一种检测土壤和沉积物中细菌数量的荧光显微计数方法

摘要

一种检测土壤和沉积物中细菌数量的荧光显微计数方法，属于环境微生物学领域。所述检测方法包括以下步骤：(1)配制样品稀释液和抗褪色剂；(2)将样品加入到样品稀释液中进行处理，制成样品计数液。取样品计数液到离心管中，加入10×的SYBR Green I荧光染料，避光染色后加入抗褪色剂，制成染色样品；(3)将洁净的盖玻片盖在干净的血球计数板计数室上，涡旋混匀染色样品，用移液器取染色样品，沿盖玻片边缘加样，使染色样品充满计数室。将加样的血球计数板静置5min，置荧光显微镜载物台上，以480nm光波激发，40倍物镜下观察，计数5个中方格中细菌颗粒的数量。最后按公式Y＝31.25×A×106计算出1g样品中细菌的数量，其中Y表示1g样品中细菌的数量，A表示一个中方格中细菌的平均数。该方法省时省力、成本低廉、抗褪色，能快速准确检测出泥土和沉积物中细菌的数量。

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物学领域，涉及一种环境总细菌数量的检测技术，具体涉及一种土 壤和沉积物中细菌总数荧光显微计数的样品前处理和荧光显微观察的试剂组合和检测方法。

背景技术

荧光染色直接计数法是最近30年来发展起来的用于细菌计数的新方法，它具有快速、准 确等特点，在水样、土壤及沉积物等环境样品中细菌数量的测定中有着广泛的应用。1973年 Francisco等针对天然水体中的细菌总数测定，首先建立了基于AO染色体系的荧光显微镜染 色计数法。1980年Porter等开始采用DAPI对细菌进行染色。Velji等在Porter等的基础上采 用超声波对海水、沉积物中的细菌以及海藻样品进行了前处理，再经DAPI染色法进行计数， 取得较好效果。Lunau等采用SYBR Green I荧光染料染色法测定了海水和沉积物中细菌数量， 并与DAPI、AO的染色计数对比，发现SYBR Green I与DNA结合的特异性更高，染色计数 的效果更好。

在传统膜法计数土壤或沉积物中细菌总数中，样品的前处理至关重要。由于土壤或沉积 物中包含大量与基质颗粒结合的细菌，分布极不均匀，且某些部分可能受到不透明的矿物微 粒对荧光染料吸收的影响使得荧光显微镜下的成像不明显，并且由于微生物细胞产生的胞外 聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)与微粒有着紧密的结合形成团聚体，因而可 能未被计数。为了获得准确测量结果，细菌与基质颗粒的分离成为膜法荧光显微镜观察测定 前处理的技术关键。这些分离方法主要分为物理法(包括离心沉降、振荡、超声波处理、稀 释等)、化学法(使用焦磷酸钠、表面活性剂、甲醇、等分散剂)和酶处理法(EPS酶)。 目前通行的做法是几种前处理方法联用，弥补单一处理方法的不足。但是总体而言，满足膜 法荧光显微计数的前处理方法比较费时费力，不适于大量样本的快速检测。如Amalfitano等 在分离河床沉积物中的细菌时采用了焦磷酸钠和聚山梨醇酯处理的化学法以及振荡和超声波 处理结合密度梯度离心的物理法处理样品，虽然最终约93％的细菌细胞被回收，但整个前处 理耗时2.5小时。

传统膜法检测中使用的滤膜分有机和无机滤膜两类。有机滤膜使用较早，相对低廉，但 滤膜要经过染色处理，比较费时，不适于快速检测，如李影等的专利“细菌活的非可培养状 态荧光显微镜观察与计数方法”中使用的滤膜要经过疏水处理和染色烘干后才能用于用于荧 光显微观察。现在常用的滤膜是氧化铝无机滤膜。无机滤膜无需染色，使用方便，但价格较 贵。此外，膜法的抗褪色处理是在膜上进行的，这一处理过程最主要的缺点是膜上抗褪色剂 附着量少，抗褪色效果较差，染料荧光淬灭较快，不利于观察计数。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的缺陷，提供一种省时省力、成本低廉、抗褪色效果更好，并 且能快速准确检测出泥土和沉积物中细菌数量的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

(1)缓冲液配制：称取0.446g焦磷酸钠和0.15g EDTA，溶于100ml无菌蒸馏水中，制成 样品稀释液；称取0.1g对苯二胺，溶于1ml PBS-甘油缓冲液中，制成抗褪色剂。

(2)样品前处理：称取0.1g泥样到无菌Eppendolf管中，加入1ml样品稀释液，涡旋振 荡5min，制成均匀悬浊液。取0.1ml悬浊液到0.9ml样品稀释液中，涡旋振荡5min，制成样 品计数液。取80μl样品计数液到200μl的离心管中，加入10μl 10×的SYBR Green I荧光染 料，避光染色1min后加入10μl抗褪色剂，制成染色样品。

(3)荧光显微计数：将洁净的盖玻片盖在干净的血球计数板计数室上，涡旋混匀染色样 品，用移液器取20μl染色样品，沿盖玻片边缘加样，使染色样品充满计数室。将加样的血球 计数板静置5min，置荧光显微镜载物台上，以480nm光波激发，40倍物镜下观察，计数5 个中方格中细菌颗粒的数量。最后按公式Y＝31.25×A×10⁶计算出1g样品中细菌的数量， 其中Y表示1g样品中细菌的数量，A表示一个中方格中细菌的平均数。

本发明的主要优点是：

1、本发明无需繁琐的样品前处理工作，大大缩短了样品前处理时间，提高了检测效率， 比传统荧光显微方法省时省力，能快速准确检测出泥土和沉积物中细菌的数量。

2、本发明在检测过程中无需使用昂贵的无机滤膜，降低了检测成本。

3、本发明改变了抗褪色处理方法，显著提高了抗褪色效果。

附图说明

图1：是染色后的沉积物细菌在血球计数板中通过40倍物镜观察的效果图。

图2：是血球计数板荧光显微计数法获得的池塘沉积物细菌总数。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明做进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1三种计数方法的比较

用LB液体培养基培养大肠杆菌DH5α(华中师范大学杨娇艳老师惠赠)至其600nm处 的吸光值为0.2～0.3时，用0.9％的生理盐水进行适当稀释。

平板计数法：选择合适的稀释梯度，吸取0.2毫升涂布平板，使每个平板上面生长的菌 落个数在30～300之间。37℃培养36h后计数平板上菌落数，根据菌落个数计算原始菌液的浓 度。每毫升菌液细菌数＝同一稀释度3次重复的菌落平均数×稀释倍数。

血球计数板荧光显微计数法：取稀释后的样品80μl于200μl的离心管中，添加10μl 10 ×的SYBR Green I荧光染料，染色1分钟后加入10μl抗褪色剂。将洁净的盖玻片盖在干净 的血球计数板计数室上，涡旋混匀染色样品，用移液器取20μl染色样品，沿盖玻片边缘加样， 使染色样品充满计数室。将加样的血球计数板静置5min，置荧光显微镜载物台上，以480nm 光波激发，40倍物镜下观察。计数时用25中方格的计数板，按对角线方位，取左上、左下、 右上、右下和中间的5个中方格进行计数。每毫升菌液细菌数按公式Y＝31.25×A×C×10⁴， 其中Y为每毫升菌液细菌数，A为每中方格细菌平均数，C为稀释倍数。

滤膜荧光显微计数法：取80μl适当稀释的样品，按照血球计数板方法中的描述对细菌 进行染色和抗褪色处理，然后用无菌生理盐水稀释至25ml，最后经0.22μm无机滤膜过滤。 将滤膜置载玻片上，荧光显微镜下以480nm光波激发，40倍物镜下观察，随机计数5个视野 的细菌颗粒数。每毫升菌液细菌数按公式Y＝1.25×P×K×C计算，其中Y为每毫升菌液细 菌数，P为每个视野中细菌的平均数，K为滤膜的视野数，C为稀释倍数。

利用上述3种方法对3个DH5α培养物进行了计数，所得结果见表1，结果证明血球计数板 荧光显微计数法检出率要高于其他2种方法。

表1.3种计数方法计数大肠杆菌DH5α结果比较

实施例2崇湖渔场池塘沉积物中细菌总数调查

2010年10月，从崇湖渔场21口池塘中心挖取表层沉积物200g，装入无菌自封袋，保温 箱冷藏运输回实验室。用1.5ml离心管称取不同沉积物样品0.1g，加入1ml焦磷酸钠-EDTA 缓冲液，涡旋振荡5min，取0.1ml悬浊液，加入到0.9ml焦磷酸钠-EDTA缓冲液中，再涡旋 振荡5min。取80μl稀释好的悬浊液到200μl的离心管中，加入10μl 10×的SYBR Green I染 料，避光染色1min，然后加入10μl对抗褪色剂。将洁净的盖玻片盖在干净的血球计数板计数 室上，涡旋混匀染色样品，用移液器取20μl染色样品，沿盖玻片边缘加样，使染色样品充满 计数室。将加样的血球计数板静置5min，置荧光显微镜载物台上，以480nm光波激发，40 倍物镜下观察计数。计数时用25中方格的计数板，按对角线方位，取左上、左下、右上、右 下和中间的5个中方格进行计数。每克样品细菌数按公式Y＝31.25×A×10⁶，其中Y为每克 样品细菌数，A为每中方格细菌平均数。染色后的沉积物细菌在血球计数板中通过40倍物镜 观察的效果如图1。计数结果如图2，24口鱼塘沉积物的细菌数量基本都在10⁸cell/g数量级， 但不同池塘间的数量还是存在显著差异。