包含益生菌与益生元组分以及矿物盐和乳铁蛋白的组合物

摘要

本发明涉及包含益生菌和益生元组分、矿物盐、乳铁蛋白以及可能的酵母的组合物，所述组合物对所施用的益生菌组分进行正确有效的定殖，其中肠道影响包括维持和/或恢复肠健康以及预防由压力、不合宜的饮食习惯和抗生素治疗引起的常见的消化道生态失调问题。所述组合物还具有伴随的抗炎和免疫调节作用。

说明书

技术领域

本发明涉及包含益生菌(probiotic)(更具体而言长双歧杆菌)和载体物质的组合物，所述载体物质包含益生元(prebiotic)物质、矿物盐和乳铁蛋白，所述组合物不仅具有改善和/或增强的益生菌物种的存活率，而且对所施用的益生菌组分进行有效的定殖(colonization)，其肠道影响为由压力、不合宜的饮食习惯、抗生素治疗、疾病等引起的常见的消化道生态失调。所述组合物还具有伴随的抗炎和免疫调节作用。另外，本发明涉及用本文所述的组合物增强和/或改善益生菌生物的存活率(survival)和生存力(viability)的方法。

本发明的组合物可用于制备营养补充产品和药物级产品。

背景技术

消费者日益意识到以下情况，即维持他们的环境、健康和营养可能是必要的。相应地，科学研究已集中于饮食、压力和现代医学实践(例如，抗生素和放射治疗)在威胁人类健康方面可能起到的作用。具体而言，走向老龄社会的人口动态变化正在提高可能因微生物群落不足或缺乏免疫力而引起的疾病的发病率，所述疾病诸如胃肠道(GIT)感染、便秘、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)-克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、食物过敏、抗生素诱发的腹泻、心血管病和某些癌症(例如结肠直肠癌)。

近年来，功能性食物(以定向方式影响身体机能以便对生理学和营养产生积极影响的食物)、特别是含益生菌食物的商业制造和销售已经从已有的日本的小市场空间扩展到全球市场。尽管现在正在对许多人类来源的益生菌进行商业开发，但是不仅关于此类产品的潜在应用而且在如何改进功效方面的科学依然是新兴的。

益生菌被定义为活的微生物食品补充剂，其通过改善肠道微生物平衡或者更广泛地说作为活的微生物来有益地影响宿主，其在以一定数目摄取后所发挥的健康影响超出内在的基本营养。各种微生物特别是乳酸杆菌和双歧杆菌属的混合物在传统上用于发酵乳制品中以促进健康。然而，为达到效果，所述益生菌不仅必须在制造加工、包装和贮存条件中存活，而且必须在通过胃肠道时也能存活，由此使益生菌保持存活以具有积极的健康影响。

人类的进化史受细菌的影响，不仅仅在流行病方面。较不明显且更隐藏的影响是共生菌丛的影响，特别是居住在人肠道中的菌丛，其执行主要的“保护”和“教育”作用(第一项作用是在整个身体上执行，而第二项作用是在其免疫系统上执行)并且要持续地保护个体免于疾病。正如事实上众所周知的，在正常条件下，皮肤和身体的很多粘膜被不同的微生物菌丛占据，这些微生物通常是组织特异性的。例如，肠特别是大肠中主要的微生物(迄今为止已经鉴定出不少于500个菌株)是拟杆菌属(Bacteroides spp.)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp)、克雷白杆菌属(Klebsiella spp.)、葡萄球菌(Staphylococci)、酵母(yeasts)和大肠杆菌(Escherichia coli)。这种共生菌丛可以分成两类：“常居”菌丛，其几乎总是存在，而且如果改变的话，能够迅速恢复；和“暂时性”菌丛，由于暂时性菌丛缺乏与常居微生物或宿主的防御机制竞争的能力，其可短期定殖在宿主中。暂时性菌丛有时也包括潜在的致病微生物。菌丛的准确组成受微生物起源因素以及宿主特定的因素的影响。然而，因为后面的这些因素(年龄、营养水平、激素和疾病)难于改变，所以分析将集中在前者。

影响共生菌丛组成的重要的微生物因素是细菌附着于上皮细胞的能力。一些细菌对特定的上皮细胞呈现显著的趋向性(亲和性)。然后，正常菌丛能够通过与潜在的致病微生物竞争细胞表面上的受体而对其进行干扰。通过产生杆菌素(其是抑制其它细菌(通常属于同一属)生长的物质)，或者通过产生短链脂肪酸来提供酸性环境，或者通过竞争相同的营养素，共生菌丛也能够干扰致病微生物。其它有用的机制是产生具有交叉反应性的天然抗体的刺激，或者刺激清除机制。然而，后者的重要性更低。

由于这些机制，正常菌丛形成抵抗宿主表面被致病微生物定殖的有效屏障。这被称为“抗定殖性(colonisation resistance)”。

因此可以容易地推断，任何降低这些微生物因素对胃肠生态系统影响的现象可导致严重的个体健康问题。例如，用广谱抗生素治疗消除了对所用的抗微生物剂敏感的胃肠菌丛的所有共生细菌。在这种情况下，抗定殖性被降低，并且潜在致命的微生物可自由地定殖于粘膜。当治疗中断时，常居菌丛能够随时间明显恢复。然而，遗憾的是，需氧革兰氏阴性菌比厌氧革兰氏阴性菌生长更快而且更快定殖于粘膜，厌氧革兰氏阴性菌增殖更缓慢，尽管其构成共生菌丛的99％。在免疫防御即使仅仅部分受损的患者中，这种失调可引发革兰氏阴性菌血症(bacteraemia)。

与正常菌丛被广谱抗生素抑制相关的其它可能结果包括具有真菌病外观的酵母过度生长，或者厌氧革兰氏阴性细菌艰难梭菌(Clostridium difficile)过度生长，不幸的是其是相对耐受抗生素的。其存在可导致一系列非常普通的疾病，范围从腹泻到结肠炎。

免疫系统及其功能是数千年发展的结果，通过与微生物界不断的相互作用日复一日地决定，特别是在胃肠水平。

已得到科学证实的是，就个体健康而言，特别是考虑到现代生活的优良条件(与近代相比)，借助过度卫生保健或过度使用抗生素所达到的无菌状态并非代表成功的策略。即使部分无菌状态能够引起的损害是熟知的，即，食物耐受不良、过敏和自体免疫性疾病。这些问题是由于缺乏共生菌丛与免疫系统之间的接触而引起的。通过这种每天的接触，共生菌丛教导免疫系统如何区分“自身”与“非自身”。大量流行病学证据(以及例如利用无菌动物进行的试验)证实了这种理论。

自从五六十年代以来，在经济发达国家已经观察到食物耐受不良率和过敏率(达40％)以及自体免疫性疾病(如多发性硬化症、红斑狼疮和类风湿性关节炎)比率(达30％)的显著增加，其与源自传染病的死亡率降低并行(由于越来越多的抗生素可用)。这些增加是由于不正确使用抗生素以及压力渐增的生活方式还有在婴儿情况下母乳喂养减少而引起的胃肠共生菌丛的质量和数量的重大改变的结果。事实上，经常报道母乳喂养儿童与接受所谓“人造”奶的儿童相比患有更少的食物耐受不良和过敏。甚至在最近，针对多发性硬化症(一种自体免疫性疾病)也报道了相同的关联。相反地，对居住在部落环境(在部分非洲、印度和澳大利亚内陆)(在这些地方生活方式是原始的)的个体的发病率的分析显示几乎全部不存在像过敏和自体免疫这样的疾病(尽管存在明显高的传染病比率)。

改变胃肠共生菌丛的质量和数量的抗生素治疗、压力和缺乏母乳喂养会降低共生菌丛与免疫系统接触的机会。由于这种接触，免疫系统的细胞，特别是1型和2型T-辅助淋巴细胞，被“指挥”耐受(即，不应答)食物抗原和无害非食物抗原(诸如花粉)或者它们所属的躯体蛋白质(从而预防自体免疫性疾病)。

因此，共生菌丛对每个个体的当前及未来健康的特殊重要性是明显的。然而，人类并非生来就具有共生菌丛。相反，在出生时，胃肠道是无菌的。在阴道分娩的情况下，通过分娩时母亲的阴道和肛门菌丛来引发其定殖，或者在剖宫产分娩的情况下，通过暴露于子宫外面的环境来引发其定殖，并且在两种情况下，其定殖均在随后受所提供的乳品类型以及母体/环境因素影响。新生儿期之后，健康个体的胃肠共生菌丛由至少1018个细菌组成，其中的99％属于大约30～40个种属。

这种菌丛因此由厌氧微生物(双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、类菌体、真细菌和革兰氏阳性球菌)和需氧微生物(乳酸杆菌、链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌)组成。然而，这些量并非沿胃肠轴平均分布：胃中的细菌含量相对低(低于1百万/克)，但是在回肠中数量显著增加(1亿)并且在结肠中剧增(1000亿)。

因此，在本领域中存在对含有益生菌物质的组合物的需要，该益生菌物质不仅在制造加工条件下存活，而且能够在胃肠道中存活，从而向需要其的宿主递送能生存的益生菌物质。

发明内容

在其最广义方面，本发明提供了一种益生菌组合物，其包含：a)一种或多种益生菌组分，所述一种或多种益生菌组分包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和至少一种选自由鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)和胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)组成的细菌组的细菌物种；以及b)载体组合物，所述载体组合物包含：1)一种或多种益生元组分，2)乳铁蛋白，3)一种或多种矿物盐，和任选地4)谷胱甘肽。

在本发明的第一方面，优选的是，所述长双歧杆菌是长双歧杆菌R175(″Rosell 175″)，所述瑞士乳酸杆菌是瑞士乳酸杆菌R52(″Rosell52″)；所述鼠李糖乳酸杆菌是鼠李糖乳酸杆菌R11(″Rosell 11″)，所述胚芽乳酸杆菌是胚芽乳酸杆菌R1012(″Rosell 1012″)。瑞士乳酸杆菌Rosell 52在行业内也称为嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)属，因此如本文所用，瑞士乳酸杆菌R52也可以称为嗜酸乳酸杆菌R52。

在优选的实施方式中，所述一种或多种益生元组分为菊粉和果糖。在另一优选实施方式中，所述一种或多种矿物盐选自锌、镁、钾和铜。在最优选的实施方式中，所述矿物盐包括葡糖酸锌、葡糖酸镁和柠檬酸钾。

本发明的一方面提供了一种益生菌组合物，其包含：a)益生菌组分混合物，所述益生菌组分混合物包含长双歧杆菌500亿CFU/g、瑞士乳酸杆菌1500亿CFU/g和胚芽乳酸杆菌1500亿CFU/g；以及b)载体，所述载体包含1)益生元混合物，其占总载体组合物的约80％；2)乳铁蛋白，其量为总载体组合物的约0至约10％；3)矿物盐，选自镁盐、钾盐和锌盐，其中镁以约0至约100％的量存在于总载体组合物中；其中钾以载体组合物的约0至约100％的量存在；且其中锌以载体组合物的约0至约100％的量存在；和4)谷胱甘肽，其中谷胱甘肽的量为载体组合物的约0至约20％。

在本发明的又一方面，提供了了一种益生菌组合物：a)由长双歧杆菌R175和鼠李糖乳酸杆菌R11组成的益生菌混合物；b)包含菊粉和果糖的益生元组分；c)乳铁蛋白；d)由镁盐和锌盐组成的矿物盐的混合物；和e)布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)。

在本发明又进一步的方面，提供了利用含益生菌的组合物制备用于口服施用以维持和/或恢复哺乳动物的肠健康以及预防任意病原学生态失调的制剂的方法。

在本发明又进一步的方面，提供了一种改进长双歧杆菌存活性的方法，包括：将长双歧杆菌与瑞士乳酸杆菌R52和胚芽乳酸杆菌R1012项混合，其中双歧杆菌属的存活得到改善。

具体实施方式

在成人中，抗生素治疗、压力、饮食失调和疾病(特别是胃肠病)改变有益共生菌丛的质量和数量。实现快速有效的再定殖过程的问题因此出现。益生菌显著促进该过程。

现在已经发现，益生菌组分、更具体而言长双歧杆菌的特定混合物当在载体中混合时的组合物改善长双歧杆菌属的存活，以及执行重要的健康改善作用，维持和/或恢复肠健康，控制压力的影响，以及执行抗炎和免疫调节活性，所述载体包含(A)一种或多种益生元组分、(B)乳铁蛋白和(C)一种或多种矿物盐以及任选地酵母。更具体而言，本发明的组合物在输送经过胃肠道时表现出增强的和/或改善的益生菌组分存活。

因此，根据本发明的组合物的特征在于与强抗炎和免疫调节组分的相当大的共生价值(带有支持的益生元的益生菌)，并且其还能够处理流体-盐平衡的变化。其因此显著改善/恢复肠健康，并且在预防不适、感染和一般而言所有压力(特别是身体和环境压力)的影响方面具有有利的反响。

即使已经显示，至少对于一些益生菌菌株而言，死亡益生菌可引发临床益处，但是在人类中死亡细菌的临床结果并非像存活细胞的那样有利。因此，为了生产能够引发期望的临床结果的益生菌产品，必须确保含益生菌的组合物在经过上胃肠道时具有最高的累积益生菌存活。

本发明人已发现，使单独的或与一种或多种益生菌组分诸如瑞士乳酸杆菌和/或胚芽乳酸杆菌结合的长双歧杆菌与载体相结合，所述载体包含优选菊粉、果糖和/或FOS的益生元；包含镁、锌和/或钾的矿物盐；乳铁蛋白，该长双歧杆菌经过消化道时具有增强的存活，因此，所述组合物显示出更大的功效。

益生菌传统上被定义为(优选)含有活的微生物的营养补充物，其过改进微生物平衡而有利地影响宿主的健康。益生菌生物还必须：

-是人肠内菌丛的正常组分，或者在任意情况下易于适应该生态环境；

-能够越过胃屏障，抵抗胆汁酸和胰酶的作用；

-能够特异性地附着至肠上皮；

-易于在临床实践中使用。

下述益生菌满足上述定义：

-一般而言，产乳酸细菌；

-乳酸杆菌(嗜酸、瑞士、保加利亚、胚芽、干酪、鼠李糖、乳酸和罗伊)；

-嗜热链球菌；

-屎肠球菌；

-两歧双歧杆菌和长双歧杆菌。

根据本发明的益生菌组分的混合物包含至少两种细菌，其选自由下述组成的细菌组：

-长双歧杆菌

-瑞士乳酸杆菌

-嗜酸乳酸杆菌

-鼠李糖乳酸杆菌，和

-胚芽乳酸杆菌。

在本发明优选的实施方式中，所述益生菌组合物包含长双歧杆菌。

这些活的和有生机的微生物剂能够迅速定殖，这很快导致执行其功能：

1)通过对潜在致病种群的直接拮抗作用进行保护(抑制与上皮细胞的附着；产生杆菌素；竞争营养物和底物；建立不利的pH条件和氧化还原微环境)；

2)刺激和教导免疫系统(巨噬细胞激活、增加天然杀伤细胞、增加干扰素产生以及平衡T-辅助细胞1和2种群)。

3)通过释放乳酸盐、丙酸盐和丁酸盐而酸化结肠环境。

科学团体最近将其兴趣集中在研究和表征看起来是开发共生剂(含益生菌和益生元的产品)的最佳候选物的那些菌株上，即，乳酸杆菌(嗜酸、瑞士、胚芽和鼠李糖)和双歧杆菌。这些不同的菌株展示出各种性质：能够有效越过胃和胆屏障；改进与乳糖耐受不良相关的便秘和症状；减轻腹泻(包括具有病毒病原学的类型)；产生杆菌素；能够抑制病原体诸如沙门菌、志贺杆菌、耶尔森菌、念珠菌和大肠杆菌；免疫调节和很多其它性质。

乳酸杆菌属属于乳酸细菌物种，其为原核生物。基于其鸟嘌呤和胞嘧啶含量(其为54％之下)(在双歧杆菌中，所述含量超过54％)，它们很容易从双歧杆菌中分化出来。该属包含约80个种类，它们是过氧化氢酶阴性的、不动的、无孢子的、细胞色素-氧化酶-阴性的、非明胶水解的，具有糖解和微需氧代谢。它们还具有特殊的营养需求，即，可溶性碳水化合物、游离氨基酸、胨、脂肪酸及其酯、盐、核酸和维生素。基于发酵类型它们也被分为专性同型发酵、专性异型发酵和兼性异型发酵种类。

特别地，最初鉴定出鼠李糖属的乳酸菌，并且其选自人肠起源的菌株。它们具有不同的特异性特征，它们仅与其它产乳酸细菌部分共享这些特征：

1)从免疫观点看，它们改进T和B淋巴细胞反应以及CD56+细胞的“自然杀伤”(NK)反应；

2)从临床观点看，它们的应用是与各种形式的腹泻(包括轮状病毒、旅行者腹泻、由于抗生素治疗引起的腹泻，以及由于艰难梭菌重复感染引起的再发性腹泻)斗争的有效方法；

3)它们还被报道为可减少病原体在上呼吸道的定殖。

在定殖方面，已知它们可抵抗胃液酸度、胆汁和大肠特有的高pH值，在大肠中，在定殖之后，它们通过有利影响环境条件而促进双歧杆菌的增殖。

双歧杆菌属包含28个种类，并呈现下述一般特征：革兰氏阳性的、厌氧的、不动的、无孢子的、过氧化氢酶阴性的、非尿酸的(non-acid uric)、多形的和产乙酸的(以及产乳酸盐的)。它们也使用铵盐作为氮源，并且能够合成很多维生素。最后，它们的发育受双歧生长因子(低聚糖和胨)存在的影响。

如已经陈述的，在其输送和定殖过程中，乳酸杆菌和双歧杆菌进行一系列可鉴定为生理活动的活动，诸如：减轻乳糖耐受不良；改进肠能动性；降低血清胆固醇；积聚蛋白水解酶、蛋白质和维生素；调节营养素吸收；再活化肠上皮的渗透性；和改进老年患者的状态。

它们还以“非生理”效应为特征，诸如抗腹泻效应(幼儿腹泻、旅行者腹泻以及与应用抗生素有关的腹泻)；防腐效应(由于产生杆菌素、乳酸和乙酸以及由于释放乙酰基、乙醛、过氧化氢和二氧化碳)；抗肿瘤效应(主要位于结肠和直肠内)；以及免疫调节效应(用这些菌株处理的患者具有更好的NK细胞、抗体、吞噬细胞和细胞因子反应)。

此外，由这些不同菌株进行的一系列生物活性处于讨论中，并且应当很快通过未来的研究予以证实，诸如非变应性活性(在食品领域)、抗炎活性(在肠领域中)、抗氧化剂活性(在动脉粥样硬化领域具有有利的反应)和护肝活性(特别是在与酒精消耗相关的领域)。

根据本发明的优选方面，益生菌组分的混合物包含长双歧杆菌和至少一种选自由瑞士乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌和胚芽乳酸杆菌组成的细菌的另外的种类。

在上述益生菌组分混合物中，优选的是，所述长双歧杆菌是长双歧杆菌R175(″Rosell 175″)，所述瑞士乳酸杆菌是瑞士乳酸杆菌R52(″Rosell 52″)；所述鼠李糖乳酸杆菌是鼠李糖乳酸杆菌R11(″Rosell11″)，所述胚芽乳酸杆菌是胚芽乳酸杆菌R1012(″Rosell 1012″)。瑞士乳酸杆菌Rosell 52在行业内也称为嗜酸乳酸杆菌属，因此如本文所用，瑞士乳酸杆菌R52也称为嗜酸乳酸杆菌R52。

长双歧杆菌R175以产品代码75119得自加拿大Qc蒙特利尔的Institut Rosell Inc.(Lallemand)。

长双歧杆菌R175是严格厌氧菌，由各种形状的分离的或成对的(1～1.5μm x 6μm)革兰氏阳性杆菌组成。其在选择性培养基上形成小的白色菌落。长双歧杆菌R175是异型发酵的，并且在发酵过程中产生l-乳酸和乙酸。其是过氧化氢酶阴性的。在实验室条件下，长双歧杆菌R175在37℃于厌氧条件下在商业可得的乳酸菌培养基(RCM)中生长良好。具体而言，其能够在下述糖类上生长(API 50CH结果，37℃下48小时之后)：

 对照 -  半乳糖 +  α-甲基-D-甘露糖苷 - 蜜二糖 +  D-松二糖 + 丙三醇 -  D-葡萄糖 +  α-甲基-D-葡糖苷 - 蔗糖 +  D-来苏糖 - 赤藓糖醇 -  D-果糖 +  N-乙酰葡糖胺 - 海藻糖 -  D-塔格糖 - D-阿拉伯糖 -  D-甘露糖 +  苦杏仁苷 - 菊粉 -  D-岩藻糖 - L-阿拉伯糖 +  L-己酮糖 -  熊果苷 - 松三塘 +  L-岩藻糖 - 核糖 -  鼠李糖 -  七叶苷 - D-蜜三糖 +  D-阿拉伯糖醇 - D-木糖 +  卫矛醇 -  水杨苷 - 淀粉 -  L-阿拉伯糖醇 - L-木糖 -  肌醇 -  纤维二糖 - 糖原 -  葡糖酸锑钠 - 核糖醇 -  甘露醇 -  麦芽糖 + 木糖醇 -  2-酮葡糖酸 - β-甲基木糖苷 -  山梨糖醇 -  乳糖 + β-龙胆二糖 -  5-酮葡糖酸 -

此外，长双歧杆菌R175显示下述抗生素抗性情况：

  抗微生物剂  剂量  结果  抗微生物剂  剂量  结果  氨苄西林  10mcg  易感的  呋喃妥因  300mcg  易感的  杆菌肽  10units  易感的  新生霉素  30mcg  易感的  头孢菌素  30mcg  易感的  新生霉素G  10units  易感的  氯霉素  30mcg  易感的  多粘霉素B  300units  抗性的  乙琥红霉素  15mcg  易感的  利福平  5mcg  易感的  庆大霉素  10mcg  抗性的  链霉素  10mcg  抗性的  卡那霉素  30mcg  抗性的  磺胺异恶唑  300mcg  抗性的  林可霉素  2mcg  中间的  四环素  30mcg  易感的  新霉素  30mcg  抗性的  万古霉素  30mcg  易感的

瑞士乳酸杆菌R52向CNCM(巴斯德研究所)登记，编号I-1722。

鼠李糖乳酸杆菌R11向CNCM(巴斯德研究所)登记，编号I-1720，并且还以编号990411在加拿大食品检验署登记。

胚芽乳酸杆菌R1012向CNCM(巴斯德研究所)登记，编号MA18/5U。

特别优选的益生菌组分混合物包含长双歧杆菌优选长双歧杆菌R175与乳酸杆菌优选优选瑞士乳酸杆菌R52结合，和/或与胚芽乳酸杆菌优选胚芽乳酸杆菌R1012相结合。

上述益生菌特定混合物呈现稳定性、粘着、定殖和增殖能力特征，理想地用于本发明的目的。

根据其优选方面，根据本发明的组合物含有以下述量构成所述益生菌混合物的细菌种类：

-长双歧杆菌500亿CFU/g；

-瑞士乳酸杆菌1500亿CFU/g；

-胚芽乳酸杆菌1500亿CFU/g。

而在本发明的又一方面，优选的益生菌组分混合物包含长双歧杆菌和鼠李糖乳酸杆菌。

上述益生菌特定混合物呈现稳定性、粘着、定殖和增殖能力特征，理想地用于本发明的目的。

在本发明优选的方面，本发明的组合物含有以下述量构成所述益生菌混合物的细菌种类：

-长双歧杆菌500亿CFU/g；

-鼠李糖乳酸杆菌1500亿CFU/g。

在优选的实施方式中，益生菌组分的混合物包含长双歧杆菌，优选长双歧杆菌R175和鼠李糖乳酸杆菌，优选鼠李糖乳酸杆菌R11。

为了增强和/或改进益生菌种类的存活，优选使所述益生菌种类与包含非益生菌成分的载体相结合，所述非益生菌成分不仅用作益生菌的食品来源而且有助于增强作为整体的组合物的功效。

已经证明，当施用乳酸杆菌和双歧杆菌以调节肠内菌丛时，效果可能是暂时的，原因在于外源细菌的增殖可能被限制。本发明人已经显示双歧杆菌属特别是长双歧杆菌当单独施用时具有差的存活率。与益生元结合的补充施用法是解决该问题所必需的。本发明人已经令人惊讶地发现，当益生菌组分更具体而言长双歧杆菌与包含益生元的载体一起施用时，该长双歧杆菌的存活得到改善和/或增强。

益生元是用于向被称为益生菌组分的特定细菌物种提供合适的选择性营养以便在肠中支持其抗性、定殖能力和繁殖能力的物质。在化学术语中，益生元物质对应于可消化和不消化的碳水化合物和膳食纤维。在消化后，这些物质完整地经过几乎所有的上胃肠道，而没有经历任何消化过程。当它们到达结肠时，它们代表其存在待被支持的健康/共生细菌的主要养分基质，所述健康/共生细菌可利用这些物质并消化它们，因此它们可作养分基质用。

并非所有以术语“益生元”归类的物质都具有相同的特定特征。

益生元是一类食品成分，其彼此非常不同，并且在化合物与化合物之间它们以不同的方式刺激并促进一些细菌种类的生长。

研究最广泛的益生元是菊粉(inulin)和果糖寡聚糖(FOS)。

在19世纪早期第一次描述的菊粉发现于很多植物中。从菊苣提取的菊粉目前优选用于饮食用途。将菊粉添加至产品中(这使其成为“共生的”)保证了整个菌丛的生理平衡所必需的营养基质的存在。当菊粉即非水解多糖分解(其仅能由细菌作用引起)时，其降低肠pH，因此保持结肠环境不适合病原体生长。

FOS也是广泛使用的益生元。在化学术语中，它们为短链果聚糖，并因此是可溶的，其聚合度不超过8个碳水化合物单元。从生物学观点看，添加该益生元混合物看来是合适且成功的：如最近所报道的，这些益生元显著改变肠内微生物群的组成，例如，将双歧杆菌从整个肠内种群的20％增加至71％。

在本发明的益生菌组合物中使用的载体优选包含益生元诸如纤维组分。益生元可用作益生菌种类诸如乳酸杆菌和双歧杆菌属的食物来源。在上胃肠道中，双歧杆菌属由于氧环境而不生长，但是乳酸杆菌可以是代谢活性的。如果生物的酶过程变成活性的，它们将寻求食物来源。作为益生菌的乳酸杆菌与益生元优选菊粉之间的协同关系能使乳酸杆菌经历代谢活性。如前所述，这对宿主可以是有益的，但是也意味着细胞在胃肠道内可能不能幸存于该生理活动。因此，可以认为，相对于不含益生元的单独乳酸杆菌菌株的组合物，在上胃肠道内乳酸杆菌与菊粉之间的积极协同作用提高本发明的含益生菌组合物的免疫增强能力，但是这种协同关系处于损害累积存活百分比的情况。

本发明组合物的载体组合物还用于与肠疾病特有的微环境作斗争，该微环境抵抗用益生菌补充之后的有效定殖。益生菌经常遇到以炎症、组织渗透性改变和促氧化情况为特征的环境，这些与游离阳离子的存在有关，游离阳离子阻止益生菌定殖。然而，由此开发的组合物允许非常高的胃肠定殖率，原因在于其准备了用于有效定殖同时伴随益生菌混合物有效到达的基质。

关于益生元组分，在该方面，可以使用碳水化合物和纤维如GOS、木低聚糖(xylooligosaccharides)、不消化的麦芽糖糊精、菊粉、异麦芽低聚糖(isomaltooligosaccharides)、拉克替醇、乳果糖和反式半乳寡糖(transgalactooligosaccharides)，即使在本发明的上下文中菊粉、果糖和/或果糖寡聚糖(FOS)是特别优选的。在最优选的实施方式中，益生元组分包含菊粉、果糖和/或FOS。

在优选的实施方式中，本发明的含益生菌组合物包含一种或多种量多达总组合物的约80％的益生元。在更优选的实施方式中，所述益生元是菊粉和果糖的组合。菊粉以载体组合物的约0至约100％的量存在；更优选的，菊粉以载体的约10至约100％的量存在；最优选地，菊粉为载体的约20％。果糖以载体组合物的约1至约100％的量存在；更优选的，果糖以载体的约1至约100％的量存在；最优选地，果糖以大于所述组合物的载体的50％的量存在。

所述载体组合物还包含乳铁蛋白。乳铁蛋白是一种重量为80,000道尔顿的特殊糖蛋白，其自1939年已见诸描述。乳铁蛋白与通常发现于母乳、唾液、眼泪、中性粒细胞的次生分泌粒和粘膜分泌物中的游离铁结合。

乳铁蛋白具有各种活性，特别是抗菌和抗炎活性。如通过很多研究所证实的，乳铁蛋白对与革兰氏阴性菌的外壁和与游离铁结合表现出特殊亲和性：通过第一作用机理，乳铁蛋白对致病菌发挥其“杀伤”能力，以及通过第二作用机理，其与游离铁螯合并将其从微环境中去除。

乳铁蛋白，以及限制致病菌的肠内生长，发挥了抗炎以及游离基清除性能。这种双重能力在肠中是特别重要的，在那里致病菌有时找到实现危险增殖的理想条件，因为该器官的典型pH限制转铁蛋白的正确操作，转铁蛋白是一种正常负责移除游离铁的蛋白质，游离铁是游离基来源并且因此损害肠粘膜。在优选的实施方式中，载体组合物包含量为约0至约10％的乳铁蛋白；更优选地，乳铁蛋白以约0.1％至约5％的量存在；最优选地，乳铁蛋白以约0.5％的量存在。

乳铁蛋白也已经被描述可起益生元的作用，其为共生细菌的发酵提供基质。

在本发明的实施方式中采用的矿物盐是一种或多种，选自镁、钾、锌和任选的铜以及它们的盐，包括但不限于葡糖酸镁、柠檬酸钾、葡糖酸锌和柠檬酸铜。

众所周知地，在患病期间，特别是如果与液体损失相关，细胞和组织代谢导致钠、钾、镁和氯损失。这些电解质是肌纤维细胞(包括平滑肠肌纤维细胞)的恰当机能、电解质平衡和肌肉与组织的渗透天平所必需的。具体而言，钾和镁储备的降低产生虚弱、无效肌收缩和神经肌肉板中的脉冲传输不足，即痛性痉挛。在压力、感染、环境温度增加、体力消耗(physical effort)、腹泻等情况下，添加镁和/或钾预防营养缺乏。

镁以约0至约100％的量存在于本发明的载体组合物中；更优选地，镁以约5至约20％的量存在；最优选地，为载体组合物的约14至约16％。最优选地，镁以葡糖酸镁存在。

钾以约0至约100％的量存在于本发明的载体组合物中；更优选地，钾以约0.1至约10％的量存在；最优选地，为载体组合物的约5％。最优选地，钾以柠檬酸钾存在。

锌是一种重要元素，其对支持超过100种酶的活性是必需的，包括DNA和RNA聚合酶，其中锌作为辅酶起作用。轻度锌缺乏导致免疫系统轻微机能减退，因此感冒相关病症的风险增加(诸如类流感和流感综合征)。在儿童中，轻度锌缺乏可导致生长轻微延迟，而严重的锌缺乏引起生长停止和性腺机能减退。最后，在怀孕期间缺锌产生畸形。锌的存在促进免疫系统的机能。锌以约0至约100％的量存在于本发明的载体组合物中；更优选地，锌以约0.1至约20％的量存在；最优选地，为载体组合物的约5％。最优选地，锌以葡糖酸锌存在。

任选地，铜可以被添加至本发明的载体中。铜是一种经由特定运输机制在肠水平吸收的元素。在肝中，其与血浆铜蓝蛋白结合，基于此，其分布于所有组织中。其经过胆汁和粪便被排泄。在组织中，铜是众多酶结构的一部分，所述酶包括氨基氧化酶、铁氧化酶、超氧化物歧化酶、酪氨酸酶等。铜缺乏(其是罕见的)可引起白细胞减少症、贫血、肌骨骼机能异常和皮肤色素减退。怀孕期间的缺乏可导致婴儿出生低体重。铜如果存在的话使免疫功能标准化，最重要的是有助于抗击由常见病毒支持的冬季病。

任选地，本发明的载体组合物还可包含谷胱甘肽和/或阿拉伯半乳聚糖。

谷胱甘肽也称为GSH，是一种由甘氨酸、胱氨酸和谷氨酸组成的三肽。其作为酶谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶的辅助因子在细胞内起作用，细胞利用所述酶来破坏致命分子诸如过氧化氢。由于存在巯基，谷胱甘肽可交替地从还原形式转换至氧化形式，充当抗氧化剂。由于其能够与氧化物质诸如自由基、过氧化氢和脂过氧化物反应，因此其是必要的，并且被认为是预防细胞衰老的关键酶。尽管其是一种肽，但是胃保护是不必要的，因为其被存在的胃液和肽酶不充分水解。口腔吸收非常好，并且发生在肠内。其最近也以高剂量被给予经历肿瘤和HIV治疗的患者。该产品非常安全。似乎没有毒性数据存在。患者的顺从性和产品的耐受性也很高。谷胱甘肽，如果存在的话，强化身体抗氧化剂防御并防止细胞和组织衰老。谷胱甘肽约0至约20％的量存在于本发明的载体组合物中；更优选地，谷胱甘肽以约0.1至约5％的量存在；最优选地，其为载体组合物的约1％。

阿拉伯半乳聚糖是具有高分子量(约200,000道尔顿)的多糖，其主链是半乳糖醛酸的聚合物，所述半乳糖醛酸在侧链位置被鼠李半乳糖醛酸羧甲基化和乙酰化。从生物学观点看，它们是强的巨噬细胞刺激物(在人和鼠巨噬细胞中，如果吞噬细胞活性被这些化合物刺激，则在该吞噬细胞活性期间观察到氧化亚氮生产的优良增长)并刺激T细胞的活性(在辅助细胞和细胞毒素种群中)。

阿拉伯半乳聚糖，如果存在的话，执行免疫刺激作用并促进对病原体感染的反应。更具体而言，任选添加有效的未吸收T-特异性免疫源(阿拉伯半乳聚糖)可允许局部T-特异性反应激活，这发生在肠的淋巴结区域中(派伊尔结(Peyer’s patches))，因此引起致病组分减少同时伴随化脓的益生菌组分到达。两种事件的同时发生进一步促进定殖和增殖事件，否则由于T-敏感性致病成分这些事件变得困难。

任选地，本发明的组合物还包含酵母(saccharomycetes或yeasts)。酵母的存在(如果使用)由于下述事实而证明是正确的，即，它们释放具有营养价值的微量元素和维生素并与病原体竞争。酵母还可以以富集葡聚糖的溶胞产物的形式来应用，即，限制病原体细菌粘附于肠粘膜的多糖结构。根据优选的实施方式，按照本发明的组合物特别是可以含有酿酒酵母和/或布拉氏酵母。根据特别优选的实施方式，本发明所采用的布拉氏酵母菌为布拉氏酵母菌ATCC74012。

关于进一步任选添加并非直接益生菌的成分，其主要目的同样是提供另外的益生元优势；上述例如适用半胱氨酸转运蛋白，诸如N-乙酰半胱氨酸等；同样适用对游离阳离子和阴离子具有螯合作用的成分，像具有任意聚合度的原花青素、花色素类和儿茶素等；以及同样适用已经在肠道水平调节免疫反应的成分，如各种紫锥花属、钩藤属和黄芪属。最后，同样适用添加大量营养素或微量营养素以及水溶性或脂溶性维生素。最后，添加抗氧化剂可以进一步对包含在本发明的组合物中的益生菌具有保护效应。

已经发现，根据本发明的组合物具备相当大的健康改善活性、维持和/或恢复肠健康、预防压力影响以及执行抗炎和免疫调节作用。同时，它们确保有效的定殖。根据本发明的组合物的效果大于分开施用组合物的单独组分之后获得的效果，这显然是由于各种组分之间的增效作用。

本发明特别优选的组合物含有：

a)益生菌组分的混合物，其包含长双歧杆菌R175、瑞士乳酸杆菌R52和胚芽乳酸杆菌R1012；

b)载体，其包含：

1)益生元组分，包含菊粉和果糖；

2)乳铁蛋白；

3)矿物盐混合物，由镁盐、钾盐和锌盐组成；和

4)谷胱甘肽。

在最优选的实施方式中，本发明的组合物含有：

a)益生菌组分的混合物，其包含长双歧杆菌500亿CFU/g；瑞士乳酸杆菌1500亿CFU/g；和胚芽乳酸杆菌1500亿CFU/g；和

b)载体，其包含：

1)益生元的混合物，其占总载体组合物的约80％，其中所述益生元为菊粉和果糖，其中菊粉以载体组合物的约10至约100％的量存在；最优选地，菊粉为载体的约20％，而果糖以载体组合物的约1至约100％的量存在；更优选地，果糖以载体组合物的约1至约100％的量存在；最优选地，果糖以大于所述组合物的所述载体的50％的量存在；

2)乳铁蛋白，其量为约0至约10％；更优选地，乳铁蛋白存在的量为约0.1％至约5％；最优选地，乳铁蛋白存在的量为约0.5％；

3)矿物盐，选自镁盐、钾盐和锌盐，其中镁以约0至约100％的量存在于本发明的载体组合物中；更优选地，以约5至约20％的量存在于本发明的载体组合物中；最优选地，为载体组合物的约14至约16％，并且镁是葡糖酸镁；其中钾以约0至约100％的量存在；更优选地，钾以约0.1至约10％的量存在；最优选地，为所述载体组合物的约5％，而且进一步地，钾是柠檬酸钾；以及进一步地，锌以约0至约100％的量存在于本发明的载体组合物中；更优选地，锌以约0.1至约20％的量存在；最优选地，其为载体组合物的约5％，并且其中锌以葡糖酸锌存在；和

4)谷胱甘肽，其中所述谷胱甘肽以约0至约20％的量存在于本发明的载体组合物中；更优选地，谷胱甘肽以约0.1至约5％的量存在；最优选地，其为载体组合物的约1％。

本发明进一步特别优选的组合物含有：

a)益生菌组分的混合物，其包含长双歧杆菌R175和鼠李糖乳酸杆菌R11；和布拉氏酵母菌；和

b)载体，其包含：

1)益生元组分，由菊粉和果糖组成；

2)乳铁蛋白；

3)矿物盐混合物，由镁盐、钾盐和锌盐组成；和

4)谷胱甘肽。

根据本发明的优选方法，本文所述的组合物将用于制备饮食补充剂。

根据本发明的组合物可以适当地配制用于口服施用，并且根据制药技术中熟知的常规方法制备，诸如在Remington’sPharmaceutical Handbook，Mack Publishing Co.，N.Y.，USA中描述的那些方法，利用其最终应用可接受的赋形剂、稀释剂、填料和防结块剂。示例性的其它成分包括柠檬酸、氧化镁、二氧化硅和本领域技术人员应当理解的其它成分。

根据本发明的组合物例如可以以可溶囊剂、口服可溶形式、胶囊、片剂、咀嚼片剂、具有时间依赖性和pH依赖性释放的多层片剂以及粒剂来配制。

本发明的组合物可用于提高和/或改善益生菌种类的生存力和可存活性，更具体而言，用于提高和/或改善长双歧杆菌的生存力。所述方法包括混合益生菌组分和载体，所述益生菌组分包含单独的或者与一种或多种益生菌种类结合的长双歧杆菌，所述载体包含：治疗有效量的一种或多种益生元；治疗有效量的一种或多种矿物盐；治疗有效量的乳铁蛋白；和任选地，治疗有效量的谷胱甘肽。如本文所用，“量(amount)”指的是适合上下文的数量或浓度。构成治疗有效量的物质的量根据各种因素而变，所述因素诸如具体物质的效力、功效等、施用途径以及所使用的剂型。本领域技术人员适当地考虑此类因素可以选择特定物质的治疗有效量。所述物质的浓度取决于期望的剂量。

如本文所述，如此配制的组合物在贮存于室温下时是稳定的。

另外，本发明的组合物还可以用于改善和/或提高益生菌物质的治疗效果。因为本发明的组合物已经展示出改善的益生菌存活，因此相信所述制剂具有更大的功效，原因在于更大数量的益生菌经过上及下消化道输送时存活。因此，本发明的组合物可用于改善和/或增强需要其的人类对象的胃肠健康和/或免疫。

下面列出根据本发明的一些制剂实施例。尽管阐述本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是尽可能精确地报道在具体实施例中列出的数值。然而，任意数值固有地含有某些必然因其各自试验测量中发现的标准偏差而引起的误差。下面的实施例意图阐述本发明而非作为结果限制其范围。

提供下面的实施例以阐述要求保护的方法及其实践。

实施例

实施例1

上述制剂如下制备：使胚芽乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌、长双歧杆菌与菊粉混合并在32rpm下掺合约10min。之后，将果糖、葡糖酸镁、葡糖酸锌、柠檬酸、香料、柠檬酸钾、氧化镁、二氧化硅、谷胱甘肽、乙酰舒泛钾、乳铁蛋白和三氯蔗糖添加至混合物中并在32rpm下再掺合10min。

实施例2

实施例3

上述制剂如下配制：使胚芽乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌、长双歧杆菌与菊粉混合并在32rpm下掺合约10min。之后，将果糖、葡糖酸镁、葡糖酸锌、柠檬酸、香料、柠檬酸钾、氧化镁、二氧化硅、谷胱甘肽、乙酰舒泛钾、乳铁蛋白和三氯蔗糖添加至混合物中并在32rpm下再掺合10min。

实施例4

测试包含在实施例3所述的制剂中的益生菌种类，以确定所述益生菌的存活率。在上胃肠道的动态、体外模型(也成为TIM-1)中，测试与单独菌株相比的本发明组合物中的益生菌菌株的存活。该TIM-1模型能够模拟人的胃室和小肠中的条件，并且因此能够用来评价当益生菌经过上胃肠道时其百分比累积存活。

在TIM-1中测试的实施例3的组合物含计算为9.81x10E9CFU益生菌细胞总量(菌落形成单位或CFU)。当评价实施例3组合物中包含的益生菌菌株的单独浓度时，通过微生物平板接种定量的每种菌株的数量为：

瑞士乳酸杆菌8.0x10E9CFU

胚芽乳酸杆菌8.7x10E8CFU

长双歧杆菌9.1x10E8CFU

针对实施例3的组合物中的每种菌株所定量的浓度为在TIM-1模型中测试单独菌株时使用的靶浓度。换言之，不管是在产品中的还是单独的益生菌菌株的浓度被设定为：瑞士乳酸杆菌，8x 10E9CFU；胚芽乳酸杆菌，8.7x 10E8CFU；长双歧杆菌，9.1x 10E8CFU。

在实际的试验中，单独益生菌和实施例3的组合物与膳食一起服用(清淡的欧洲大陆早餐)。因而，确认与膳食混合时每种菌株的最终量，因此，单独的以及在实施例3的组合物中所使用的每种益生菌的平均起始浓度为：

瑞士乳酸杆菌8.6x10E9CFU

胚芽乳酸杆菌7.0x10E8CFU

长双歧杆菌1.4x10E9CFU

TIM-1试验的结果概述在下面的表中：

之后，通过TIM-1单独测试下面鉴定的每种菌株。数据呈现在下面的表中。

这些数据显示存在组合物的增效作用。更具体而言，输送经过上胃肠道存活的长双歧杆菌益生菌细胞的数目比没有其它益生菌和载体测试时的数目多1000-倍多(大于3_log10)。独立于本发明的组合物施用的长双歧杆菌未显示有力的存活。事实上，同与瑞士乳酸杆菌、胚芽乳酸杆菌和载体结合施用时的42.9％累积存活相比，当单独施用时长双歧杆菌仅具有0.02％累积存活，所述载体包含：益生元(菊粉和果糖)、葡糖酸锌、葡糖酸镁、柠檬酸钾；谷胱甘肽和乳铁蛋白；和任选地，柠檬酸、氧化镁和二氧化硅。