土壤细菌的荧光染色计数方法研究及一株放线菌的分离鉴定

摘要

微生物资源非常丰富，为了持续开发微生物产物，造福人类，人们必须寻找更多类型的微生物，但是，分子生态学的研究发现，现在人们所培养的微生物仅为自然界存在微生物中的少数，约有1.0％，或更少，究其原因是在自然界中存在的微生物大多不能在常规的分离平板上生长，他们是活的，但是尚未培养的微生物.长久以来都是利用传统的微生物培养学方法对土壤微生物进行研究，利用荧光染料可直接对细胞进行荧光标记，并在荧光显微镜下直接计数。这类直接计数的方法被越来越多的运用于土壤等环境样品中的微生物数量检测和计数，对估算环境中的微生物数量有重要意义。
　　 为了研究土壤微生物中未培养微生物的情况，本文以南京土壤以及江西红壤为研究对象，采用羧基荧光素二醋酸酯（6-CFDA），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光计数，以及传统的稀释平板计数等方法研究了土壤的微生物数量、比较了短时间灭菌后土壤CFDA与平板计数结果的差异，并对CFDA在不同条件下的荧光染色效果进行研究。
　　 将GPF标记大肠杆菌梯度稀释，在荧光显微镜下进行荧光显微计数，以显微镜视野菌数为横坐标，平板计数结果为纵坐标，作荧光显微镜计数标准曲线。
　　 通过采用不同pH值的PBS缓冲液，测定CFDA标记DH5α的效果，结果表明，在pH值7.4-7.8间，染色效果较好，pH值7.6时染色效果最佳。CFDA对八株不同属的菌株进行染色，发现CFDA对革兰氏阳性菌的效果要好于革兰氏阴性菌。对BS169的染色效果最好。
　　 对DH5α进行CFDA染色计数，以及平板计数，结果表明，CFDA的计数结果为1ml DH5α样品中，菌体的数量为47.38×107，而DH5α的平板计数结果为42.25×107个。
　　 通过荧光染料CFDA与DAPI染色计数和平板计数比较了经过三种处理方式的不同的土地的微生物数量.结果表明：土壤中能被DAPI染色的微生物为CFDA计数结果的1.5倍左右，这说明土壤中有大量的微生物处于存活状态。但是同一种土壤样品的CFDA染色计数结果比传统的平板计数结果高约2个数量级，说明有大量的未培养微生物的存在。
　　 通过对土壤短时间高压蒸汽灭菌后，对其进行CFDA染色计数和平板计数。平板计数的结果显示没有活的微生物存在，但是通过CFDA染色计数发现，样品中里面仍然有大量的存活状态的微生物存在。平板计数法所采用培养基本身不能还原土壤微生物生存的真实环境，许多微生物能够在土壤中存活生长，不能在LB培养基上生长，形成菌落。
　　 利用细菌滤器模拟土壤环境，从土壤中分离到一株放线菌，并经过经典分类（基内菌丝无横隔、不断裂、气生菌丝多分枝；孢子短柱形、表面光滑，孢子丝直），化学分类（全细胞壁脂肪酸型），分子分类（16S rRNA序列为基础构建系统发育树中，BPS28菌株与20株链霉菌聚成一支，其中与沙链霉菌和三原链霉菌的的同源性达到99％，但是两个菌株在形态特征、生理生化特征上有较大的差异）的研究确定，菌株X1可能是Streptomyces中的一个新种或变种，并将其命名为Streptomyces sp.X1.

目录

文摘

英文文摘

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

一、未培养微生物研究进展

1、未培养微生物的概念

2、微生物不可培养的原因

3、未培养微生物研究方法进展

二、土壤微生物分析方法

1、土壤微生物的特点

2、微生物计数方法

3、荧光染色计数

三、放线菌分类学研究进展

1、放线菌的分类地位

2、放线菌经典分类

3、化学鉴定方法

4、分子生物学方法鉴定

参考文献

第二章 土壤微生物荧光染色计数

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 GPF标记大肠杆菌荧光显微镜计数标准曲线

2.2 PBS缓冲液pH值对CDFA染色效果的影响

2.3 CFDA标记不同菌株效果对比

2.4 DH5α的CFDA染色计数与平板计数结果

2.5 土壤微生物数量计数

2.6 高压蒸汽灭菌后土壤微生物数量计数

3 本章小结

参考文献

第三章 放线菌的分离与鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 分离结果

2.2 形态观察

2.3 培养特征观察

2.4 其他生理生化的鉴定

2.5 脂肪酸分析结果

2.6168 rRNA基因序列分析结果

2.7 菌株X1的系统发育树

2.8 放线菌X1与相邻的表型差异

3 放线菌初步鉴定结果

参考文献

全文总结

创新性

附录

致 谢