菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白及其制备和应用

摘要

本发明涉及基因工程，具体的说是一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白及其制备和应用。RpTNF基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。采用通过PCR技术扩增菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF基因cDNA全长，并对其TNF结构域进行了原核重组表达。本发明操作简单，只需常规的连接、转化以及测序筛选就可完成载体构建的过程；且获得的重组蛋白活性特征明显，如本发明中的RpTNF蛋白就是第一个有生物学活性的海洋无脊椎动物细胞因子。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程，具体的说是一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋 白及其制备和应用。

背景技术

细胞因子(cytokine)由免疫活性细胞和其它细胞分泌的具有生物活性 的小分子蛋白质的统称，是参与固有免疫应答功能最多样且最重要的一类 免疫效应分子。目前已发现上百种细胞因子，并对其来源、分子结构、相 应的受体、信号转导、生物学功能以及与临床关系进行了大量研究，特别 是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已成功应用于肿瘤、炎症、造血 功能障碍等疾病治疗，具有非常广阔的应用前景。

鉴于细胞因子广泛的免疫调节作用、在病害防治方面潜在的巨大应用 价值及其在揭示免疫系统演化等方面的重要意义，在更低等的生物中寻找 细胞因子，一直是免疫学的热点问题。近年来，通过基因组学的研究，陆 续发现果蝇、海胆、海鞘中存在一种重要细胞因子类型--肿瘤坏死因子 (TNF)。TNF是机体免疫调控的关键组分，其功能活性包括诱发细胞凋亡、 介导细胞毒反应、提高吞噬细胞吞噬活性、诱导相关细胞因子和免疫效应 物质的表达等多种功能，在机体的正常或病理条件下均发挥着重要的调控 作用。然而，与高等动物广泛深入的研究状态相比，无脊椎动物TNF的研 究刚刚起步，目前除了个别物种中的基因序列，TNF其他信息严重匮乏，尤 其缺乏对其功能的明确认识。

贝类是我国优势海水养殖对象，2007年的产量达1067万吨，占全国 海水养殖总产量的77％，其中双壳贝类产量占海水贝类养殖产量的95％以 上。贝类养殖在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，并具有巨 大的发展潜力，但良种缺乏和病害问题的困扰一直是产业进一步发展的主 要制约因素。从贝类自身的免疫防御系统入手，阐明重要效应分子TNF的 基因结构和功能，将有助于深入探讨贝类免疫防御机制，为病害防治和良 种选育提供新思路。

发明内容

本发明目的在于提供一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白及其制备和 应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白：RpTNF基因重组蛋白为序列表 SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。

菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白的制备：

1)以菲律宾蛤仔RpTNF编码区为模板，采用P1和P2为引物进行PCR 扩增，待用；

2)PCR扩增产物与pMD18-T载体通过T4连接酶连接，而后将连接产物 与pET21a载体经Nde，XhoI双酶切后连接；

3)将上述构建载体转入BL21(DE3)plysS菌株中进行诱导培养，而 后纯化、复性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白 RpTNF；

所述因为P1和P2分别为P1：5’-CATATGAAACCAGCTGCAAAACT-3’；P2： 5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTATCAGATTTACTCC-3’。

所述步骤3)经诱导培养后采用镍柱纯化获得变性重组蛋白，而后透析 复性。所述序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF具有杀伤 肿瘤细胞的作用。

本发明所具有的优点：

1.适用范围广。本发明可用于多种具有潜在活性蛋白的重组表达。

2.过程简单高效。本发明操作简单，只需常规的连接、转化以及测序 筛选就可完成载体构建的过程；且获得的重组蛋白活性特征明显，如本发 明中的RpTNF蛋白就是第一个有生物学活性的海洋无脊椎动物细胞因子。

3.构建的载体对表达蛋白干扰小。利用本发明获得的重组蛋白没有表 达载体上多余肽段或氨基酸残基，不影响其活性，且不需要酶切就可以直 接进入下一步实验，如抗体制备，晶体结构分析等。

附图说明

图1为本发明实施例采用MTT法检测不同浓度RpTNF重组蛋白对肿瘤 细胞生长的抑制率。

具体实施方式

实验例1

菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白，序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列 所示。

SEQ ID NO.1

MDKKLKNISMFVLLLVVVCLMAVLALVWSMPDIPKTVKTSELCLPSEIGLLKCGSTVDLLHDYL

EREIATKYDEVKRQNQKKQENHLKEVSARLMNIYDKSFWEMKPAAKLTGKEQPDLRKTDSNADM

VPIREWRNGRELYDTKGFIRYGIRYRNGRLVVPVDGTYFIYSNIDFFESCNPSSGLPDIKDINK

PIKHGIFKFNILEGEENELVSNVQPHTISTNRYYNSYSSYVSSLAELKAGDELSVKVSNITYIR

YTRDNYFGVNLI

(a)序列特征：

●长度：268个氨基酸

●类型：蛋白

●链型：双链

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：菲律宾蛤仔

(f)特异性名称：PRT

菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白的构建：

1.重组载体的构建：本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pET 21a(+)原核表达载体。通过PCR技术，使用末端分别添加了Nde，XhoI 特定酶切位点的基因特异性引物P1(5’-CATATGAAACCAGCTGCAAAACT-3’) 和P2(5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTATCAGATTTACTCC-3’)扩增 菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF基因含TNF结构域的编码区片段。反应条 件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60 ℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟。 将PCR产物纯化回收，与pMD18-T载体连接。转化后，挑取单克隆利用上 述载体引物M13-47 5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′和RV-M 5′ GAGCGGATAACAATTTCACACAGG进行菌落PCR筛选并测序，验证测序正确后用 质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒(大连宝生物工程有限公司)，待用；使 用Nde，XhoI双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程 有限公司)对酶切产物纯化回收；纯化片段与经Nde，XhoI双酶切的表达 载体pET-21a连接，完成载体的构建。

2.重组蛋白的表达：以BL21(DE3)-plysS为重组表达菌株，将上述构 建的重组载体和空载体转化到表达宿主菌，挑取单克隆，提取质粒，测序 验证读码框正确。挑取单克隆，接种于50mL LB液体培养基中，37℃震荡 摇床中培养12-16小时，然后以1∶100的比例接种于200mL LB液体培养 基中，37℃培养至OD600＝0.5-0.7。加入IPTG，使终浓度达到1mmol/mL， 继续培养4h。4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，于-20℃冻存备 用。取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μL水和20μL 5X蛋白上 样缓冲液(购自碧云天生物公司)，100℃沸水煮沸10分钟，离心，SDS-PAGE 检测表达产物。

3.重组蛋白的纯化与复性：将上述所得蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF纯化 获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。

用具体操作步骤如下：

镍琼脂糖凝胶FF色谱分离带His标签的重组蛋白：

(1)镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；

(2)用缓冲液1(1.14g L-1NaH₂PO4，14.5g L^-1 Na₂HPO4，29.3g L^-1NaCL， 480g L^-1尿素；

.平衡2-5个床体积，流速为2mL min^-1；

(3)将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜 过滤，上样，流速为1mL min^-1；

(4)用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为mL min^-1；

(5)用分别含10、20、50、100、200、300、400mM的咪唑的缓冲液3进 行阶段洗脱，流速为2mL min^-1，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融 合蛋白的表达；

(6)用纯水流洗5个柱床体积，再用20％的乙醇流洗3个柱床体积，流速 为2mL min^-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在 适当的复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠。变性纯化 产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、1mM EDTA、50mM Tris-HCl、 100mM NaCl、10％甘油、1％甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从 起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、0M，最后一次透析至无尿素的透析液时 不加甘油。每次在4℃透析12h，即得到菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白。

实例2

重组蛋白的抗肿瘤生长活性分析

以肿瘤细胞7402为靶细胞，检测实施例1所得RpTNF蛋白对肿瘤细胞的杀 伤作用。调整肿瘤细胞浓度为1-5×10⁵/ml，取96孔板每孔加入100ul细 胞悬液，置37℃，5％CO₂及饱和湿度条件的培养箱孵育过夜；第2天预先 将不同浓度的重组蛋白为加入细胞培养液，每组设6个复孔，并设细胞对照 组(无任何添加)和空白孔(只加培养基)；将培养板放入CO2培养箱，在37 ℃，5％CO2及饱和湿度条件下，培养72h；每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10 ul，37℃继续培养4h，避光；终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每 孔加入150ul DMSO，轻微振荡10min；在酶标仪上选择490nm波长，以空 白孔调零，测定各孔吸光值(A值)。结果如图1。

本发明序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF可作为饲 料添加剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上 述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改 变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明 的保护范围之内。

序列表