一种高效价可利霉素的发酵生产方法及其所用的培养基

摘要

本发明公开了一种高效价可利霉素的发酵生产方法及其所用的培养基。所述的培养基包括斜面培养基、种子培养基、发酵培养基和发酵过程补料培养基磷酸镁。所述的发酵生产方法，包括菌种的选取、培养基配制、斜面种子培养、摇瓶种子培养、发酵罐培养、产物的分离及纯化和产物的干燥等7个步骤，所得的可利霉素发酵液的平均生物效价为2100U/mL，相对提高了16.7%。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效价可利霉素的发酵生产方法及其所用的培养基。

背景技术

可利霉素（曾用名必特螺旋霉素 ，生技霉素Bitespiramycin）是利用基因重组技术获得的基因工程菌的发酵产物，将异戊酰基转移酶基因（ist），硫链丝菌素抗性基因（str）克隆至温敏型链霉菌/大肠杆菌穿梭质粒载体pKC1139（阿普霉素抗性），而获得基因工程菌WSJ-1。属于一种新型大环内酯类抗生素。由于其在国内外均为首创，于2000年11月获得中国发明专利（专利号：ZL97104440.6）并在大量临床前试验研究基础上，于2001年7月获得国家药品监督管理局颁发的“新药临床研究批件”。

目前可利霉素在发酵罐上平均效价为1800U/mL左右，产量也较低。在可利霉素发酵后期，较高浓度的铵离子会抑制抗生素的生物合成。因为过量铵会抑制酰基CoA合成酶和酰基激酶-酰基磷酸转移酶的活性，降低胞内可利用的短链脂肪酸，减弱这些前体的供体代谢，从而影响可利霉素的产物合成，进一步影响其产率及效价。

发明内容

本发明为了解决上述的技术问题，而提供了一种高效价可利霉素的发酵生产方法及其所用的培养基。

本发明的技术原理

利用磷酸镁可以捕捉铵离子的效应。通过在发酵24小时在发酵液中补进磷酸镁盐，以降低发酵后期发酵液中铵离子的浓度，并逐步缓释磷酸镁中的磷促进可利霉素的合成，发酵液的最终平均生物效价提高到2100U/mL。

本发明的技术方案

一种高效价可利霉素的发酵生产方法，包括如下步骤：

（1）、菌种的选取

本发明所用的菌种WSJ-195甘油管为于2002年9月27日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.0801；

（2）、培养基配制

①、斜面培养基（g/L）

葡萄糖            10

淀粉              20

黄豆饼粉          10

NaCl               4

CaCO₃                        5

琼脂               20

余量为去离子；

0.1 MPa,121℃灭菌30 min备用；

②、种子培养基（g/L）

葡萄糖         10

淀粉           30

黄豆饼粉       20

NaCl            4

CaCO₃            5；

余量为去离子水；

0.1 MPa,121℃灭菌30 min备用；

③、发酵培养基（g/L）

葡萄糖           20

淀粉             40

鱼粉             20

玉米浆           10

NH₄NO₃             6

CaCO₃             5

KH₂PO₄            0.5

MgSO₄·7H₂O       2

NaCl             l0

余量为自来水；

0.1 Mpa,121℃灭菌30min备用；

④、发酵过程所用的补料培养基

按其与发酵液重量比计算即发酵过程所用的补料培养基：按发酵液为0.2~0.6:100；

所述的发酵过程所用的补料培养基为磷酸镁；

（3）、斜面种子培养

将茄子瓶中加入40mL斜面培养基，0.1 MPa,121℃灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的甘油管中取2mL液体菌丝，在斜面培养基上划线接种，37℃培养13天，得斜面菌丝；

（4）、摇瓶种子培养

将步骤（3）所得的斜面菌丝，用消毒好的接种铲1cm*2cm大小接种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于摇床，控制转速220r／min，28℃培养48h，得摇瓶种子；

（5）、发酵罐培养

按4%接种量将步骤（4）所得的摇瓶种子接种于装有发酵培养基的自动发酵罐中，控制转速为400r／min，温度为28℃自然pH培养至20~26h后，一次性在无菌状态下加入补料培养基磷酸镁，继续控制转速为400~600r／min，温度28℃再培养70~80h，发酵结束；

（6）、可利霉素的分离及纯化

          取步骤（5）所得的发酵液，用聚合氯化铝凝絮发酵液中的蛋白质，以降低发酵液粘度，然后用板框过滤，将所得滤液用氢氧化钠调节pH值到8.5-9.0，然后用丁酯萃取；

萃取所用的丁酯量按所取的发酵液中含可利霉素总效价换算，即每10000U可利霉素添加1mL丁酯萃取；

萃取所得的酯相依次经蒸馏水、浓度为0.5%磷酸二氢钠水溶液依次洗涤后，再加入浓度为0.7%的磷酸二氢钠水溶液，其加入量按所取的发酵液中含可利霉素总效价换算，即每20000U可利霉素添加1mL浓度为0.7%的磷酸二氢钠水溶液，然后用盐酸调节pH到2.0-2.5，将产物反相萃取到水相中；

洗涤所用的蒸馏水、浓度为0.5%磷酸二氢钠水溶液的量按体积计算分别为所用丁酯体积量的1/4；

（7）、可利霉素的干燥

         将步骤（6）所得的水相，用2M氢氧化钠调pH到4.5-5.0进行中和，然后通入空气吹掉水相中残留的丁酯，丁酯吹干净的判断标准为通入气体可将水相吹出大量泡泡，然后用2M氢氧化钠调节pH到8.5-9.0得到结晶液，结晶液抽滤后得到湿品，50-55℃真空干燥即得到可利霉素。

本发明的技术效果

本发明的一种高效价可利霉素的发酵生产方法，由于利用发酵过程24小时时一次性添加的补料培养基磷酸镁，利用其化学螯合作用捕捉发酵液中铵离子，解除了发酵过程中过量铵对酰基CoA合成酶和酰基激酶-酰基磷酸转移酶的活性的抑制，从而促进了胞内可利用的短链脂肪酸的合成，从而有利于可利霉素的合成，使得发酵后最终可利霉素的发酵液的生物效价达到2100U/mL，相对提高了16.7%。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步阐释，但并不限制本发明。

本发明检测所用主要的仪器

双层培养摇床  SPY50                    上海市离心机械研究所

温控微孔板培养摇床  SCS-24               上海市离心机械研究所

pH计                                   上海精密仪器仪表公司

DMQ立式灭菌锅                          山东新疗器械股份有限公司

台式离心机  TDL80-2B                     上海安亭科学仪器厂               

水平层流洁净工作台  SA-1480-2         上海上净净化设备有限公司

电子天平   BS-1500L                上海友声衡器有限公司

型智能生化培养箱  SHX             上海华连医疗器械有限公司

酶标仪  MK3                     奥赛飞世尔（上海）仪器有限公司

发酵罐FUS-15L（A）               上海国强生化公司

本发明所使用主要试剂原料

黄豆粉                      沈阳抗生素厂

鱼粉                        浙江正大鱼粉

豆油                        沈阳抗生素厂

硝酸铵（分析纯）            上海统亚化工科技发展有限公司

磷酸镁 (分析纯)             上海新宝精细化工厂

磷酸二氢钾（分析纯）        上海凌峰化学试剂有限公司

氯化钠（分析纯）            上海凌峰化学试剂有限公司         

硫酸镁（分析纯）            上海凌峰化学试剂有限公司

碳酸钙                      同联集团生产用

蛋白胨（生化试剂）          上海中洋海洋生物工程有限公司

葡萄糖（分析纯）            中国惠兴生化试剂有限公司                   

酵母粉                      安琪酵母股份有限公司

蛋白聚胨                    日本制药株式会社

牛肉膏（生化试剂）          北京奥特里生物技术责任有限公司

琼脂（生化试剂）            中国惠兴生化试剂有限公司

乙酸乙酯（分析纯）          上海凌峰化学试剂有限公司

甲醇（分析纯）              上海振兴化工一厂

盐酸（分析纯）              上海凌峰化学试剂有限公司  

氢氧化钠（分析纯）          上海凌峰化学试剂有限公司  

碘化钾（分析纯）            国药集团化学试剂有限公司                   

硫酸铜（分析纯）            上海凌峰化学试剂有限公司

酒石酸钾钠（分析纯）        国药集团化学试剂有限公司

甲醛（分析纯）              宜兴市亚茂化工原料厂        

甲基红（分析纯）            中国远航试剂厂

酚酞（指示剂）              中国医药（集团）上海化学试剂公司

硫酸（分析纯）              国药集团化学试剂有限公司

可溶性淀粉                  国药集团化学试剂有限公司。

本发明的可利霉素的效价测定方法

本发明所得的可利霉素发酵液的生物效价的测定方法，采用比浊法，其测定的具体步骤如下：

（1）、检测用枯草芽孢杆菌（中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，其保藏编号为CICC  22946）的菌悬液制备

茄瓶斜面37℃培养7天，革兰氏染色芽孢率为85 %以上后，50mL无菌水洗下，65℃水浴，杀死营养体，置于4℃的冰箱保存；

茄瓶所用的斜面培养基(g/L)：

牛肉膏          1.5

蛋白胨          6

葡萄糖          2

酵母膏          6

琼脂………………20

余量为去离子水；

（2）、将本发明所得的发酵液稀释100倍后得稀释后的发酵液；

（3）、取步骤（2）稀释后的发酵液30μL接入到270μL的液体培养基中37℃，220r／min在孔板摇床上培养4小时，然后在OD600下测定液体培养基的吸光值，计算生物效价；

上述所用的液体培养基(g/L)：

牛肉膏          1.5

蛋白胨           6

葡萄糖           2

酵母膏           6

余量为去离子水； 

消前用2M氢氧化钠调pH 8.5，0.1 MPa，即121℃灭菌30min备用；

所述的生物效价的计算方法如下：

y=59.88*C*10^-x，其中，Y为可利霉素的发酵液的生物效价，单位：U/mL；C为稀释倍数，本发明为100；X为OD600下测定的吸光值。

实施例1

一种高效价可利霉素的发酵生产方法，包括如下步骤：

（1）、实验用菌种WSJ-195甘油管；

（2）、配置斜面培养基500mL,摇瓶种子培养基1000mL,发酵罐培养基10L，培养基成分配制如下： 

①、斜面培养基（g/L）

葡萄糖            10

淀粉              20

黄豆饼粉          10

NaCl               4

CaCO₃                        5

琼脂               20

余量为去离子；

0.1 MPa，即121℃灭菌30 min备用；

②、种子培养基（g/L）

葡萄糖         10

淀粉           30

黄豆饼粉       20

NaCl           4

CaCO₃           5；

余量为去离子水；

0.1MPa，即121℃，灭菌30min备用；

③、发酵培养基（g/L）

葡萄糖           20

淀粉             40

鱼粉             20

玉米浆           10

NH₄NO₃            6

CaCO₃             5

KH₂PO₄            0.5

MgSO₄·7H₂O        2

NaCl              l0

余量为自来水；

在发酵罐中121℃灭菌30min备用； 

④、发酵过程所用的补料培养基

按其与发酵液重量比计算即发酵过程所用的补料培养基：发酵液为0.2：100；

所述的发酵过程所用的补料培养基为磷酸镁，称取磷酸镁20克，0.1 MPa，即121℃灭菌30min备用；

（3）、斜面种子培养

将茄子瓶中加入40 mL斜面培养基，0.1 MPa，即121℃灭菌30 min，冷却至室温。保存的菌株为甘油管，用消毒好的移液器从保存的甘油管中取2mL液体菌丝，在斜面培养基上划线接种，37℃ 培养13天，得斜面菌丝；

（4）、将步骤（3）所得的斜面菌丝，用消毒好的接种铲将1cm*2cm大小菌丝块接种装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，共10瓶，置于摇床上，控制转速为220r／min，温度为28℃培养48h，得摇瓶种子；

（5）、发酵罐培养

按4%接种量将步骤（4）所得的摇瓶种子400mL接种于装有10L发酵培养基的15L自动发酵罐中，控制转速为400r／min，温度为28℃自然pH培养至24h后，一次性在无菌状态下加入补料培养基磷酸镁20克，继续控制转速为400r／min，温度28℃再培养72h，发酵结束； 

（6）、产物的分离及纯化

取步骤（5）所得的发酵液，用聚合氯化铝凝絮发酵液中的蛋白质，以降低发酵液粘度，然后用板框过滤，将所得滤液用氢氧化钠调节pH值到8.5-9.0，然后用丁酯萃取；

萃取所用的丁酯量按所取的发酵液中含可利霉素总效价换算，即每10000U可利霉素添加1mL丁酯萃取；

萃取所得的酯相依次经蒸馏水、浓度为0.5%磷酸二氢钠水溶液依次洗涤后，再加入浓度为0.7%的磷酸二氢钠水溶液，其加入量按所取的发酵液中含可利霉素总效价换算，即每20000U可利霉素添加1mL浓度为0.7%的磷酸二氢钠水溶液，然后用盐酸调节pH到2.0-2.5，将产物反相萃取到水相中；

洗涤所用的蒸馏水、浓度为0.5%磷酸二氢钠水溶液的量按体积计算分别为所用丁酯体积量的1/4；

（7）、可利霉素的干燥

          将步骤（6）所得的水相，用2M氢氧化钠调pH到4.5-5.0进行中和，然后通入空气吹掉水相中残留的丁酯，丁酯吹干净的判断标准为通入气体可将水相吹出大量泡泡，然后用2M氢氧化钠调节pH到8.5-9.0得到结晶液，结晶液抽滤后得到湿品，50-55℃真空干燥即得到可利霉素。

取步骤（5）所得的发酵液进行生物效价测定，最终所得的可利霉素的发酵液的生物效价为2100U/mL。

对比实施例1

发酵过程不加入补料培养基的一种可利霉素的发酵生产方法，包括如下步骤：

（1）、实验用菌种为WSJ-195甘油管；

（2）、配置斜面培养基500mL,摇瓶种子培养基1000mL,发酵罐培养基10L，培养基成分配制如下： 

①、斜面培养基（g/L）

葡萄糖            10

淀粉              20

黄豆饼粉          10

NaCl              4

CaCO₃                       5

琼脂              20

余量为去离子；

0.1 MPa，即121℃灭菌30 min备用；

②、种子培养基（g/L）

葡萄糖         10

淀粉           30

黄豆饼粉       20

NaCl            4

CaCO₃           5；

余量为去离子水；

0.1 MPa，即121℃灭菌30 min备用；

③、发酵培养基（g/L）

葡萄糖             20

淀粉               40

鱼粉               20

玉米浆             10

NH₄NO₃              6

CaCO₃               5

KH₂PO₄              0.5

MgSO₄·7H₂O         2

NaCl              l0

余量为自来水；

在发酵罐中消毒备用。

（3）、斜面种子培养

将茄子瓶中加入40mL斜面培养基，0.1 MPa，即121℃灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的甘油管中取2mL液体菌丝，在斜面培养基上划线接种，37℃培养13天，得斜面菌丝；

（4）、将步骤（3）所得的斜面菌丝，用消毒好的接种铲将1cm*2cm大小菌丝块接种装有50 mL种子培养基的500mL摇瓶中，共10瓶，置于摇床上控制转速为220r／min，温度为28℃培养48h，得摇瓶种子；

（5）、发酵罐培养

按4%接种量将步骤（4）所得的摇瓶种子400mL接种于装有10L发酵培养基的15L自动发酵罐中，控制转速为400r／min，温度为28℃自然pH培养96h，发酵结束；

（6）、产物的分离及纯化

取步骤（5）所得的发酵液，用聚合氯化铝凝絮发酵液中的蛋白质，以降低发酵液粘度，然后用板框过滤，将所得滤液用氢氧化钠调节pH值到8.5-9.0，然后用丁酯萃取；

萃取所用的丁酯量按所取的发酵液中含可利霉素总效价换算，即每10000U可利霉素添加1mL丁酯萃取；

萃取所得的酯相依次经蒸馏水、浓度为0.5%磷酸二氢钠水溶液依次洗涤后，再加入浓度为0.7%的磷酸二氢钠水溶液，其加入量按所取的发酵液中含可利霉素总效价计算，即每20000U可利霉素添加1mL 浓度为0.7%的磷酸二氢钠水溶液，然后用盐酸调节pH到2.0-2.5，将产物反相萃取到水相中；

洗涤所用的蒸馏水、浓度为0.5%磷酸二氢钠水溶液的量按体积计算分别为所用丁酯体积量的1/4；

（7）、可利霉素的干燥

          将步骤（6）所得的水相，用2M氢氧化钠调pH到4.5-5.0进行中和，然后通入空气吹掉水相中残留的丁酯，丁酯吹干净的判断标准为通入气体可将水相吹出大量泡泡，然后用2M氢氧化钠调节pH到8.5-9.0得到结晶液，结晶液抽滤后得到湿品，50-55℃真空干燥即得到可利霉素。

取步骤（5）所得的发酵液进行生物效价测定，最终所得的可利霉素的发酵液的生物效价为1806U/mL。

实施例2

一种高效价可利霉素的发酵生产方法，包括如下步骤：

（1）、实验用菌种为WSJ-195甘油管；

（2）、配置斜面培养基500mL,摇瓶种子培养基1000mL,发酵罐培养基10L,培养

  基成分配制如下： 

①、斜面培养基（g/L）

葡萄糖            10

淀粉              20

黄豆饼粉          10

NaCl              4

CaCO₃             5

琼脂             20

余量为去离子；

0.1 MPa（121℃）灭菌30 min备用；

②、种子培养基（g/L）

葡萄糖        10

淀粉          30

黄豆饼粉       20

NaCl           4

CaCO₃           5；

余量为去离子水；

0.1MPa，即121℃灭菌30min备用；

③、发酵培养基（g/L）

葡萄糖           20

淀粉             40

鱼粉             20

玉米浆           10

NH₄NO₃             6

CaCO₃             5

KH₂PO₄             0.5

MgSO₄·7H₂O        2

NaCl              l0

余量为自来水；

在发酵罐中消毒备用；

④、发酵过程所用的补料培养基

按其与发酵液重量比计算即发酵过程所用的补料培养基：发酵液为0.6：100；

所述的发酵过程所用的补料培养基为磷酸镁，称取磷酸镁60克，0.1 MPa，即121℃灭菌30min备用；

（3）、斜面种子培养

将茄子瓶中加入40 mL斜面培养基，0.1MPa，即121℃灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的甘油管中取2mL液体菌丝，在斜面培养基上划线接种，37℃培养13天，得斜面菌丝；

（4）、将步骤（3）所得的斜面菌丝，用消毒好的接种铲将1cm*2cm大小菌丝块接种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，共10瓶，置于摇床上控制转速为220r／min，温度为28℃培养48h，得摇瓶种子；

（5）、发酵罐培养

按4%接种量将步骤（4）所得的摇瓶种子400mL接种于装有10 L发酵培养基的15L自动发酵罐中，控制转速为600r／min，温度为28℃自然pH培养至26h后，一次性在无菌状态下加入补料培养基磷酸镁60克，继续控制转速为600r／min，温度为28℃再培养70h，发酵结束；

（6）、产物的分离及纯化

取步骤（5）所得的发酵液，用聚合氯化铝凝絮发酵液中的蛋白质，以降低发酵液粘度，然后用板框过滤，将所得滤液用氢氧化钠调节pH值到8.5-9.0，然后用丁酯萃取；

萃取所用的丁酯量按所取的发酵液中含可利霉素总效价换算，即每10000U可利霉素添加1mL丁酯萃取；

萃取所得的酯相依次经蒸馏水、浓度为0.5%磷酸二氢钠水溶液依次洗涤后，再加入浓度为0.7%的磷酸二氢钠水溶液，其加入量按所取的发酵液中含可利霉素总效价换算，即每20000U可利霉素添加1mL浓度为0.7%的磷酸二氢钠水溶液，然后用盐酸调节pH到2.0-2.5，将产物反相萃取到水相中；

洗涤所用的蒸馏水、0.5%磷酸二氢钠水溶液的量按体积计算分别为所用丁酯体积量的1/4；

（7）、可利霉素的干燥

          将步骤（6）所得的水相，用2M氢氧化钠调pH到4.5-5.0进行中和，然后通入空气吹掉水相中残留的丁酯，丁酯吹干净的判断标准为通入气体可将水相吹出大量泡泡，然后用2M氢氧化钠调节pH到8.5-9.0得到结晶液，结晶液抽滤后得到湿品，50-55℃真空干燥即得到可利霉素。

取步骤（5）所得的发酵液进行生物效价测定，最终所得的可利霉素的发酵液生物效价为2160U/mL。

通过上述的实施例1、对比实施例1和实施例2可以看出。在对比实施例1不加入补料培养基磷酸镁，可利霉素的发酵液的生物效价只有1806U/mL。而在实施例1中，由于在发酵24小时添加0.2%浓度磷酸镁的方法，可利霉素的发酵液的生物效价提高到2100U/mL。在实施例2中，由于在发酵24小时添加0.6%浓度磷酸镁的方法，可利霉素的发酵液的生物效价提高到2160 U/mL。由此表明本发明在发酵至20~26小时，一次性添加0.2%-0.6%的磷酸镁可以有效的提高可利霉素的发酵液的生物效价，增加产量。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所做的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。