解步骤(3)所得干燥产物，10000r/min离心 10min后清液即为竞争性菌株的代谢产物。

所述步骤1中的活化培养基为：马铃薯(去皮)：200g，葡萄糖：20g，琼脂：20g， 水：1000mL，pH值自然。

所述步骤2中的营养培养基为：葡萄糖5g/L，酵母浸粉5g/L，硫酸镁为0.5g/L。

2.竞争性微生物根霉菌株产物诱导提高埃博霉素产量方面的应用

(1)取纤维堆囊菌So0157-2接种至种子培养基，30℃培养3天。

(2)配制纤维堆囊菌产埃博霉素发酵培养基，灭菌处理后在无菌条件下向其中加 入1/50体积的根霉产物丙酮溶液。以不添加该产物的发酵培养基做为对照。

(3)将纤维堆囊菌种子接种至添加了根霉菌株RZ2161发酵产物的发酵培养基中， 30℃培养一周。

(4)收集发酵液中的树脂，蒸馏水洗去菌体和发酵液后用甲醇萃取过夜后HPLC 进行埃博霉素定量分析。

经检测，添加少根根霉ATCC56015代谢产物使埃博霉素产量由52.14mg/L提高至 77.83mg/L，提高49.27％。

实施例3

1.菌株斜卧青霉CGMCC 4075代谢产物制备方法，步骤如下：

(1)取青霉菌株接种于活化培养基，培养条件：温度30℃，培养3天活化。

(2)取活化后的青霉菌株接种于营养培养基中，于30℃、150r/min的培养条件下 培养4天。

(3)向发酵液中按体积比1∶1加入乙酸乙酯，200r/min搅拌抽提3小时，重复2次 后将乙酸乙酯相合并，真空干燥。

(4)采用1/200发酵液体积的乙醇溶解步骤(3)所得干燥产物，10000r/min离心 10min后清液即为竞争性微生物的代谢产物。

所述步骤1中的活化培养基为：马铃薯(去皮)：200g，葡萄糖：20g，琼脂：20g， 水：1000mL，pH值自然。

所述步骤2中的营养培养基为：葡萄糖4g/L，酵母浸粉4g/L，硫酸镁为0.5g/L。

2.竞争性微生物青霉菌株代谢产物诱导提高埃博霉素产量方面的应用

(1)取纤维堆囊菌So0157-2接种至种子培养基，30℃培养3天。

(2)配制纤维堆囊菌产埃博霉素发酵培养基，灭菌处理后在无菌条件下向其中加 入1/50体积的青霉产物丙酮溶液。以不添加该产物的发酵培养基做为对照。

(3)将纤维堆囊菌种子接种至添加了青霉菌株PZ2161发酵产物的发酵培养基中， 30℃培养一周。

(4)收集发酵液中的树脂，蒸馏水洗去菌体和发酵液后用甲醇萃取过夜后HPLC 进行埃博霉素定量分析。

经检测，添加PZ2161发酵产物后埃博霉素产量由47.98mg/L提高至76.16mg/L， 提高58.75％。

当理解的是，上述具体实施方式仅仅是举例性说明，对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要 求的保护范围。