小麦胚乳特异性启动子的改造及其在创制小麦高赖氨酸转基因新种质中的应用

摘要

赖氨酸为人体必需氨基酸，在人体新陈代谢中发挥重要作用，赖氨酸缺乏会导致人体中枢神经发育不良，同时影响免疫功能。小麦是全球最重要的粮食作物之一，也是人类获取植物蛋白质最重要的来源。而一般小麦品种籽粒中赖氨酸含量很少，平均仅在0.44％左右，而一个健康成年人每天需要的赖氨酸量是30mg·kg-1，远远不能满足人体的需要，因此赖氨酸成为小麦籽粒营养品质中第一限制性必需氨基酸，对其籽粒营养价值的影响非常大。常规育种技术在作物高赖氨酸育种中起到了一定的推动作用，尤其是在玉米和大麦中，但研究证明小麦赖氨酸的含量在不同品种间和种内的变化均较小，因此通过品种间杂交和远缘杂交获得小麦高赖氨酸品系的潜力很小。近年来，随着分子生物学的发展使在分子水平开展小麦赖氨酸品质育种成为可能。
　　 籽粒特异性表达的高活性启动子是通过基因工程手段提高小麦籽粒中赖氨酸含量的重要方法之一，本文旨在改造并获得高活性人工启动子，并与辣椒中克隆的高赖氨酸蛋白基因Cflr构建表达载体，通过基因枪法转入小麦，获得高赖氨酸的转基因小麦新种质。
　　 高分子量麦谷蛋白亚基(GS)启动子是目前已知的高活性的胚乳特异性启动子。其中的Bx7超量表达亚基(Bx7OE)是近年发现对小麦品质有重要贡献的优质亚基，其启动子的活性强。本文根据已公布的HMW-GS Bx7基因序列(GenBank: DQ119142.1)设计引物，利用PCR技术扩增HMW-GS Bx7OE基因启动子。根据数据库PLACE与PlantCARE，对功能区域进行分析，结果表明:Bx7OE启动子序列具有典型的TATA框和CAAT框，存在种子特异性启动子元件有6个E-box、4个G-box、7个RY基序、6个B-box核心序列元件。整个序列中A+T占62.29％＞60％，为富含AT区，作为一般增强子起作用。其中还存在多个光响应元件、分生组织特异激活元件、胚乳特异表达调控元件等共49个特异性作用元件。在Wild Cat中克隆的超表达HMW-GS Bx7OE启动子比在扬麦158、中优16中克隆的Bx7启动子在-1090-1047之间多出43bp的核苷酸序列，功能分析得知其上有一个CAAT-box，它是增强子响应元件。
　　 对启动子进行改造构建人工启动子，改造后包括截短的HMW-GS Bx7OE基因启动子核心区域和水稻actin基因的第一个内含子，并在转录起始位点进行了改良。根据有关报道贮藏蛋白基因没有内含子，在启动子区域增加一个内含子能提高基因的表达水平，Joshi等研究表明在PCR扩增actin的3'末端增加7个碱基GACCGCC有利于提高转录效率。我们构建了7个人工启动子，与Ubiquitin、Bx7OE启动子一起与GUS报告基因融合构建9个瞬时表达载体，通过基因枪法分别导入小麦胚乳组织，以Ubiquitin启动子为对照，经GUS染色检测各启动子的活性，并通过GUS定量对启动子活性进一步验证。结果表明:-1315-1区域包含HMW-GS Bx7OE启动子的全部活性，-1315-1区域与act1构建的人工启动子比克隆的Bx7OE启动子（未改造）构建载体的GUS活性高3.3倍，比Ubiquitin构建载体的GUS活性高5.6倍。
　　 在启动子改造的基础上，选取HMW-GS Bx7OE的-1315-1的区域与actin基因的第一个内含子构建人工启动子，与本实验室具有自主知识产权的高赖氨酸蛋白基因Cflr（GenBank: EU367999）连接，以单子叶植物表达载体pAHC25为基础，构建pAHC25-Bx7OEp-act1-Cflr表达载体，通过基因枪法转入小麦受体材料宁麦13、扬麦16。利用嵌套引物对再生植株进行PCR检测，共得到了9株转基因小麦。通过回收扩增条带，构建测序载体，测序结果是扩增条带与Cflr序列一致，证实已经获得转基因小麦，下一步对T0代转基因种子中赖氨酸含量进行检测，旨在获得高赖氨酸的转基因小麦新种质。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 文献综述

1 小麦的遗传转化

1．1 小麦遗传转化主要方法

1．2 外源基因在转基因小麦中的整合和表达

1．3 小麦转基因存在的问题

2 顺式作用元件-启动子

2．1 启动子基本情况概述

2．2 胚乳组织特异性启动子

3 小麦赖氨酸品质的研究

3．1 小麦的品质

3．2 辣椒高赖氨酸蛋白基因(CFLR)导入小麦的研究

4 本研究的立题依据和技术路线

4．1 立题依据

4．2 技术路线

第二章 胚乳特异表达基因HMW-GS Bx7OE启动子的选择与克隆

1 材料与方法

1．1 实验材料及试剂

1．2 实验方法

2 结果

2．1 总RNA提取

2．2 实时荧光定量PCR

2．3 HMW-GS Bx7OE启动子的克隆

2．4 启动子功能区域分析

3 讨论

3．1 HMW-GS Bx7基因在不同品种及不同器官中的表达差异

3．2 HMW-GS Bx7OE启动子的功能区域分析

第三章 人工启动子Bx7OEp-act1的构建及活性研究

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 所需片段的PCR扩增

2．2 各载体的酶切验证

2．3 GUS瞬时表达的定性分析

2．4 GUS瞬时表达的定量分析

3 讨论

第四章 人工启动子与C?lr基因构建表达载体及基因枪法进行遗传转化

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 PCR扩增载体构建所需片段

2．2 表达载体的酶切验证

2．3 小麦的遗传转化

2．4 T0代的PCR检测

3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢