含胆固醇基团的复合脂质及其中间体,制备方法与用途

摘要

本发明涉及一类结构新颖的含胆固醇基团的复合脂质及其中间体，涉及这些化合物的合成方法，以及其作为功能材料应用于药物载体及细胞膜结构与功能研究的用途。本发明所述的复合脂质所制备成的脂质体表面具有硅酸盐网络结构，从而使其稳定性大大提高，同时在所形成的脂质体双层膜结构中共价键连胆固醇基团，可进一步调节脂质体的稳定性和渗透性。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一类结构新颖的含胆固醇基团的 复合脂质及其中间体的制备方法，以及其作为功能材料应用于药物载体及细胞 膜结构与功能研究的用途。

技术背景

自20世纪70年代以来，脂质体由于具有制备简单，无毒性，无免疫原性 反应，在体内的可降解性，并且易于实现靶向性，因此被广泛地应用于药物载 体，它能提高和延长药物疗效，缓和毒性，避免耐药性和改变给药途径。但脂 质体的实际应用受到其稳定性的限制。具体表现在脂质体在储存过程中，由于 药物渗漏、粒子的聚集以及磷脂易于氧化水解等原因而被破坏；进入体内后， 由于血液中的白蛋白、调理素、抗体等各种物质的作用，脂质体可能发生破裂， 致使包封药物快速渗漏，很快被被一些酶类物质降解和巨噬细胞吞噬，不能到 达靶向组织而有效地发挥药物作用。因此，研制出稳定的脂质体是其作为药物 载体走向实用的前提，具有十分重要的意义。

胆固醇是细胞膜的重要组成成分之一，胆固醇的最重要的功能是调节细胞 膜的物理化学性质(Yeagle PL.Biochim Biophys Acta 1985，822(3-4)，267-87； Yeagle PL.In：Yeagle PL，editor.Biology of cholesterol.Boca Raton(FL，USA)： CRC Press，1988.p.121-146)。在细胞膜中，胆固醇与膜磷脂和鞘脂之间相互 作用从而影响它们的性质。增加脂质双层中胆固醇的含量将会扩大以及最终消 除脂质双层的凝胶液晶相转变的协调性(Lewis RNAH，McElhaney RN.In： Yegle PL，editor.The structure of biological membranes.Boca Raton(FL，USA)： CRC Press，1992.p.73-156；Maulik PR，Shipley GG.Biophys J 1996，70，2256 -2265)。在磷脂双层中胆固醇存在一种中间状态，当在相转变温度之上时降 低膜的流动性，而在相转变温度之下时增加膜的流动性(Demel RA，de Kruijff B. Biochim Biophys Acta 1976，457(2)，109-132)。在生物学相关的液晶状态，胆 固醇在膜中的排列相对有序，从而使得磷脂的烷基碳链的运动速率下降。在膜 中相对有序的状态将使膜更加致密，从而使膜的机械性能增加，渗透性能下降 (Lund-Katz S，Laboda HM，McLean LR，Phillips MC.Biochemistry 1988，27(9)， 3416-3423)。此外，生物体及传统脂质体中的胆固醇一般是游离状态，在实际 研究和应用过程中，游离胆固醇往往会快速地从生物膜或者脂质体中转移出 来(Kan，C.C.；Yan，J.；Bittman，R.Biochemistry 1992，31，1866-1874；Hamilton， J.A.Curr.Opin.Lipidol.2003，14，263-271)，从而使得脂质体的稳定性下降， 并导致内包药物的渗漏。

基于以上考虑，本发明人设计合成了一类新型复合脂质，其有两个方面的 特点，一方面是该类脂质分子结构中含有-Si(OEt)₃或-Si(OCH₃)₃基团，在水 溶液中能自组装形成脂质双层囊泡结构，而且在所形成的囊泡表面具有稳定的 Si-O-Si网络结构，共价键连覆盖于脂质体的表面，从而极大地增强其稳定 性和水溶性；另一方面是该类物质分子结构中共价键连胆固醇基团，可进一步 调节脂质双层的流动性和渗透性，同时可以防止胆固醇的流失，用于作为模型 研究细胞膜的结构与功能。

发明内容

本发明的目的是提供一类含胆固醇基团的复合脂质。

本发明的另一目的是提供上述含胆固醇基团的复合脂质及其中间体的制备 方法。本发明的目的还在于提供上述含胆固醇基团复合脂质的用途，该类物质 可作为作为功能材料应用于药物载体及细胞膜的结构与功能地研究。

本发明所述的含卟啉环功能基团的复合脂质的结构如下：

其中，R¹＝C_6～18烷基，R²＝C_6～18烷基，R¹，R²可以相同，也可以不同；R³＝OEt 或OCH₃；a＝2或3；b＝2或3，c＝1，且当b＝0时，c＝0。

本发明的制备路线如下所示：

其中，R¹＝C_6～18烷基，R²＝C_6～18烷基，R¹，R²可以相同，也可以不同；R³＝OEt 或OCH₃；a＝2或3；b＝2或3时，c＝1，且当b＝0时，c＝0。

化合物1的制备方法参照已申请专利(申请号：200910073423.5)

化合物2的制备方法参照文献(Carbohydrate Polymers 2006.65， 337-345；European Polymer Journal 2008，44，55-565)

本发明的方法具体描述如下：

(1)在极性有机溶剂中，化合物1，二环己基碳二酰亚胺(DCC)，4位二 甲胺基吡啶(DMAP)和化合物2在50-80℃反应12-36小时可得化合物3。化 合物1，二环己基碳二酰亚胺(DCC)，4位二甲胺基吡啶(DMAP)，化合物2 的摩尔比是1∶1-3∶0.8-1.2∶1-3，推荐的摩尔比例是1∶1.5-2∶0.9-1.1∶1.2-2.5。 所述的极性有机溶剂可以是四氢呋喃，丙酮，乙睛，二甲基甲酰胺等。

(2)在四氢呋喃与甲醇或者乙醇的混合溶剂中，化合物3，氢气与催化剂 在25-80℃反应12-48小时可得化合物4。化合物3与催化剂的质量比是1∶ 0.4-0.6，氢气压力为1.0-1.2MPa，所述的四氢呋喃与甲醇或者乙醇的混合溶 剂体积比是3-4∶1，催化剂是钯/碳或者氢氧化钯/碳。

(3)在非质子性有机溶剂中，化合物4，化合物5和二月桂酸二丁基锡在 40-70℃反应48-72小时，可得化合物6。化合物4，化合物5和二月桂酸二丁 基锡的摩尔比例1∶2-4∶0.2-0.8，推荐的摩尔比例是1∶2-2.5∶0.3-0.5。所述的非 质子性有机溶剂可以是苯，甲苯，二氯甲烷，氯仿等。

(4)在非质子性有机溶剂中，化合物4，DMAP，缚酸剂和化合物7在 25-70℃反应24-48小时，然后酸洗，再水洗，柱层析可得化合物8。化合物 4，DMAP，缚酸剂和化合物7的摩尔比例是1∶0.8-2∶3-8∶4-8，推荐的摩尔比例 是1∶1-1.5∶5-6∶6-7。所述的非质子性有机溶剂可以是苯，甲苯，二氯甲烷，氯 仿等，缚酸剂可以是三乙胺或者吡啶等。

(5)在非质子性有机溶剂中，化合物8，DCC和化合物9在25-40℃反应 24-36小时，可得化合物10。化合物8，DCC和化合物9的摩尔比例1∶1-2∶ 2.0-2.5。所述的非质子性有机溶剂可以是苯，甲苯，二氯甲烷，氯仿等。

本发明的方法所涉及的原料廉价，反应条件温和，具有较强的可操作性。 所合成的含胆固醇基团的新型复合脂质，可作为功能材料应用于药物载体及细 胞膜的结构与功能等方面地研究。

附图说明

图1是具体实施例6制备的脂质使用薄膜水化法所制备的复合脂质体的透 射电镜图；图2是具体实施例7对应的复合脂质体的稳定性实验，图2中(1) 表示复合脂质体在不同倍数表面活性剂TX-100存在时的粒径变化，图2中(2) 表示传统脂质DSPC制备的脂质体在不同倍数表面活性剂TX-100存在时的粒 径变化。图3是本发明最终复合脂质的化学结构式。

具体实施方式

通过以下具体实施方式将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。 以下实施例中R¹＝R²＝C₁₆烷基，a＝b＝2，R³＝OEt

实施例1

将1mmol的化合物1与2mmol的化合物2混合后，溶解于40mL的二 甲基甲酰胺中，加热至完全溶解后，再依次加入2mmol的DCC和1mmol的 DMAP，55℃温度下搅拌20小时，减压蒸干溶剂，所得粗产物经柱层析分离 提纯得化合物3，产率80％.

C₇₉H₁₃₃NO₉

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：0.85～2.92(m，15H，CH₃)，0.99(s，3H，CH₃)， 1.09～1.60(m，70H)，1.81～1.85(m，2H)，2.31(d，J＝7.6Hz，2H，CH₂)，2.60～ 2.68(m，8H，NCOCH₂CH₂CO)，3.22～3.28(m，4H，NCH₂)，3.87～4.51(m，8H， OCH₂)，4.44～4.45(m，1H，COOCHCH₂)，5.35(m，1H，C＝CCH)5.44(s，1H， PhCHOCH₂)，7.34～7.48(m，5H，Ph-H).质谱理论值：1240.9，实验值[M]⁺： 1241.5，[M+Na]⁺：1263.6.

实施例2

将2mmol(2.48g)的化合物3溶解于体积比为1∶3的甲醇与四氢呋喃的混 合溶剂中，加入到250mL的反应釜中，再加入1.24g的氢氧化钯/碳，50℃ 下剧烈搅拌48小时，减压蒸干溶剂，所得粗产物经柱层析分离提纯得化合物 4，产率52％.

C₇₂H₁₂₉NO₉

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：0.85～0.92(m，15H，CH₃)，1.01(s，3H，CH₃)， 1.08～1.60(m，70H)，1.81～1.85(m，2H)，2.31(d，J＝7.6Hz，2H，CH₂)，2.62～ 2.68(m，8H，COCH₂CH₂CO)，3.19～3.28(m，4H，NCH₂)，3.58(s，4H，HOOCH₂)， 4.16～4.19(m，4H，COOCH₂)，4.44～4.45(m，1H，COOCHCH₂)，5.36(d，J＝4 Hz，1H，C＝CH).质谱理论值：1152.80，实验值[M]⁺：1153.5，[M+Na]⁺：1175.5.

实施例3

在氮气保护下，将1mmol的化合物4溶解于40mL的二氯甲烷中，再依 次加入2.5mmol的化合物5和0.4mmol的催化剂二月桂酸二丁基锡，55℃下 搅拌48小时，旋干溶剂，所得粗产物经柱层析分离提纯得化合物6，产率53.2％.

C₉₂H₁₇₁N₃O₁₇Si₂

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：0.61(t，J＝8.4Hz，4H，SiCH₂CH₂CH₂NH)， 0.67(s，3H，CH₃)，0.86～1.10(m，18H，CH₃)，1.10～1.35(m，89H)，1.45～1.62(m， 12H)，1.81～2.30(m，5H)，2.60～2.65(m，8H，COCH₂CH₂CO)，3.20～3.36(m， 8H，SiCH₂CH₂CH₂NH和CH₃(CH₂)₁₃CH₂CH₂N)，3.68～3.83(m，12H， SiOCH₂CH₃)，4.00～4.13(m，8H，COOCH₂C)，4.61～4.64(m，1H，COOCHCH₂)， 5.38(d，J＝4Hz，1H，C＝CH).MS理论值：1647.52，实验值[M]⁺：1648.4.

实施例4

将1mmol的化合物4与6mmol的化合物7混合后，溶解于40mL的二 氯甲烷中，再依次加入1mmol的DMAP和6mmol的三乙胺，35℃温度下搅 拌48小时，减压蒸干溶剂，所得粗产物经柱层析分离提纯得化合物8，产率 82％.

C₈₀H₁₃₇NO₁₅

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：0.68(s，3H，CH₃)，0.87～0.99(m，18H，CH₃)， 1.07(s，6H，CH₃)，1.10～1.30(m，70H)，1.43～1.59(m，12H)，1.84～2.03(m，5H)， 2.32(d，J＝8Hz，2H，COOCHCH₂)，2.59～2.64(m，16H，COCH₂CH₂CO)，3.22～ 3.31(m，4H，NCH₂)，4.08～4.14(m，8H，COOCH₂C)，4.61～4.64(m，1H， COOCHCH₂)，5.37(d，J＝4Hz，1H，C＝CH).质谱理论值：1352.94，实验值 [M]⁺：1353.7，[M+Na]⁺：1375.8，[M+K]⁺：1391.7

实施例5

将1mmol的化合物8溶解于30mL的二氯甲烷中，再依次加入2.0mmol 的DCC和2.2mmol的化合物9，30℃下搅拌30小时，减压蒸干溶剂，所得 粗产物经柱层析分离提纯得化合物10，产率20％.

C₉₈H₁₇₉N₃O₁₉Si₂

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：0.60(t，J＝8.4Hz，4H，SiCH₂CH₂CH₂NH)，0.68(s， 3H，CH₃)，0.87～1.08(m，18H，CH₃)，1.08～1.31(m，89H)，1.43～1.59(m，12H)， 1.84～2.32(m，5H)，2.59～2.64(m，16H，COCH₂CH₂CO)，3.20～3.35(m，8H， SiCH₂CH₂CH₂NH和CH₃(CH₂)₁₃CH₂CH₂N)，3.69～3.84(m，12H，SiOCH₂CH₃)， 4.08～4.14(m，8H，COOCH₂C)，4.61～4.64(m，1H，COOCHCH₂)，5.38(d，J＝4 Hz，1H，C＝CH).MS理论值：1759.65，实验值[M]⁺：1760.5.

实施例6

将4mg的化合物10置于20mL的圆底烧瓶中，加入5mL氯仿溶解，然 后减压缓慢旋蒸使其在烧瓶内壁形成薄膜，35℃真空干燥箱中干燥以完全除去 氯仿；再往形成薄膜的烧瓶中加入一定体积的去离子水使最终溶液浓度为 1mmol/L。用探头式超声仪超声10min得到有一定浑浊度的溶液，室温下放 置12小时即可得到相应复合脂质体的水溶液。透射电镜如附图1所示。

实施例7

往实施例6所制备的复合脂质体溶液中加入表面活性剂Triton X-100 (TX-100)测试脂质体粒径的变化，并与DSPC制成的传统脂质体在同等条件下 粒径变化的比较来考察复合脂质体的稳定性，当加入至30倍量的TX-100水 溶液后，本发明复合脂质体的大小基本保持不变，而DSPC制成的传统脂质体 在加入5倍量的TX-100水溶液后，其粒径几乎降为0，说明其囊泡结构已被 破坏，从而证明本实施例的复合脂质体具有比传统脂质体更好的稳定性。具体 如附图2所示。