一种玉米心叶特异性启动子及其在转基因育种中的应用

摘要

本发明公开了一种玉米心叶特异性启动子及其在转基因育种中的应用。该启动子为玉米ZmPsbS1基因的启动子，具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者是在严格条件下可与该序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。本发明的启动子具有心叶组织特异性，可应用于转基因植物育种领域，通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到植物(例如玉米)中，驱动下游基因在植物心叶中特异表达，达到育种目的。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及植物启动子的克隆及其应用，具体涉及一种玉米心叶特异性启动子的克隆及其功能分析。

背景技术

玉米不仅是粮、饲兼用的主要作物，而且还是重要的工业原料。随着工业化的普及和加快，耕地面积的减少、环境的恶化和食物短缺的矛盾日益尖锐，而常规育种技术无法满足人类对玉米新品种高产优质、抗病抗逆的需求。十多年来，已经利用转基因技术培育出一批抗虫、抗病、抗除草剂、抗盐、抗旱、优质的玉米新品种。

玉米螟(即玉米钻心虫)是玉米的主要害虫之一，对玉米危害极大，可导致玉米减产10％以上。而由于玉米对玉米螟的内源抗性受多基因控制，常规育种方法不仅周期长，且抗性与高产负相关，抗瞑育种难度较大，20年间各国均未取得明显进展。

进入20世纪90年代，通过转基因方法将来源于苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因导入玉米以获得抗虫品种取得突破性进展，转Bt基因玉米抗虫效果明显，平均增产5-10％。然而转基因植物的安全性一直是人们关注的焦点，其中外源基因的表达有可能改变植物自身的代谢，从而带来目前不为人所知的潜在风险。

为了更安全、高效防治玉米螟，将外源基因表达对植物和环境的影响降到更低，在转基因载体中使用心叶特异表达基因的启动子代替组成型CaMV35S启动子驱动Bt毒蛋白的表达，不仅可以控制在幼嫩心叶中为害的第一代玉米螟初孵幼虫，而且可以将外源基因表达带来的潜在风险降到最低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米心叶特异性启动子，该启动子可驱动基因在玉米心叶中特异高表达。

本发明的技术方案如下：

一种玉米心叶特异性启动子，来源于玉米(Zea mays ssp.Mays L.)，具有如下a)或b)的核苷酸序列：

a)序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；

b)在严格条件下与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No：1长1475bp。

含有本发明启动子的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明通过实时荧光定量PCR(real-time fluoresent quantitative polymerase chainreaction，FQ-PCR)技术进行分析，发现ZmPsbS1基因在玉米幼嫩的心叶中特异性高表达，克隆该基因的启动子，命名为WS2-ZmPro，其序列如SEQ ID No：1所示。

本发明的启动子具有心叶组织特异性，可应用于转基因植物育种领域，通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到植物(例如玉米)中，驱动下游基因在植物心叶中特异性高表达，达到育种目的，例如驱动Bt毒蛋白的基因在玉米心叶中特异性高表达，从而获得安全、高效抗玉米螟的转基因玉米。

附图说明

图1显示了ZmPsbS1基因在玉米各组织中的相对表达量。

具体实施方式

下面通过实施例，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。

本实施例通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)验证了ZmPsbS1基因在玉米幼嫩心叶中的特异高表达，从而克隆出其启动子，该启动子长1475bp，序列见序列表中SEQ ID No：1。

一、材料

玉米(Zea mays ssp.Mays L.)，在26℃温室中生长4周，每天光照16小时，黑暗8小时。

二、总RNA的提取及cDNA合成

1、玉米各组织总RNA的提取

取4周龄玉米的根、茎以及心叶，分别在液氮中将2g新鲜洁净的玉米组织研磨为粉末，转移到1ml Trizol溶液(invitrogen公司)中，混匀，加入200μl氯仿，充分混匀，室温下静置2分钟，4℃、12000g离心15分钟，吸出上清，转移到新的eppendorf管中，加入500μl异丙醇，混匀，4℃、12000g离心10分钟，弃上清，加入1000μl 75％乙醇洗涤一次，弃上清，所得RNA沉淀溶于50μl DEPC-ddH₂O中。

2、cDNA合成

将30.5μl总RNA溶液在70℃变性5-10分钟后置于冰上，迅速加入下列试剂：12μl 5×逆转录缓冲液，10μl dNTPs(2.5mmol/L)，6μl DTT(0.1mol/L)，1μl 0.1mmol/L Oligo(dT)15，0.5μl RNase抑制剂(Taara公司)，1μl MMLV逆转录酶(invitrogen公司，200u/μl)，然后在42℃保温1小时。

三、实时荧光定量PCR检测各候选基因的组织表达特异性

由于ZmGAPDH在玉米各组织表达量一致，所以检测玉米各基因的相对表达量一般使用ZmGAPDH作为内参基因，采用如下引物对其cDNA进行扩增：

正向引物序列P1：5′-CCTGCTTCTCATGGATGGTT-3′(SEQ ID No：2)；

反向引物序列P2：5′-TGGTAGCAGGAAGGGAAACA-3′(SEQ ID No：3)。

采用如下引物扩增ZmPsbS1基因的cDNA：

正向引物序列P3：5′-GATAGAGCCGCTCGTCATCT-3′(SEQ ID No：4)；

反向引物序列P4：5′-TACACAGCAAAGCACTTACGC-3′(SEQ ID No：5)。

反应体系如下：10μl 2×Real-time PCR Master Mix(Toyobo公司)，0.1μl cDNA，2μl正向引物(1μmol/L)和2μl反向引物(1μmol/L)，5.1μl ddH₂O。

反应条件为：94℃30s，54℃60s，72℃20s，45个循环。ZmGAPDH和ZmPsbS1的读板温度分别为84℃和87℃。检测结果见图1，由图可知，相比于ZmGAPDH基因的表达量，ZmPsbS1基因在玉米心叶中高表达，在根和茎中几乎不表达。

四、ZmPsbS1启动子的克隆

1.玉米叶片总DNA的提取

用CTAB法提取植物叶片的总DNA。在液氮中磨碎2g样品，加入3ml 2×CTAB(2％w/v)，并添加1.4mol/LNaCl、0.2％(v/v)巯基乙醇、20mmol/LEDTA和10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，60℃保温45min，在加入等体积酚/氯仿，12000rpm室温离心10min。将上清液转入新eppendorf管中，再加入氯仿∶己戊醇(体积比24∶1)抽提，上清液加入两倍体积乙醇置室温沉淀20min后，12000rpm、4℃离心15min，去除上清液。沉淀分别用70％乙醇洗涤一次，DNA沉淀干燥后溶于100μl ddH₂O中。

2.ZmPsbS1启动子的克隆

以叶片的总DNA为模板，扩增ZmPsbS1的启动子，所使用的引物如下：

正向引物序列P5：5′-TATCTTGCTGCGAAGCAAATATTG-3′(SEQ ID No：6)；

反向引物序列P6：5′-ATGGACTGCGCTGCCATATG-3′(SEQ ID No：7)。

反应体系如下：2μl总DNA，5μl 10×缓冲液，3μl MgSO₄(25mmol/L)，5μldNTPs(2mmol/L)，KOD DNA聚合酶1μl，32.5μl ddH₂O，1μl正向引物(20μmol/L)和1μl反向引物(20μmol/L)。

反应条件为：98℃10s，50℃30s，68℃65s，36个循环。经电泳检测获得长1475bp的DNA片段，测序得SEQ ID No：1所示序列。

上述实验通过实时荧光定量PCR验证各候选基因在玉米各组织的相对表达量，并克隆在心叶特异高表达基因-ZmPsbS1的启动子，该启动子有望在以后的抗虫转基因育种中有重要的应用前景。