一株水霉拮抗放线菌QHV2、分离鉴定方法及应用

摘要

本发明公开了一株水霉拮抗放线菌QHV2、分离鉴定方法以及应用。该株水霉拮抗放线菌QHV2属链霉菌属，分类命名为山丘链霉菌

说明书

技术领域

本发明涉及一株水霉拮抗放线菌QHV2及其分离鉴定方法，以及应用。

背景技术

水霉(Saprolegnia)是水产养殖中引起寄生性疾病水霉病(Saprolegniasis)的主要病原菌。水霉对寄主无严格的选择性，是严重威胁淡水养殖鱼类的世界性病害，尤其是在粘性卵孵化后期，水霉甚至会感染受精并发育的鱼卵，菌丝缠绕使受精卵窒息死亡。在水霉病防治的生产实践中，曾经使用过多种药物防治，如水杨酸、“五倍子”、孔雀石绿等等，其中，最为有效的药物为孔雀石绿，但因其高残留和“三致”（致癌、致畸、致突）作用，目前已被国内外列为禁用渔药。

为寻找新的水霉防控有效药物，近年来国内外学者在筛选抗水霉化学药物及生物活性物质方面进行了积极的探索与研究，杨先乐等报道硫酸铜能够抑制水霉菌丝的生长，降低草鱼种的水霉感染率，Ali等报道表明硼酸可以作为水霉防控的候选药物，Singh等报道黑质芸苔（Brassica>）等中草药均有较高的体外抑水霉活性，Firouzbakhsh等报道采用益生菌Enterococcus>和益生素Fructooligosaccharide (FOS)）组合产生协同效应能显著提高鱼苗成活率与抗寄生水霉感染能力等。然而关于放线菌在水霉防控中的应用少见报道，本研究从珍珠健康养殖水体底泥中分离筛选抗菌活性稳定的水霉拮抗放线菌，并对其进行形态与分子生物学鉴定,以期为水霉病害生物防治药物的研发提供一些技术支持。

发明内容

为了克服目前有关放线菌在水霉防控中存在的空白问题，本发明的目的提供一株水霉拮抗放线菌QHV2及其分离鉴定方法，以及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

方案之一是提供一株水霉拮抗放线菌QHV2，该放线菌属链霉菌属，分类命名为山丘链霉菌Streptomyces>，保藏编号为CCTCC NO: M2016140，于2016年3月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国湖北省武汉市武汉大学。

所述水霉拮抗放线菌QHV2生物学特征如下：在高氏一号培养基上菌落圆形白色，扁平，直径5-9mm，产紫色色素，外缘有一环紫色环带，边缘较整齐但不光滑；而在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上表面呈白色，背面紫色，生长丰茂，气生菌丝发达，在显微镜下观察其孢子丝呈螺旋状卷曲，孢子呈圆形。

方案之二是提供水霉拮抗放线菌QHV2的鉴定方法，该方法以AF1/AR1为引物，PCR扩增QHV2菌株16 S rDNA基因，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90v稳压，30min，得到1435bp的扩增产物，PCR产物经纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果通过GenBank blast进行比对分析，并下载相似度在98%以上的序列，采用MEGA5.2软件，构建系统发育树；其中AF1的序列为agagtttgatcctggctcag，AR1的序列为acggctaccttgttacgactt。

1435bp的扩增物为16S rDNA序列PCR结果。

方案之三是提供水霉拮抗放线菌QHV2的分离方法，包括如下步骤：

（1）采集泥样：泥样采自珍珠蚌健康养殖基地的湖底底泥，将采集的泥样在室温下自然风干，然后用研钵将风干的泥样研碎，备用；

（2）配制培养基：a、高氏一号培养基：培养基成分为可溶性淀粉2g、KNO_{3>0.1g 、K2HPO40.05g>4}·>2O>4·>2O>

（3）放线菌的分离、纯化与保藏：取1g泥样加入10ml无菌水的三角瓶中，震荡30 min，采用梯度稀释平板涂布法将样品涂布至高氏一号双抗培养基的平板上，28℃恒温培养7-10天，选取菌落表面干燥的放线菌转接至高氏一号培养基的平板上，反复纯化2-3次后，挑取单菌落接种至高氏一号试管斜面，28℃恒温培养6-8天， 4℃冰箱保藏备用。

方案之四是提供水霉拮抗放线菌QHV2在水霉防控中的应用。

本发明的有益效果：

（1）本发明涉及的水霉拮抗放线菌QHV2是首次发现的能够对水霉病原菌生长有明显抑制作用的且抗菌活性稳定的水霉拮抗放线菌，填补了目前研究的空白；

（2）水霉拮抗放线菌QHV2的分离为构建QHV2菌株的系统发育树提供了基础保障。

附图说明

图1为放线菌QHV2对水霉的抑菌效果；其中A：黄颡鱼卵水霉病原菌对照；B：放线菌QHV2与黄颡鱼水霉病原菌对峙生长3天；C、放线菌QHV2与黄颡鱼水霉病原菌对峙生长5天。

图2为放线菌QHV2与水霉对峙3天、5天的抑菌率比较。

图3为采用试管斜面连续传代10代后对水霉的抑菌效果图，其中A:黄颡鱼卵水霉病原菌对照 ；B：放线菌QHV2与黄颡鱼水霉病原菌对峙生长3天；C：放线菌QHV2与黄颡鱼水霉病原菌对峙生长5天。

图4为不同发酵时间对放线菌QHV2产生水霉拮抗活性物质的影响；其中A: PDA平板上生长3天的黄颡鱼卵水霉病原菌对照；B:发酵3天放线菌QHV2与水霉对峙生长3天；C:发酵5天放线菌QHV2与水霉对峙生长3天；D:发酵7天放线菌QHV2与水霉对峙生长3天。

图5为水霉与不同发酵时间的放线菌QHV2对峙3天的抑菌率比较。

图6为放线菌QHV2抗水霉活性物质热稳定性检测结果，其中A:培养3天的黄颡鱼卵水霉病原菌对照；B:放线菌QHV2与水霉对峙生长3天；a:热处理后无菌上清液；b:热处理后菌液；c：热处理前菌液。

图7为放线菌QHV2的菌落形态显微镜观察结果。

图8为放线菌QHV2在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上生长的菌丝、孢子丝与孢子形态。

图9为放线菌QHV2的16S rDNA基因PCR扩增结果产物凝胶电泳检测结果，M：1 kbDNA Marker；1-3：退火温度分别为58℃、60℃、62℃时QHV2的16S rDNA基因PCR扩增产物。

图10为放线菌QHV2 16S rDNA基因序列的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常视为本领域的公知手段。且以下实施例仅为本发明优选的实施例之一，并非限制本发明的保护范围。

实施例一

（1）泥样的采集与处理：泥样采自湖南汨罗和千山红珍珠蚌健康养殖基地的湖底底泥，将采集的泥样在室温下自然风干，然后用研钵将风干的泥样研碎，备用。

（2）培养基配制

高氏一号培养基：成分有可溶性淀粉2g、KNO_{3>0.1g 、K2HPO4 0.05g>4}·>2O0.05g、>4·>2O>

高氏一号双抗培养基：在高氏一号培养基中加入萘啶酮酸（终浓度80-120 mg/L）和放线菌酮（终浓度30-60mg/L），用于放线菌的分离与筛选。

蔗糖查氏琼脂培养基：用于放线菌形态特征观察，蔗糖3 g，FeSO₄·>2O>2HPO₄>4·7H₂O>3>0.2>

葡萄糖酵母膏琼脂培养基：用于放线菌形态特征观察，葡萄糖1g,酵母膏1 g,K₂HPO₄>

克氏一号琼脂培养基：用于放线菌形态特征观察，葡萄糖2 g,KNO_{3>0.1 g,Nacl0.05 g,K2HPO4>0.1 g, FeSO4·>2O0.001>3}·7H₂O>3>

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：新鲜去皮马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂粉9 g，蒸馏水500 ml，马铃薯先加热煮沸，然后以纱布过滤去渣，加水补至原量并加入10 g琼脂粉，用于水霉的培养及保存。

（3）受试水霉菌：黄颡鱼卵水霉病原菌由上海海洋大学杨先乐教授实验室分离保藏。

（4）放线菌的分离、纯化和保藏：取1g泥样加入10 mL无菌水的三角瓶中，震荡30min，采用梯度稀释平板涂布法将样品涂布至高氏一号双抗培养基的平板，28℃恒温培养7-10天，选取菌落表面干燥的放线菌转接至高氏一号平板，反复纯化2-3次后，挑取单菌落接种至高氏一号试管斜面，28℃恒温培养7天左右，4℃冰箱保藏备用。

（5）抗菌活性测试及稳定性检测

以黄颡鱼卵水霉病原菌为受试菌，采用琼脂移块法与所分离放线菌做平板对峙生长实验，检测所分离放线菌的水霉拮抗活性，以抑菌率为考查指标检测放线菌的拮抗活性，抑菌率=（对照病原菌直径-处理后病原菌直径）/对照病原菌直径），结果见图1、图2。放线菌拮抗活性的稳定性采用平板连续传代10代后转接至高氏一号培养基发酵5天，移取琼脂块与靶标水霉菌进行对峙生长3天，抑制水霉生长的结果见图3。QHV2菌株在高氏一号平板上进行3天、5天、7天培养发酵，与黄颡鱼卵水霉病原菌对峙生长3天，探索发酵时间对产拮抗活性物质的影响，结果见图4、图5。活性物质的热稳定性检测，首先待测放线菌在高氏一号液体培养基发酵7天后，10000 r/min高速离心，分别取无菌上清和菌液80℃水浴1h备用，然后用无菌打孔器在PDA平板周围均匀的打6个孔，之后取一块水霉块接在PDA平板中央，然后向三对孔分别加入热处理的上清液、热处理的菌液，以放线菌发酵原液为对照，将平板置于28℃恒温培养3天、5天、7天后观察水霉菌丝生长抑制情况，结果如图6。

由图1可知，以黄颡鱼卵水霉病原菌作供试靶标菌，与放线菌QHV2对峙生长3-5天，水霉病原菌生长均明显受到抑制，这说明放线菌QHV2发酵后产生了一定的抗水霉活性物质。

由图2可知，比较不同对峙生长时间放线菌QHV2对水霉的抑菌率,对峙生长3天，抑菌率达到68%，对峙生长5d抑菌率为64%。

由图3可知，连续传代10代后，3-5天内放线菌 QHV2能明显抑制水霉菌丝生长，这说明放线菌QHV2产水霉拮抗活性物质的遗传稳定性较好，且放线菌QHV2的抑菌率仍旧高达67%。

由图4、图5可知，放线菌QHV2发酵5d抑制水霉效果最好，水霉菌丝与放线菌菌块之间的透明距离最大，随着发酵时间的延长其水霉拮抗活性显著降低，但发酵7天的放线菌也表现了较好的抗水霉活性，这说明发酵时间对放线菌QHV2水霉拮抗活性物质的生产有不同影响，其活性物质稳定性也存在较大的差异；发酵培养3天、5天、7天的放线菌QHV2与水霉对峙培养3天的抑菌率分别为67%、71%和56%。考虑到放线菌与水霉对峙生长时在琼脂块上还会继续生产活性物质，建议生产抗水霉活性物质的发酵时间为5-7天。

由图6可见，与对照相比，无论是QHV2菌株发酵液原液，还是热处理后的无菌上清液或菌液，对黄颡鱼卵水霉菌的抑菌效果均十分明显，抑菌率高达62%以上。这说明放线菌QHV2发酵产生的水霉拮抗活性物质是对热稳定的化合物。

（6）放线菌的形态及分子生物学鉴定

放线菌的形态观察采用Leica M205体式显微镜进行观察与显微拍摄，放线菌在高氏一号平板上培养7d后的菌落形态如图7所示；放线菌QHV2在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上的基内菌丝、气生菌丝及孢子丝孢子形态如图8所示；放线菌株QHV2在不同培养基上的培养特征如表一所示。分子鉴定采用PCR扩增技术,以热裂解法制备的细菌基因组DNA为模板，使用引物AF 1/ AR1扩增放线菌16S rDNA序列，PCR 反应体系(50 μL) 为：2X GC BufferI 25μl，dNTP 3μl，引物AF1 1.5μl, AR1 1.5μl, DNA模板1μl, La Taq酶：0.5μl，dd H₂O>

表一：放线菌QHV2在不同培养基上的培养特征：

由图7所知，QHV2菌落圆形白色，扁平，直径5-9mm，产紫色色素，外缘有一环紫色环带。

由图8和表一可知，放线菌QHV2在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上表面呈白色，背面紫色，生长丰茂，气生菌丝发达。在显微镜下观察其孢子丝呈螺旋状卷曲，孢子呈圆形。根据其在鉴定培养基上的形态特征(表一)，初步将放线菌QHV2归属于链霉菌属。

由图9可知，退火温度分别为58℃、60℃、62℃时，PCR都扩增出了1.5kb左右的特异性条带，且退火温度58℃时，扩增产物条带最亮，效果最好。 将上述PCR产物纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，在NCBI上经GenBank blast比对，选取 GenBank 中与QHV2菌株16S rDNA序列相似性 98%以上的菌株，利用MEGA5.2软件，构建QHV2菌株的系统发育树。

由图10可见：基于16S rDNA构建的系统发育树， QHV2与 Streptomyces>NR-041063聚成一簇，亲缘关系最近，由此鉴定放线菌QHV2为Streptomyces>。

[0001]

〈110〉湖南文理学院

〈120〉一株水霉拮抗放线菌QHV2、分离鉴定方法及应用

〈160〉1

〈210〉1

〈211〉1435

〈212〉DNA

〈213〉山丘链霉菌（Streptomyces>）

〈220〉

〈223〉16S rDNA

〈400〉1

GGCCGGTGGC GGGCTGCTTA CCATGCAAGT CGAACGATGA ACCACTTCGG TGGGGATTAG60

TGGCGAACGG GTGAGTAACA CGTGGGCAAT CTGCCCTGCA CTCTGGGACA AGCCCTGGAA 120

ACGGGGTCTA ATACCGGATA CTGATCCGTC TGGGCATCCA GACGGTTCGA AAGCTCCGGC 180

GGTGCAGGAT GAGCCCGCGG CCTATCAGCT TGTTGGTGAG GTAGTGGCTC ACCAAGGCGA 240

CGACGGGTAG CCGGCCTGAG AGGGCGACCG GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC 300

TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG CACAATGGGC GAAAGCCTGA TGCAGCGACG 360

CCGCGTGAGG GATGACGGCC TTCGGGTTGT AAACCTCTTT CAGCAGGGAA GAAGCGAAAG 420

TGACGGTACC TGCAGAAGAA GCGCCGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGTA 480

GGGCGCGAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGAGCT CGTAGGCGGC TTGTCACGTC 540

GGTTGTGAAA GCCCGGGGCT TAACCCCGGG TCTGCAGTCG ATACGGGCAG GCTAGAGTTC 600

GGTAGGGGAG ATCGGAATTC CTGGTGTAGC GGTGAAATGC GCAGATATCA GGAGGAACAC 660

CGGTGGCGAA GGCGGATCTC TGGGCCGATA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG CGTGGGGAGC 720

GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG CCGTAAACGG TGGGCACTAG GTGTGGGCAA 780

CATTCCACGT TGTCCGTGCC GCAGCTAACG CATTAAGTGC CCCGCCTGGG GAGTACGGCC 840

GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGCGGAG CATGTGGCTT 900

AATTCGACGC AACGCGAAGA ACCTTACCAA GGCTTGACAT ACACCGGAAA GCATTAGAGA 960

TAGTGCCCCC CTTGTGGTCG GTGTACAGGT GGTGCATGGC TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG 1020

AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGTC CCGTGTTGCC AGCAGGCCCT 1080

TGTGGTGCTG GGGACTCACG GGAGACCGCC GGGGTCAACT CGGAGGAAGG TGGGGACGAC 1140

GTCAAGTCAT CATGCCCCTT ATGTCTTGGG CTGCACACGT GCTACAATGG CCGGTACAAT 1200

GAGCTGCGAT ACCGCGAGGT GGAGCGAATC TCAAAAAGCC GGTCTCAGTT CGGATTGGGG 1260

TCTGCAACTC GACCCCATGA AGTCGGAGTC GCTAGTAATC GCAGATCAGC ATTGCTGCGG 1320

TGAATACGTT CCCGGGCCTT GTACACACCG CCCGTCACGT CACGAAAGTC GGTAACACCC 1380

GAAGCCGGTG GCCCAACCCC TTGTGGGAGG AGCTTCGAAA GGTGGAACCT GGGGG1435

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