绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立

摘要

羊痘是由山羊痘病毒属病毒中的绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPPV)和山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)所引起的羊的一种高度急性、热性、接触性传染病,临床上以发热、皮肤出现痘疹、水泡或结节为主要特征。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种,发病率为50%～80%,病死率达20%～80%,其中羔羊病死率可达100%,导致妊娠羊流产,繁殖力下降,羊毛和羊皮品质严重受损.给养羊业带来了严重的经济损失。目前.羊痘已遍布世界大部分的国家和地区,以非洲、亚洲最为严重,我国多地也均有发生,有的地区呈暴发流行,并有上升趋势。此外,还存在一定的公共卫生安全问题。通常认为羊痘的感染具有宿主特异性,但越来越多的研究表明,SPPV和GTPV的某些毒株具有交叉感染性。绵羊痘和山羊痘具有十分相似的临床症状和发病机理,与副痘病毒引起的病症也有相似之处,有的病例发生继发感染或与其他疾病混合感染,通过临床特征很难诊断。羊痘病毒的分离培养和电镜观察特异性较强,但耗时冗长,需要专业仪器和技术,不适于快速诊断和基层应用的要求。血清学检测方法相对简便,但机体感染羊痘主要引起细胞免疫,仅产生较低水平的中和抗体,且SPPV、GTPV、牛疙瘩皮肤病毒(Lumpyskindiseasevirus,LSDV)及副痘病毒间存在共同的抗原和相似血清型,因而血清学检测方法的灵敏度和特异性不高,亦不能相互鉴别诊断。因此,建立一种快速、简捷、准确的且能同时榆测绵羊痘和山羊痘的方法,对羊痘的早期诊断、疫情监控、流行病学调查及早日消除羊痘等具有重要意义。
　　 为保障养羊业健康发展,加快现代畜牧业前进步伐,本研究从分子生物学出发,以PCR方法为技术基础,建立了一种鉴别诊断SPPV和GTPV的以重PCR检测办法,主要研究内容包括以下几个方面:
　　 1、通过对GenBank中发表的SPPV和GTPV的全基因组序列进行分析,应用PrimerPremier5.0生物学软什设计出两对引物进行PCR反应,将扩增的PCR产物进行纯化后连接到pMD19-T载体,构建质粒pMD19-S和pMD19-G,质粒测序结果与GenBank中发表的基因组序列进行比对,结粜表明,两对引物能特异性地扩增出目的片段,pMD19-S与SPPV基因组序列的相似性在98%以上,pMD19-G与GTPV基因组序列的相似性为96%。
　　 2、通过对PCR反应体系中引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度和退火温度的优化,建立了SPPV单重PCR检测方法和GTPV单重PCR检测方法。特异性试验结果表明:各单重PCR方法仅对日的基因有扩增,对其他病原或健康组织无扩增。灵敏度试验结果表明:SPPV单重PCR检测方法最低可检测到3.45×106copies/μL的SPPV质粒DNA,GTPV单重PCR检测方法最低可检测到3.42×103copjes/μL的GTPV质粒DNA。
　　 3、在已建立的SPPV单重PCR方法和GTPV单重PCR方法的基础上,通过对PCR反应体系中引物浓度、dNTP浓度,Mg2+浓度和退火温度进行优化。建立了单管同时扩增SPPV和GTPV的双重PCR方法。特异性试验结果表明:该方法能特异性扩增SPPV长度为177bp和GTPV长度为222bp的目的片段,对其他病原或健康组织无扩增。灵敏度试验结果表明:该方法最低可检测到1.725×107copies/μL的SPPV质粒DNA和1.71×106copies/μL的GTPV质粒DNA。
　　 4、分别采用病毒分离、绵羊痘和山羊痘单重PCR和双重PCR方法对采自甘肃与重庆地区的50份疑似羊痘病料进行检测,其阳性检出率分别为14%、4%、10%、14%。试验表明:双重PCR能区别诊断绵羊痘和山羊痘,具有更高的特异性,优于病毒分离培养方法;单重PCR方法与双重PCR的符合率为100%,单重的PCR可以用于对双重PCR扩增结果的验证。双重PCR方法简便、快速、具有高灵敏度和特异性,可以用于临床样品的检测。
　　 总之,本研究建立的双重PCR诊断方法能对绵羊痘病毒和山羊痘病毒单个或混合感染的病毒样品进行快速诊断,不仅对羊痘的临床检测提供了科学的理论依据和技术支持,而且对绵羊痘病毒和山羊痘病毒的流行病学调查和防控具有重要的意义。