一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法

摘要

本发明提供了一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法，其步骤包括通过马铃薯Y病毒烟草分离物特异性抗体诱捕病株样品中的马铃薯Y病毒、高温变性获得病毒RNA作为模板、利用马铃薯Y病毒外壳蛋白基因3′末端引物及四条特异反应引物进行一步法反转录环介导等温扩增(Reverse-transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification，RT-LAMP)法扩增，肉眼观察或浊度仪在400nm波长下检测沉淀浊度或电泳条带观察，判断样品中是否带有病毒。该方法将快速、特异和高灵敏度的病毒免疫捕捉与快捷的RT-LAMP法结合，从而快速、简便的检测烟草样品中的马铃薯Y病毒。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒学技术领域，尤其是一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的 方法。

背景技术

马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是马铃薯病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒 属(Potyvirus)的典型成员。在东亚地区、中南美洲、加拿大、墨西哥、哥斯达黎加及美 国均有发生，我国各主要烟区亦普遍发生，该病毒还可侵染茄科、苋科、藜科、菊科和豆 科的120余种植物。

其病毒粒子呈弯曲线状，无包膜，长约700nm，直径11～13nm，螺旋对称结构，可 在感病寄主体内形成风轮状内含体。标准沉降常数S20w＝154S，氯化铯中的浮力密度为 1.33g/cm³。烟叶粗汁液的钝化温度为55℃，10min，稀释限点(DEP)为1×10^-4，体外存 活期(LIV)5～10天。

病毒核酸为单分子线形正义ssRNA，长9496nt，基因组结构具有典型马铃薯Y病毒 属病毒结构特征，核酸约占病毒粒子重量的5％。病毒外壳蛋白由一种多肽组成，分子质 量约30～47kDa。

PVY基因组RNA具有典型的马铃薯Y病毒属病毒基因组结构特征，其5′端为VPg 结构，3′端为Poly(A)尾。基因组编码一个多聚蛋白，切割产生10个蛋白，分别为： P1蛋白(功能未知)、HC-Pro蛋白(与蚜虫传播相关)、P3蛋白(功能未知)、6K1蛋白 (功能未知)、CI蛋白(柱状内含体蛋白)、6K2蛋白(功能未知)、NIa-VPg蛋白(即 VPg蛋白)、NIa-Pro蛋白(核内含体蛋白酶)、NIa蛋白(核内含体复制酶)和外壳蛋白。

基于病毒外壳蛋白抗原抗体反应的免疫吸附法和基于病毒核酸的LAMP检测是目前 应用广泛的检测病毒的方法。但现有方法在检测时间、不灵敏和稳定性等方面存在不足， 且检测特异性不强。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法，即结合了上述 两种方法的免疫捕获RT-LAMP，免疫捕获RT-LAMP(IC-RT-LAMP)主要由三个部分组 成，第一部分的免疫反应类似于普通的免疫吸附试验的测定过程，第二部分为第一链 cDNA的合成，第三部分即通常的LAMP扩增，为快速、灵敏的检测大量样品，使用了 一步法反转录环介导等温扩增，即将后两步合并为一步。

整个技术省略了繁琐的RNA提取、第一链cDNA的合成以及LAMP扩增等三个步骤， 利用马铃薯Y病毒烟草分离物抗体的高效价和特异性以及简便、灵敏的LAMP法扩增， 特异、快速的检测样品中的病毒病原，通过肉眼或浊度仪判定病样中是否含有马铃薯Y 病毒，为快速检测病毒提供了一种快速、特异和灵敏的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物 的方法，其步骤包括通过马铃薯Y病毒烟草分离物特异性抗体诱捕病株样品中的马铃薯 Y病毒、高温变性获得病毒RNA作为模板、利用马铃薯Y病毒外壳蛋白基因3′末端引物 及四条特异反应引物进行一步法反转录环介导等温扩增(Reverse-transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification，RT-LAMP)法扩增，肉眼观察或浊度仪在400nm 波长下检测沉淀浊度或电泳条带观察，判断样品中是否带有病毒。

1.引物设计：

用于反转录反应的3′端引物：5′-CCA AGC TTC ATG TTC TTS ACT CCA AGT ARA-3′

用于LAMP反应的四条引物：

PVY-FIP：：5′-CGT CCT TCT CCT TTT CTT TGT TGA ATT TTG AAG GAT GCA AAA CAA GAG C-3′，

PVY-BIP：：5′-ATC TGG AAC TCA TAC TGT GCC ACT TTT TCA GTA CAG TTG CAC CCT-3′，

PVY-F3：5′-AAT CGA TGC AGG AGG AAG-3′，

PVY-B3：5′-AGC ATA CTC GAG TAA ATG TTC T-3′。

2.病毒粒子的免疫捕获

在PCR管中加入稀释为1∶1000的PVY兔多抗血清，4℃下包被过夜，PBST洗涤3 次。烟草病样用PBST研磨，1000g离心1min，取100μl上清加入PCR管中，温育3h； PBST洗涤3次，H₂O洗涤1次，短暂离心，吸去残液。

3.高温变性

加25μl DEPC处理的超纯水，97℃变性5min，即刻插入冰内×预冷3-5min。

4.一步法RT-LAMP

在上述PCR管内进行RT-LAMP，反应体系30μL：

RT-LAMP反应条件：50℃温育30min；60℃温育40min，降至常温。

5.肉眼观察或浊度仪检测

肉眼观察反应液是否变浑浊，与阴性样品比较有明显浑浊的反应液即为阳性样品，反 之则为阴性；浊度仪在400nm波长下检测沉淀浊度，浊度升高的为阳性，浊度与阴性对 照没有明显变化的为阴性样品.

6.电泳检测

RT-LAMP反应结束后取5μL反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TBE缓冲液中， 80V稳压电泳1.5h，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，有明显条带状电泳痕迹的即 为阳性样品，反之则为阴性。

序列表

<110>云南省烟草公司昭通市公司，云南省农业科学院生物技术与种质资源 研究所，云南省烟草农业科学研究院

<120>一种快速马铃薯Y病毒烟草分离物的检测方法

<160>5

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1)..(30)

<400>1

ccaagcttca tgttcttsac tccaagtara

<210>2

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1)..(49)

<400>2

cgtccttctc cttttctttg ttgaattttg aaggatgcaa aacaagagc

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1)..(45)

<400>3

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<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1)..(18)

<400>4

aatcgatgca ggaggaag

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1)..(22)

<400>5

agcatactcg agtaaatgtt ct

序列表

<110>云南省烟草公司昭通市公司，云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省烟草农业科学研究院

<120>一种快速马铃薯Y病毒烟草分离物的检测方法

<160>5

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<222>（1）．．（30）

<400>1

ccaagcttca tgttcttsac tccaagtara

 

<210>2

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<222>（1）．．（49）

<400>2

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<210>3

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<211>18

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<222>（1）．．（18）

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