一种判别螺旋藻品系能否应用于大规模养殖生产的方法

摘要

本发明属于螺旋藻开发应用的技术，旨在提供一种判别螺旋藻品系能否应用于大规模养殖生产的方法。该方法是对被鉴定螺旋藻品系的ftsZ基因进行测序，并与已知钝顶螺旋藻品系一起进行基于ftsZ基因序列的差异位点数分析及系统发生树构建；如果被鉴别螺旋藻品系与已知钝顶螺旋藻品系的ftsZ基因序列聚成一类，表示被鉴定螺旋藻品系生产性状优良能够应用于大规模养殖生产。应用ftsZ基因序列鉴别螺旋藻品系生产性状优劣的新方法与常规方法相比，不仅简单快速、标准明确，而且成本低，并适合大规模、高通量筛选。

说明书

技术领域

本发明属于螺旋藻开发应用的技术，特别涉及一种判别螺旋藻品系能否应用于大规 模养殖生产的方法。

背景技术

螺旋藻(Spirulina)，是一种光合放氧、呈规则螺旋形的原核丝状微藻，系蓝藻 门(Cyanophyta)、颤藻目(Oscillatoriales)、颤藻科(Oscillatoriaceae)的一 个属[武汉植物学研究，1997，15(4)：369-374]，因其富含优质蛋白和多种生物活性物 质而受到国内外的极大关注，目前已在大量研究的基础上形成了庞大的螺旋藻产业，并 应用于食品、生物医药保健、饲料、精细化工等领域。该属中的钝顶螺旋藻(Spirulina  platensis)是国内外在商业化养殖生产与开发中应用最广泛的品种。值得指出的是， 众多的实验研究与长期的生产实践表明，钝顶螺旋藻种下有许多品系，它们对温度、光 质、光照强度，以及培养液的盐度、pH和营养成分等环境因子的要求与适应性存有显著 差异[水生生物学报，1999，23(1)：59-64]。目前国内外几乎都采用开放或半封闭、跑 道型循环式培养池这一较粗放的养殖生产模式，许多环境因子，特别是温度和光照强度， 难以人为调控，有些钝顶螺旋藻品系在实验室或生产小试中虽然表现出优良的生产性 能，但进入生产池后，因难以适应环境因子的较大变化而无法应用于大规模生产。因此， 选育品性兼优的品系一直是螺旋藻养殖生产与开发中最重要的环节与技术要点之一。

目前国内外鉴别螺旋藻品系优劣的常规方法是，先在实验室作多种环境因子交叉组 合培养试验，根据所测定的生长曲线、光合放氧、生化组成等指标作初步筛选；再依次 转接到室外约5m²、50m²及500m²的培养池中于不同季节与气候及营养条件下进行养 殖小试、中试与生产性试验，进而筛选出优良藻株。这一方法虽然实用，但程序繁琐、 工作量大、周期长、成本高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足之处，建立既实用，又简便、耗时少、低成本 的螺旋藻品系优劣的鉴别新方法，以满足当前国内外螺旋藻产业不断发展的实际需要。

本发明是在长期研究螺旋藻分子遗传学背景，特别是螺旋藻细胞骨架蛋白基因ftsZ 的基础上，建立起一种判别螺旋藻品系能否应用于大规模养殖生产的新方法。

我们通过设计特定的引物，利用PCR等分子生物学方法克隆并测定了5株钝顶螺旋 藻品系(分别为Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18、Sp-37)的ftsZ基因序列，进而利用生 物信息学及分子系统分类学等分析显示，依据ftsZ基因序列的差异位点数和相似程度， 这5株品系被分成有显著差异的两大类。即Sp-4、Sp-12和Sp-17为一类；Sp-18和Sp-37 为另一类。长期的实验研究与生产实践表明，这5株钝顶螺旋藻品系在温度、光照等环 境因子能自动调控的实验室培养试验中均表现优良，但只有Sp-4、Sp-12、Sp-17这三 株品系在实际生产养殖中表现优良，Sp-18和Sp-37因适应能力差而不能用作生产良种。 由此可见，ftsZ基因序列特征与螺旋藻生产性状存在着相关性。因此，应用ftsZ基因 序列可以作为鉴别螺旋藻生产性状优劣的分子标记，即被鉴别品系的ftsZ基因序列若 与Sp-4、Sp-12、Sp-17的聚成一类，则可能生产性状优良；若与Sp-18、Sp-37的聚成 一类，则可能不可应用于生产。

具体地，为解决技术问题，本发明提供的判别螺旋藻品系能否应用于大规模养殖生 产的方法，是对被鉴定螺旋藻品系的ftsZ基因进行测序，并与已知钝顶螺旋藻品系 Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18、Sp-37一起进行基于ftsZ基因序列的差异位点数分析及 系统发生树构建；如果被鉴别螺旋藻品系与Sp-4、Sp-12和Sp-17的ftsZ基因序列聚 成一类，表示被鉴定螺旋藻品系生产性状优良能够应用于大规模养殖生产；如果被鉴别 螺旋藻品系与Sp-18、Sp-37的ftsZ基因序列聚成一类，则表示被鉴定螺旋藻品系适应 能力差不能应用于大规模养殖生产。

该方法具体包括以下步骤：

(1)PCR引物设计与扩增

利用Primer 5.0引物设计软件进行PCR扩增引物的设计，得到上游引物PF： 5’-ATGAACAGTCCTGGAGTAGTGA-3’、下游引物PR：5’-GGAATAGAAGTTATGGGTCGA-3’；

扩增的反应条件为：25μL PCR反应体系中含引物PF和PR各0.5μmol/L，4种dNTP (dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各1μmol/L，2.5U的Taq DNA聚合酶，10倍的PCR缓 冲液2.5μL，50ng基因组DNA，反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s，42℃ 45s，72℃ 1min， 31个循环；72℃ 8min；

(2)PCR产物的克隆及测序

将经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化的PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化感受态 E.coli TG1，蓝白斑法筛选阳性克隆，提取质粒并作酶切鉴定，将含有目的片段的重 组质粒进行测序，分别测得Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18、Sp-37和待鉴定螺旋藻品系 基因组DNA的ftsZ基因序列；

(3)序列比对与系统发生树构建

对上述Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18、Sp-37和待鉴定螺旋藻品系的多重序列比对 采用Clustal X 1.81软件，其系统发生树的构建采用Phylip 3.65软件包；以ftsZ基 因序列作为一种分子标记与已知螺旋藻品系进行比对，由此鉴别螺旋藻生产性状的优 劣。

本发明在扩增反应中选用的试剂和仪器为：Taq DNA聚合酶和琼脂糖为上海生工生 物工程公司产品；克隆载体pMD18-T，以及dNTP、DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶均 为日本TaKaRa公司产品；DNA凝胶回收试剂盒购于上海英骏公司；PCR引物由上海英骏 公司合成，其它试剂均为分析纯，序列扩增用美国Hybaid公司的Thermal Cycler PCR 仪，测序用美国ABI公司的3730型测序仪。

本发明的有益效果在于：

应用ftsZ基因序列鉴别螺旋藻品系生产性状优劣的新方法与常规方法相比，不仅 简单快速、标准明确，而且成本低，并适合大规模、高通量筛选。

附图说明

图1为5株用于构建生产性状鉴别标准的螺旋藻品系的系统发生树示意图；

图2为被鉴别藻株Sp-1与Sp-3在所建鉴别标准中的归类图。

具体实施方式

本发明的详细技术方案可以通过以下步骤实施：

1、选用材料：用于构建鉴别标准的5株钝顶螺旋藻品系为公知的Sp-4、Sp-12、 Sp-17、Sp-18和Sp-37(浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室 也有保存)，在温度、光照等环境因能自动调控的实验室培养试验中均表现优良，其 中Sp-4、Sp-12和Sp-17对环境适应能力强，在大规模生产养殖中被广泛应用；而Sp-18 和Sp-37因适应能力差而不能用作生产良种。

2、选用的试剂和仪器：Taq DNA聚合酶和琼脂糖为上海生工生物工程公司产品； 克隆载体pMD18-T，以及dNTP、DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶均为日本TaKaRa 公司产品；DNA凝胶回收试剂盒购于上海英骏公司；PCR引物由上海英骏公司合成。其 它试剂均为分析纯。序列扩增用美国Hybaid公司的Thermal Cycler PCR仪，测序用 美国ABI公司的3730型测序仪。

3、PCR引物设计与扩增

利用Primer 5.0引物设计软件得到上游引物PF： 5’-ATGAACAGTCCTGGAGTAGTGA-3’，下游引物PR：5’-GGAATAGAAGTTATGGGTCGA-3’， 25μL PCR反应体系中含引物PF和PR各0.5μmol/L，4种dNTP(dATP、dGTP、dCTP 和dTTP)各1μmol/L，2.5U的Taq DNA聚合酶，10倍的PCR缓冲液2.5μL，50ng基 因组DNA[提取方法参考“海洋与湖沼”，2002，33(2)：203-208]。反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30s，42℃ 45s，72℃ 1min，31个循环；72℃ 8min。

4、PCR产物的克隆及测序

将经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化的PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化感受态 E.coli TG1，蓝白斑法筛选阳性克隆，提取质粒并作酶切鉴定，将含有目的片段的重 组质粒进行测序。

测得Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18和Sp-37基因组DNA的ftsZ基因序列，分别如 SEQID NO：1、SEQID NO：2、SEQID NO：3、SEQID NO：4和SEQID NO：5所示。

5、序列比对与系统发生树构建

对上述Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18和Sp-37的多重序列比对采用Clustal X 1.81 软件，其系统发生树的构建采用Phylip 3.65软件包。

本发明的结果分析

基于ftsZ基因序列的差异位点数分析及系统发生树构建：

Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18和Sp-37的基因组DNA分别经ftsZ基因序列的特定 引物PCR扩增与克隆，并测得相应的上述序列。

运用Clustal X 1.81软件对上述5株螺旋藻品系的ftsZ基因序列的多重序列比对 分析结果如下：

其中Sp-18和Sp-37这两株品系与Sp-4、Sp-12或Sp-17两两间的碱基差异位点 被标为下划线，“-”表示缺失位点；“*”表示5个品系的ftsZ基因序列的相同位点； 其具体比对情况如表1所示。

表1 5株品系的ftsZ基因的序列的比较

根据上述比较，进行统计得到品系间碱基的差异位点数。

由表2可知，Sp-18和Sp-37之间的差异位点数为3；Sp-4和Sp-12之间的差异位 点数也仅为1；Sp-4和Sp-17之间的差异位点数为6；Sp-12和Sp-17之间的差异位点 数为5；然而Sp-18、Sp-37这两株品系与Sp-4、Sp-12或Sp-17两两间的差异位点数达 26-31。进一步将上述5株品系的ftsZ基因序列的多重序列比对结果导入Phylip 3.65 软件包的dnamlk程序构建系统发生树。结果如附图1所示，5株品系可分为两大类：Sp-18 和Sp-37为一类；Sp-4、Sp-12和Sp-17为另一类，这与上述差异位点数分析的结果相 吻合。长期的实验研究实践表明，这5株钝顶螺旋藻品系在温度、光照等环境因子能自 动调控的实验室培养试验中均表现优良，但只有Sp-4、Sp-12和Sp-17这3株品系在实 际生产养殖中表现优良，而Sp-18和Sp-37因适应能力差而不能用作生产良种。根据上 述，ftsZ基因序列特征与螺旋藻生产性状存在相关性，因此，ftsZ基因序列可以作为 鉴别螺旋藻生产性状优劣的分子标记，即被鉴别品系的ftsZ基因序列若与Sp-4、Sp-12 和Sp-17的聚成一类，则可能生产性状优良；若与Sp-18、Sp-37的聚成一类，则不可 应用于生产。

表2 5株品系的ftsZ基因序列的差异位点数

作为实施例，我们选取了Sp-1和Sp-3这两株公知的钝顶螺旋藻品系(浙江大学原 子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存)来验证本发明的实用性。其 中，Sp-3在实验室培养试验和大规模生产养殖中均表现良好，被广泛应用于大规模生产 养殖；而Sp-1虽在实验室培养试验中表现良好，但在实际生产中却因适应性差而不适 用于大规模生产养殖。通过克隆并测定Sp-1和Sp-3的ftsZ基因序列分别如SEQID NO： 6和SEQID NO：7所示。

利用生物信息学及分子系统分类学等分析表明，Sp-1品系的ftsZ基因序列与Sp-18 和Sp-37的聚成一类；Sp-3品系的ftsZ基因序列与Sp-4、Sp-12和Sp-17的聚成一类； 如图2所示。该例子进一步说明，ftsZ基因序列作为一种分子标记来比对鉴别螺旋藻生 产性状的优劣是可行的，证明本发明的判别方法是可以实现的。