一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒和引物

摘要

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒和引物和该引物的应用。一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒，该试剂盒至少包括两个寡聚核苷酸引物，所述的两个寡聚核苷酸引物的核苷酸序列分别如下所述：5’-gcttagctgctgtggcaatg-3’和5’-cccactttgggtctgtgtca-3’。本发明的试剂盒通过检测肿瘤组织中FGFR1的扩增情况，可以确定癌症的病变因素和制定有效治疗方案。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒和引物和该引物的应用。

背景技术  

成纤维生长因子受体1(FGFR1)分子靶点是一种新型有效蛋白靶点，近些年发现在部分乳腺癌、恶性神经胶质瘤、脑膜瘤等肿瘤组织中FGFR1基因高度扩增，同时伴有FGFR1蛋白过度表达，其肿瘤发生机理是成纤维生长因子(FGF)与FGFR1结合，从而激发受体的酪氨酸激酶活性，使结合于激酶区的底物（信号分子）发生磷酸化，引发细胞内的一系列信号传导途径，刺激细胞繁殖、肿瘤生长，FGFR1可以与多种FGF结合。含有FGFR1基因高度扩增的肿瘤细胞对FGFR1信号传导有着依赖性，因此可以应用FGFR1抑制剂来抑制这些肿瘤细胞生长、导致肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗癌症的效果。事实上，国际上有十多家公司（包括Boehringer Ingelheim, 诺华，施贵宝等等）已经开发了十多种不同的能够抑制FGFR1的药物。

一直以来，针对这些FGFR抑制剂的开发大都是在乳腺癌病人中开展的。但是2010年12月，德国马克斯-普朗克研究所（Max-Planck Institute）的研究人员在美国《科学-转化医学》（Science Translational Medicine）杂志上发表了一篇轰动性的报道：发现在常见于吸烟人群的鳞状细胞肺癌（Squamous Cell Lung Cancer）中FGFR1基因扩增非常常见(高于20%)，并且临床上正在开发的抗癌药物FGFR抑制剂特异性地抑制含有FGFR1基因扩增的鳞状细胞肺癌细胞，而对没有FGFR1基因扩增的鳞状细胞肺癌细胞则没有抑制作用。

非小细胞肺癌中主要有腺癌和鳞癌（鳞状细胞肺癌）两大类，在非吸烟患者的肺癌中大多是腺癌，而在吸烟人群肺癌中大多是鳞癌。目前已知的有效肺癌靶向药物如特罗凯、易瑞沙主要是针对腺癌的，而在马克斯-普朗克研究所的有关FGFR1扩增的发现之前，医学界还没有掌握针对吸烟人群中肺鳞癌的有效药物靶点。因此，马克斯-普朗克研究所的这一发现，被认为是找到了第一个针对吸烟人群中鳞状细胞肺癌的药物靶点，从而第一次为肺鳞癌的个性化地靶向治疗提供了依据。

利用FGFR抑制剂对肺鳞癌病人进行个性化的靶向治疗，首先需要筛选出那些在癌细胞中有FGFR1基因扩增的病人。因此需要开发一种基因诊断试剂盒，通过检测肿瘤组织中FGFR1的扩增情况，确定癌症的病变因素和制定有效治疗方案。如果存在FGFR1高度扩增情况，可以推荐患者接受FGFR抑制剂药物治疗，使适宜FGFR靶向治疗的患者获益，尤其是让吸烟人群中的肺鳞癌患者受益于FGFR抑制剂；如果不存在FGFR1高度扩增，应及时考虑其它治疗药物，避免使患者蒙受药物的潜在毒性作用及不必要的经济负担，并错过最佳治疗时机。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒。本发明的第二个目的是提供上述的引物和该引物的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒，该试剂盒至少包括两个寡聚核苷酸引物，所述的两个寡聚核苷酸引物的核苷酸序列分别如下所述：5’-gcttagctgctgtggcaatg-3’ 和5’-cccactttgggtctgtgtca-3’。

本试剂盒还可以包含用于PCR扩增的聚合酶、脱氧核糖核酸（dNTP）等等。其中可以包含，也可以不包含，一个荧光标记探针，例如TaqMan探针。TaqMan探针的核苷酸顺序可以是5’-FAM-agaataacaaaatggaactccgccccc-TAMRA-3’。

本试剂盒还可以（但不是必须）包括另一对PCR引物，用于PCR扩增一个单拷贝持家基因（housekeeping gene），例如人白蛋白（albumin）基因、β-actin基因、等等。在一个具体实施方案中，此对引物是5’- gcgcactaaggaaagtgcaa -3’和5’- caacagcacaggttttgtggtt -3’。

另外本试剂盒还可以（但不是必须）包含能够和一个持家基因（housekeeping gene），例如人白蛋白（albumin）基因或β-actin基因杂交的荧光标记探针，例如TaqMan探针。在一个具体实施方案中，TaqMan探针的核苷酸顺序可以是5’-VIC-actatcccaaagacctatccattgcac t-TAMRA-3’。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的引物，其特征在于该引物的核苷酸序列分别如下所述：5’-gcttagctgctgtggcaatg-3’ 和5’-cccactttgggtctgtgtca-3’。

上述的两个寡聚核苷酸引物：5’-gcttagctgctgtggcaatg-3’ 和5’-cccactttgggtctgtgtca-3’用于制备在肿瘤细胞或组织中检测FGFR1基因的试剂盒的用途。所述肿瘤细胞或组织可以是任何人肿瘤细胞和组织，如乳腺癌、非细胞肺癌、膀胱癌、口腔鳞癌、食道鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、等等。在一个具体实施方案中，所述肿瘤细胞或组织为乳腺癌或肺鳞癌细胞或组织。

本发明的试剂盒通过检测肿瘤组织中FGFR1的扩增情况，确定癌症的病变因素和制定有效治疗方案。如果存在FGFR1高度扩增情况，可以推荐患者接受FGFR抑制剂药物治疗，使适宜FGFR靶向治疗的患者获益，尤其是让吸烟人群中的肺鳞癌患者受益于FGFR抑制剂；如果不存在FGFR1高度扩增，应及时考虑其它治疗药物，避免使患者蒙受药物的潜在毒性作用及不必要的经济负担，并错过最佳治疗时机。FGFR1基因扩增检测试剂盒的开发将第一次使肺鳞癌能够得益于靶向药物。因此本发明试剂盒的问世也将带来极大的社会效益。

附图说明

图1～图6为以SW620、DLD1、COLO320、HCT116、L1和HT29细胞系和正常人血淋巴细胞的DNA为模板，SYBRGreen染料法的检测两种引物的扩增情况图。

具体实施方式

本发明的试剂盒可以用来检测肿瘤细胞或组织中FGFR1基因是否有扩增。具体地说，可以从人肿瘤细胞或组织中提取基因组DNA作为PCR模板，然后利用上述FGFR1引物进行荧光定量PCR，同时利用上述人白蛋白ALB引物进行荧光定量PCR，然后将FGFR1基因扩增的Ct值与ALB基因扩增Ct值比较，通过计算△Ct=Ct_FGFR1-Ct_ALB，以人基因组中单拷贝白蛋白(ALB)基因为内参基因，从而相对定量地确定FGFR1基因的扩增情况。此处荧光定量PCR可以是任何形式的荧光定量PCR，如利用双链DNA结合染料例如SYBRGreen染料标记PCR产物，也可以是利用一个或多个荧光标记探针如TaqMan探针或molecular beacon法。

表1 FGFR1及ALB引物及探针信息

名称FGFR1基因(F8)ALB基因(A1)FP5’-gcttagctgctgtggcaatg-3’5’- gcgcactaaggaaagtgcaa -3’ RP5’-cccactttgggtctgtgtca-3’5’- caacagcacaggttttgtggtt -3’ Probe5’-FAM-agaataacaaaatggaactccgccccc-TAMRA-3’5’-VIC-actatcccaaagacctatccattgcac t-TAMRA-3’

A1及F8扩增效率：为了检测A1及F8的扩增效率，以各种肠癌细胞系和正常人血淋巴细胞的DNA为模板，SYBRGreen染料法的检测两种引物的扩增情况，结果表明两种引物的扩增效率基本相等，结果如图1～图6所示。

序列表

<110>湖州数问生物技术有限公司

<120>一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒和引物

<160>6

 

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gcttagctgc tgtggcaatg 20

 

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cccactttgg gtctgtgtca 20

 

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agaataacaa aatggaactc cgccccc 27

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcgcactaag gaaagtgcaa 20

 

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

caacagcaca ggttttgtgg tt 22

 

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

actatcccaa agacctatcc attgcac 27