山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测试剂盒和用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒快速鉴别检测的双重PCR方法。根据山羊痘病毒和绵羊痘病毒的基因组序列各设计一对PCR引物，可以扩增出相对应的特异性片段，实现对山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测与鉴别。本发明利用双重PCR技术，单管同步检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒，降低了对山羊痘和绵羊痘的检测成本和工作量，实现了对山羊痘和绵羊痘的鉴别检测。本发明建立了一种特异性强、灵敏度高、节时省力并且易于观察结果的双重PCR方法，操作简便，特异性强、灵敏度高、可重复性高，且没有复杂的后处理。

说明书

技术领域

本发明涉及山羊痘病毒和绵羊痘病毒试剂盒，属于动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种用于同步进行羊痘病毒属中山羊痘病毒和绵羊痘病毒的双重PCR检测试剂盒和应用试剂盒对山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行同步双重PCR检测的生物学检测方法。

背景技术

山羊痘病毒(Goatpox virus)和绵羊痘病毒((Sheeppox virus)均属于羊痘病毒属（Capripoxvirus），是导致动物羊痘的两种病原，患病羊主要表现为发热，皮肤、黏膜、器官表面广泛性丘疹或结节，淋巴结肿大，皮肤水肿，感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡，给养殖业带来较大的危害，造成严重的经济损失。此外，羊痘可以感染人，因而在公共卫生方面还具有重要意义(Key S J．，2007)。这两种病毒某些分离毒株可同时感染山羊和绵羊(Ahmed A M．，2007)，临床症状和发病机理上相似，传统的病原学检测方法操作复杂，不适宜临床诊断，且与其他痘病毒在血清上存在交叉反应，血清型诊断方法难以确诊。近年来，越来越多新型检测技术被应用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测和鉴别。Madhusudan H等人利用PCR-RFLP技术对山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行了研究，可以用于这两种病毒的分类及鉴定(Madhusudan H．，2004)。但这种技术在聚合酶链式反应之后还需要对产物进行纯化和酶切，费时费力。而目前国内外其他一些检测技术也不能区别检测这两种病毒，由此发明一种可以同时检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测方法，对这两种病毒及羊痘病毒属病毒的研究具有重要意义。在羊痘病毒检测方面，利用单管多重PCR对病原进行同步检测已经有很多的报告，但在兽医诊断方面，尚未有多重检测山羊痘和绵羊痘的检测方法。由于羊痘病毒可以感染人，人使用含有该病毒的肉制品，有患病的可能性，因此对食品安全的监督和检测有重大的意义。

病原体的PCR检测需要合成相应的特异PCR扩增引物，并设计适合每对引物的PCR的扩增条件，即可在临床检测中获得良好的结果，因此，该方法已在国内外的兽医临床检测中广泛应用。针对病原体核酸序列设计的双重PCR，需要针对不同的病原体设计各自特异且保守的寡核苷酸引物，并同时在同一个体系中进行反应，由于引物之间的相互作用的复杂性，故双重PCR扩增体系需要进行各方面条件的优化和调整。由于山羊痘病毒和绵羊痘病毒基因组非常相似，同源性很高，两对特异性引物的设计和PCR条件的设计是发明的核心。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于同步进行山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测和鉴别检测的双重PCR检测试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：山羊痘病毒和绵羊痘病毒在同一PCR反应体系中进行特异性扩增。山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测试剂盒包括Mix PCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管。其中：

所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成：

序列为SEQ ID NO1的10 mmol/L的上游引物0.5 μL；

序列为SEQ ID NO2的10 mmol/L的下游引物0.5 μL；

序列为SEQ ID NO3的10 mmol/L的上游引物0.5 μL；

序列为SEQ ID NO4的10 mmol/L的下游引物0.5 μL；

10×PCR buffer 缓冲液2.5 μL；

25 mmol/L MgCl₂ 2 μL；

10 mmol/L dNTP 1 μL；

5U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL；

灭菌水14.2 μL；

合计22 μL，为单次反应的用量。

所述阳性对照管，管内为山羊痘病毒和绵羊痘病毒各自的重组质粒，比例为1:1，2μL～20μL，其DNA序列如下：

山羊痘病毒重组质粒pMD19-T-G的DNA序列为SEQ ID NO5；

绵羊痘病毒重组质粒pMD19-T-S的DNA序列为SEQ ID NO6。

所述阴性对照管，管内为无羊痘病毒感染的山羊肌肉组织DNA样品，2μL～20μL。

所述灭菌去离子水管：1～2mL。

用所述试剂盒进行山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测方法，步骤如下：

(1)制备待测样品核酸模板

取 100μL～200μL或100mg～200mg待检样品，用商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取待检样品中的基因组DNA，即为待测样品核酸模板；

(2)PCR扩增检测：取3μL待测样品核酸模板和阴性对照管或3μL待测样品核酸模板阳性对照管，分别用Mix PCR反应液管进行PCR扩增；

PCR扩增条件是：

预变性：95 ℃ 5 分钟；

循环：94 ℃变性30秒，53 ℃退火30秒，72℃延伸30 秒，35个循环；

延伸：72 ℃ 5分钟；

（3）结果判定：在222bp和177bp位置有两条扩增条带，分别为山羊痘病毒和绵羊痘病毒特异性扩增条带，表示山羊痘病毒和绵羊痘病毒呈阳性；在这两处位置无可见扩增带，表示山羊痘病毒和绵羊痘病毒呈阴性。

在本发明的PCR扩增引物的设计上，遵循一般的引物设计要求，设计和针对山羊痘病毒和绵羊痘病毒的特异性引物，且保证在相同的退火温度下均能获得较好的扩增。针对特异性引物在扩增靶序列内部的不同位置，从而可以方便地通过扩增片段的长度的不同鉴别出山羊痘病毒和绵羊痘病毒。

本发明的优点是（1）本发明可以快速地对待检样品是否感染山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行鉴定和鉴别检测，具有较高的灵敏度。本发明可以组装成临床检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒病原的双重PCR检测试剂盒，供兽医临床和实验室检测所用。

（2）本发明提供的扩增试剂均经试验反复验证和优化，具有市场上同类PCR检测试剂盒相应优点。归纳起来为：1)特异性号：本发明对非羊痘病毒属病毒DNA无扩增，假阳性率低。2)灵敏度高：本发明对山羊痘病毒和绵羊痘病毒检测的最低检测量分别约为17.5 pg/μL和18.75 pg/μL。

附图说明

图1双重PCR扩增电泳；

图2双重PCR特异性试验电泳；

图3双重PCR灵敏度试验电泳；

图1中：1-山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR扩增条带；2-阴性对照；M-DL 2000 DNA Marker；

图2中：1～7：LSDV、CPV、大肠杆菌O157、沙门氏菌、羊组织、牛组织、SPPV、GTPV单重PCR；8：SPPV和GTPV双重PCR；9：空白对照；M：DL 2000 DNA Marker；

图3中：1-17.5 ng/μL GTPV，18.75 ng/μL SPPV；2-1.75 ng/μL GTPV，1.875 ng/μL SPPV；3-0.175 ng/μL GTPV，0.1875ng/μL SPPV；4-17.5 pg/μL GTPV，18.75 pg/μL SPPV；5-1.75pg/μL GTPV，1.875pg/μL SPPV；6-0.175 pg/μL GTPV，0.1875pg/μL SPPV；M：DL 2000 DNA Marker。

具体实施方式

实施例1、本发明引物的设计及筛选

根据已知的山羊痘病毒核酸序列和绵羊痘病毒核酸序列的基因组全长序列，利用应用ClustW 软件进行多重比对，用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，分别标记为：SEQ ID NO1……SEQ ID NO4。所有引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。用核酸提取试剂盒分别提取山羊痘病毒和绵羊痘病毒细胞毒DNA，采用权利要求1设计的引物分别扩增，排除有非特异性扩增的引物。

获得引物：

实施例2、阳性对照品的制备

采用市售商品化试剂盒提取阳性山羊痘病毒和绵羊痘病毒细胞培养物的DNA，用Mix PCR反应液管分别扩增山羊痘病毒和绵羊痘病毒DNA，反应分别能扩增出一条177 bp和222 bp左右的条带。用胶回收试剂盒回收扩增的目的条带，利用分光光度计测定回收的核酸的浓度。分别将其与pMD19-T载体进行连接反应，4℃连接过夜，将连接产物转化至JM109感受态细胞，抗性筛选、摇菌、PCR鉴定阳性者，提取重组质粒，测序验证，获得含目的片段的重组质粒pMD19-T-G和pMD19-T-S，将两种病毒的阳性质粒等比例混合，分装每支50μL, 浓度控制在80～100ng/μL。

实施例3、阴性对照品的制备

采用市售商品化核酸提取试剂盒分别提取无山羊痘病毒和绵羊痘病毒感染的山羊或绵羊皮肤或肌肉组织的DNA。用灭菌去离子水稀释，将浓度控制在80～100ng/μL，分装为每支50μL。

实施例4、制备待检样品的核酸模板

取 100μL～200μL或100mg～200mg待检样品，采用市售商品化核酸提取试剂盒提取样品中的基因组DNA，即为核酸模板。

实施例5、扩增体系的建立和优化

以标准阳性毒株DNA为模板，在非严谨的条件下进行扩增，优化扩增的退火温度，然后在优化的退火温度下，优化反应体系中的Mg²⁺浓度、引物浓度、PCR缓冲液浓度和Taq酶浓度。优化的Mix PCR反应液中包含：10×PCR buffers 2.5 μL，25 mmol/L MgCl₂ 2 μL，10mmol/L dNTP 1 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，10 μmol/L 引物SEQ ID NO1、 SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4各0.5 μL，灭菌双蒸水14.2 μL。在优化的退火温度和循环条件下，两个体系可以实现对山羊痘病毒和绵羊痘病毒的鉴定。优化的Mix PCR反应液的扩增条件是：

预变性：95 ℃ 5 min；

循环：变性 94 ℃ 30 s，退火 51 ℃ 30s，72℃ 30 s，延伸 72 ℃ 5 min，35个循环；

延伸：4 ℃保存。

实施例6、特异性和灵敏度

采用上述优化的体系和扩增条件，对标准阳性山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛疙瘩皮肤病病毒、犬细小病毒、大肠杆菌0157、沙门氏菌、健康羊组织和牛组织等核酸提取物进行扩增，均无非特异性扩增条带。

用灭菌去离子水梯度稀释阳性质粒DNA，用上述优化的体系和扩增条件扩增，本发明的最低检测限分别约为17.5 pg/μL和18.75 pg/μL

实施例7、试剂的制备

Mix PCR反应液：10×PCR buffers 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2 μL，10mmol/L dNTP 1 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，10 μmol/L 引物SEQ ID NO1、 SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4各0.5 μL，灭菌双蒸水14.2 μL，共22μL，每个试剂盒提供足做48个反应的量共22×48=1056μL。

实施例8、试剂盒的组装

如上所配制的阳性对照、阴性对照各1支，Mix PCR反应液1支，灭菌去离子水2支，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。

<110>  重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>  山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法

<160>  6    

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列 

<400> SEQ ID NO1

attataggaa ttgttgagag agat                                           24

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO2

tattttgtgc ggaaacgtgt ttgta                                          25 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO3

actaaacttg ttacattgtg a                                              21

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO4

aacttctcca tcaatacatg a                                              21

<210>  5

<211>  468

<212>  DNA

<213>  pMD19-Goatpox virus

<400>  SEQ ID NO5

attacaaaca cttccctcct taagctactt tttcttattt ttgtgcggaa acgtgtttgt     60

aaaatcgtac tattactatt taattcataa gataaaatgt tttttaaaaa aaaacaatga     120

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gaaaaagtgt tgttatctac tttttgtaat gtttcgcatg gagataat                  468

<210>  6

<211>  494

<212>  DNA

<213>  pMD19-Sheeppox virus

<400>  SEQ ID NO6

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