一种以幼穗为外植体的甜高粱高频再生体系建立的方法

摘要

本发明涉及一种以幼穗为外植体的甜高粱高频再生体系建立的方法，属于植物基因工程技术领域。选取甜高粱剑叶期2~3cm的幼穗，切成小段，接种于诱导培养基上培养，形成愈伤组织，继代培养，分化培养，进行根的诱导，移栽到温室或大田。本发明表明幼穗是建立甜高粱再生体系比较理想的一种外植体，可以用于进一步的转化研究。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种以幼穗为外植体的甜高粱高 频再生体系建立的方法。

背景技术

甜高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)又称糖高粱，是普通粒用高粱的一个变种，具 有抗旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱等特性，适宜在盐碱干旱等边际性土壤种植，同时， 甜高粱生长快、产量高，茎秆糖汁含量丰富，因此，被誉为“生物能源系统中最有力 竞争者”(Antonopoulou et al.2008；Carpita et al.2008)。甜高粱作为最具优势的再生能 源作物，已经引起广泛关注(Rooney 2004；Farrell，2006)。2009年，美国能源部联合 基因组研究所等机构完成了粒用高粱基因组测序和分析工作(Andrew et al.2009)， 这极大地推动了甜高粱分子遗传学的深入研究。目前，迫切需要通过转基因技术挖掘 和鉴定优异的抗逆境胁迫基因，进而应用于甜高粱品种的定向遗传改良。迄今为止， 甜高粱的遗传转化工作研究开展规模较小，技术发展缓慢。因此，建立高效稳定的甜 高粱再生体系用于遗传转化，已成为当前亟待解决的首要问题。

目前针对甜高粱组织培养的研究还很少。粒用高粱研究相对较早，为我们研究甜 高粱提供了依据和参考。1970年Masteller等以芽原基为外植体，诱导出愈伤组织，并 获得了再生植株，这是通过组织培养获得高粱再生植株的最早报道。此后，各国学者 相继开展了高粱组织培养的研究工作，现已从高粱幼胚(Dunstan et al.1979；Elkonin et  al.1995；Ma et al.1987；Sairam et al.2000；Zhao et al.2000；Hagio 2002)、成熟胚 (Mackinnon et al.1986；Cai et al.1987)、茎尖(Nahd et al.1995；Kishore et al.2006)、籽 粒(Yang et al.1990)和幼叶(Wernicke et al.1980；Sairam et al.1999)等不同外植体上均 获得了再生植株，幼穗具有分化率高、易获得再生植株的优点，被认为是高粱组培理 想的外植体(Brettell et al.1980；Wen et al.1991；Kaeppler et al.1997；Mani et al.2003； Jogeswar et al.2007)。

高粱的组织培养受基因型影响较大(Kaeppler et al.1997；Hagio 1994； Kuruvinashetti et al.1998)，缺少优良受体基因型是高粱遗传转化研究工作发展缓慢的 主要原因。获得愈伤诱导与分化再生能力强的基因型，是转化成功的先决条件。迄今 尚未见报道。

发明内容：

本发明提供一种以幼穗为外植体的甜高粱高频再生体系建立的方法，以用于甜高 粱的遗传转化研究。

本发明采取的技术方案是，包括如下顺序步骤：

1)选取甜高粱剑叶期2～3cm的幼穗，切成小段；

2)接种于诱导培养基上培养，形成愈伤组织，诱导培养基为：MS基本培养基 +2，4-D 3mg/L+KT(激动素)0.5mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8；

3)将诱导出的愈伤组织转移到继代培养基中培养，继代培养基为：MS基本培 养基+2，4-D 1.5mg/L+KT(激动素)0.25mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8；

4)继代培养30天后，将愈伤组织转接到分化培养基中培养至出苗，分化培养基 为：MS基本培养基+IAA(吲哚乙酸)1mg/L+KT(激动素)0.5mg/L+抗坏血酸10 mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8；

5)将再生苗转移至生根培养基中进行根的诱导，生根培养基为：1/2MS培养基+ 30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8；

6)移栽到温室或大田。

所述幼穗长度为2～3cm，在-4℃冰箱中放置2天，切成2-3mm长。

所述诱导培养基中培养条件为：于25±2℃暗培养30天。

所述继代培养为7天继代一次。

所述分化培养基中培养条件为：于25±2℃下16h/d光照培养。

所述再生苗长至约5cm高时，移至生根培养基中。

所述甜高粱品种为FETERITA NIDIANA、MN-2949、MN-2904、MN-3013和 SILVER TOP-1。

本发明利用甜高粱幼穗为外植体，采用特定的培养基成分对愈伤诱导，增殖，分 化，直至得到再生植株，本发明方法能得到较高的愈伤组织诱导率和分化率。实现结 果表明幼穗是建立甜高粱再生体系比较理想的一种外植体，可以用于进一步的转化研 究。

附图说明

图1：甜高粱幼穗再生体系建立示意图。

A：接种；B：幼穗膨大；C-F：不同基因型的愈伤组织形态；G：愈伤分化初期；H：小 苗生根过程；I：移栽成活的小苗。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

1)用于甜高粱再生体系建立的幼穗材料选择与准备

本发明选取甜高粱剑叶期2～3cm的幼穗，在-4℃冰箱中放置2天，取出后用75％乙 醇擦拭外植体，然后将外层苞叶剥去，在超净工作台中用手术刀剥取幼穗，将幼穗切 成2-3mm长；

2)接种于诱导培养基上，诱导培养基为：MS基本培养基+2，4-D 3mg/L+KT(激 动素)0.5mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8，25±2℃暗培养30天；

3)接种于诱导培养基上的幼穗5d后略膨大，7天左右穗轴基部或小花顶部开始形 成愈伤，接种30d～40d后大部分外植体都诱导出愈伤组织，去掉严重褐化的愈伤组织， 转移到继代培养基中，继代培养基为：MS基本培养基+2，4-D 1.5mg/L+KT(激动素) 0.25mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8，7天继代一次，培养条件为25±2℃暗培养；

4)继代培养30天后，将愈伤组织转接到分化培养基，分化培养基为：MS基本培 养基+IAA(吲哚乙酸)1mg/L+KT(激动素)0.5mg/L+抗坏血酸10mg/L+30g/L蔗糖 +8.0g/L琼脂pH5.8中，在25±2℃下16h/d光照培养，光照强度约为40-45μmol m^-2S^-1；

5)待再生苗长至约5cm高时，分开成单棵苗，转移至生根培养基，生根培养基 为：1/2MS培养基+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8中进行根的诱导，将已生根的幼苗从 培养基中移出，洗净粘在根系上的琼脂；

6)移载到温室或大田。

1、基因型对愈伤组织诱导的影响

供试的61种基因型材料，有49种基因型甜高粱被诱导出愈伤组织，不同基因型的 甜高粱诱导出的愈伤组织状态不同，有的愈伤组织呈白色或淡黄色，颗粒状，生长速 度较快；有的愈伤组织外表呈黄色，质地致密，生长速度快，一般不褐化；还有一种 愈伤组织外表呈浅黄色，紧密、分泌粘液，长势较弱，生长较慢。基因型不同，愈伤 组织诱导率不同，FETERITA NIDIANA、MN-2949、MN-29043个基因型出愈能力最 强，愈伤组织诱导率分别为96.7％、96.7％、100％。方差分析(表1)结果表明，基因 型间愈伤组织诱导频率差异达到极显著水平，由此可见，基因型对愈伤组织的诱导起 着重要作用。

表1愈伤组织诱导率的方差分析

2、基因型对分化再生的影响

对愈伤组织诱导成功的49个基因型甜高粱进行了分化和再生，结果表明，基因 型间愈伤组织分化率差异明显，其中MN-3013和SILVER TOP-1具有较高的分化能力， 分化率最高，达到87.5％和64.1％，方差分析(表2)结果表明，基因型间愈伤组织分 化率差异达到极显著水平，说明基因型是影响分化再生的一个重要因素。

表2愈伤组织分化率的方差分析

3、褐化现象

褐化现象贯穿着整个外植体成愈过程。成愈初期，外植体边缘就开始出现褐化 现象，愈伤组织逐渐形成大量深褐色或紫色色素的色素，并向培养基中扩散素，严重 的会造成愈伤组织坏死。在组培中应尽量避免出现褐化现象，为减少褐化，可通过缩 短继代时间来解决，本发明继代时间为7天，较好地控制了褐化现象，在继代过程中 将褐化愈伤组织部分切除，防止褐化蔓延；选择品种时，也应尽力避免使用褐化程度 严重的基因型。

结论：本发明表明不同基因型间愈伤组织诱导率及分化率有明显差异，综合出愈 率、分化能力、褐化程度等几方面的表现，认为基因型FETERITA NIDIANA、 MN-2949、MN-2904、MN-3013和SILVER TOP-1的幼穗对组织培养的反应相对较好， 可作为基因转化的理想受体材料。